17
BAB 4
HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN
Penandaan falerin dengan 131I adalah jenis penandaan tak seisotop. Falerin ditandai dengan menggunakan 131I yang tidak terdapat dalam struktur falerin. Proses yang terjadi dalam reaksi adalah reaksi oksidasi 131I2 pada larutan Na131I oleh oksidator ”Iodogen” (1,3,4,6– tetrakloro-3α,6α–difenilglikouril). Reaksi oksidasi terjadi pada dinding tabung reaksi yang mana ”Iodogen” akan mengoksidasi iodida menjadi ion iodinium (131I+). Kemudian ion 131I+ yang bersifat elektrofil akan menyerang atom C atau O tertentu dalam struktur falerin melalui reaksi substitusi aromatik elektrofilik.
O O OH HO O OH HO HO HO OCH3 O O OH HO O OH HO HO HO OCH3
Na
131I
131I
HI
Iodogen
+
Gambar 4.1 Reaksi iodinasi falerin
Pada percobaan telah dilakukan optimasi terhadap jumlah falerin dan jumlah “Iodogen” untuk menghasilkan hasil penandaan yang tinggi. Hasil penandaan optimal didapatkan pada jumlah falerin 20 µg , jumlah ”Iodogen” 100 µg, dan penambahan larutan Na131I dengan aktivitas 1 mCi. Pada reaksi iodidasi dilakukan penambahan 20µL larutan dapar fosfat pH 7,4 dengan molaritas 0,5 M untuk menurunkan pH yang tinggi yang terjadi saat reaksi iodinasi terjadi. Setelah 1 menit reaksi berlangsung, reaksi dihentikan dengan menambahkan larutan dapar fosfat 0,05 M pH 7,4. Hasil penandaan falerin dengan 131I mencapai 90,2% ± 2,8 dengan pengulangan 7 kali.
Kromatografi cair kinerja tinggi digunakan untuk mengetahui apakah reaksi iodinasi menghasilkan falerin bertanda 131I. Hasil penandaan falerin dengan 131I dibandingkan dengan hasil reaksi antara ”Iodogen” dengan larutan Na131I dan falerin tidak bertanda. Pada analisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi digunakan fasa gerak metanol 70%.
Kromatogram hasil pembacaan detektor ultraviolet menunjukkan pada hasil penandaan falerin dengan 131I terdapat 4 puncak pada waktu retensi 5,8 menit, 6,6 menit, 6,8 menit dan 8,8 menit. Sedangkan pada pembanding yang merupakan hasil reaksi antara ”Iodogen” dengan larutan Na131I terdapat tiga puncak yaitu pada waktu retensi 6 menit, 6,7 menit dan 7,1 menit. Falerin tidak bertanda memiliki puncak pada waktu retensi 6,8 menit.
Puncak radioaktivitas 131I yang terukur oleh detektor radioaktif muncul pada menit ke 4,6 sedangkan puncak radioaktivitas hasil reaksi iodogen dengan larutan Na131I pada menit ke 5,1 dan 7,4. Puncak radioaktivitas falerin bertanda yang diukur dengan ”gamma counter” muncul pada waktu retensi mendekati menit ke-9. Dengan demikian dapat diketahui bahwa falerin berhasil ditandai dengan adanya puncak radioaktivitas tersebut dan puncak hasil pembacaan detektor ultraviolet sinar tampak pada waktu retensi 8,8 menit .
Gambar 4.3 Kromatogram sampel falerin hasil penandaan
Gambar 4.4 Kromatogram sampel falerin hasil penandaan dan hasil reaksi ”Iodogen”
dengan Na131I
Perolehan hasil penandaan dianalisis dengan menggunakan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pelat silika gel GF254 dengan pengembang campuran kloroform - metanol (9:2). Setelah dikembangkan dalam bejana kromatografi dikeringkan kemudian dihitung cacahan radioaktivitasnya dengan menggunakan alat ”Single Channel Analyzer” dengan detektor NaI (TI). Pada kurva radioaktivitas dapat diketahui besar persentase perolehan hasil penandaan dan Rf hasil penandaan yang ditunjukkan dengan posisi terdapatnya puncak pada kurva. Rf falerin bertanda 131I dengan pengembang tersebut adalah 0,2 – 0,3.
Hasil reaksi iodinasi untuk menandai senyawa falerin dengan 131I dimurnikan dengan kromatografi eksklusi-ukuran menggunakan kolom sephadex G-25 dan eluen larutan basa fosfat pH 7,4 0,05 M. Kolom sephadex G-25 yang digunakan memiliki diameter 0,5 cm dengan tinggi kolom 2,5 cm. Kolom sephadex G-25 memiliki kemampuan untuk memisahkan senyawa berdasarkan besar berat molekul. Kolom ini stabil terhadap semua jenis larutan dapar yang umum digunakan.
Hasil reaksi iodinasi pasti masih mengandung 131I bebas yang memiliki radioaktivitas. Pemisahan dengan berdasarkan pada ukuran molekul ini memungkinkan falerin bertanda 131I terpisah dari 131I bebas karena berat molekulnya lebih besar. Setiap fraksi yang ditampung dari hasil elusi diukur cacahan radioaktivitasnya dengan alat ”Gamma Counter” dan dilihat profil kenaikan serta penurunan cacahan radioaktivitasnya sehingga fraksi yang berisi falerin bertanda 131I dapat dipisahkan dari 131 bebas yang berat molekulnya lebih kecil. Hasil pemurnian mencapai 96,0 ± 0,4% pada pengulangan sebanyak 3 kali.
Tabel 4.1. Nilai Penimbunan Falerin Bertanda dalam Berbagai Jaringan
Kelompok Mencit Nilai Penimbunan Relatif Falerin Bertanda
Darah Ginjal Usus Lambung Hati Jantung Paru- paru Limpa Paha kanan Paha kiri Sehat (1 jam) 8,3 ± 1,9 5,0 ± 4,3 2,7 ± 2,0 3,1 ± 1,6 2,1 ± 0,1 4,1 ± 2,8 5,7 ± 4,0 2,1 ± 1,5 1,0 ± 0,9 1,0 ± 0,8 Sehat (4jam) 11,6 ± 0,4 3,6 ± 0,8 2,8 ± 1,0 2,8 ± 0,4 2,5 ± 0,6 4,4 ±1,5 6,3 ± 2,4 1,8 ± 0,5 1,4 ±0,1 1,1 ± 0,1 Sehat (24 jam) 6,6 ± 0,9 1,8 ± 0,9 2,6 ± 2,2 1,3 ± 0,2 1,5 ± 0,3 2,6 ± 0,1 4,9 ± 0,9 1,0 ± 0,1 1,5 ± 0,4 1,3 ± 0,1 Radang (1 jam) 13,4 ± 8,4 4,1 ± 1,0 1,8 ± 0,7 3,1 ± 2,0 3,6 ± 1,5 5,0 ± 2,2 3,4 ± 0,7 1,6 ± 0,4 1,8 ± 1,0 1,1 ± 0,4 Radang (4jam) 8,4 ± 1,0 3,1 ± 0,3 2,1 ± 0,3 2,4 ± 0,1 2,1 ± 0,3 3,0 ± 1,5 3,0 ± 0,3 1,3 ± 0,2 1,8 ± 0,7 1,3 ± 0,4 Radang (24jam) 6,4 ± 0,7 1,9 ± 0,4 1,3 ± 0,3 1,3 ± 0,4 1,2 ± 0,3 1,8 ± 0,2 3,2 ± 1,7 0,9 ± 0,1 1,6 ± 0,2 1,2 ± 0,1 Radang,disuntik falerin (1 jam) 12,1 ± 3,8 4,9 ± 2,8 2,6 ± 1,1 2,3 ±1,2 2,7 ± 0,9 4,7 ± 2,3 5, 7 ±2,7 2,4 ± 1,2 1,6 ± 1,0 1,3 ± 0,9
Falerin bertanda 131I yang telah murni diuji biodistribusinya pada mencit sehat, mencit yang radang dan pada mencit yang radang kemudian disuntik dengan falerin tidak bertanda dengan dosis 22,5 mg/kg bb yang terbukti menghambat radang. Mencit dipilih sebagai hewan percobaan karena sampel yang akan diamati biodistribusinya sangat kecil sehingga diharapkan dengan menggunakan mencit cacahan biodistribusi dapat diamati dengan baik pada organ dan sampel darah hewan percobaan. Biodistribusi dilakukan pada tiga rentang waktu yaitu 1, 4 dan 24 jam untuk mengetahui pola perubahan biodistribusi falerin bertanda 131I dalam tubuh hewan percobaan.
0 2 4 6 8 10 12 14
darah ginjal usus lambung hati jantung paru-paru limpa paha
kanan paha kiri
pe ni m b un a n r e la ti f ph a le r in be r ta n da
sampel darah dan organ
1 jam 4 jam 24 jam
Gambar 4.5 Biodistribusi falerin bertanda pada mencit sehat 1, 4 dan 24 jam
setelah penyuntikan 0 2 4 6 8 10 12 14 16
darah ginjal usus lambung hati jantung paru-paru limpa paha kanan paha kiri
p enim buna n r el a ti f pha le ri n be rt a nda
sampel darah dan organ
1 jam 4 jam 24 jam
Gambar 4.6 Biodistribusi falerin bertanda pada mencit radang 1, 4 dan 24 jam
0 2 4 6 8 10 12 14 Da ra h Gi n ja l Us u s La m b u n g Ha ti Ja n tu n g Pa ru -pa ru Li m p a Pa h a ka n a n Pa h a k ir i
Gambar 4.7 Biodistribusi falerin bertanda pada mencit radang yang telah disuntik
falerin pada waktu satu jam setelah penyuntikan
Biodistribusi pada mencit yang telah diinduksi radang menunjukkan bahwa pada rentang waktu satu jam setelah penyuntikan nilai penimbunan relatif falerin bertanda pada paha kanan memiliki perbedaan yang bermakna (p<0,05) dengan paha kanan mencit sehat. Setelah 4 dan 24 jam penimbunan relatif falerin bertanda131I pada paha kanan mencit radang tidak memilki perbedaan yang bermakna dengan mencit sehat akan tetapi masih lebih besar daripada mencit sehat.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
1 jam 4 jam 24 jam
mencit normal mencit radang
Gambar 4.8 Penimbunan relatif falerin bertanda pada paha kanan mencit
Jika dibandingkan penimbunan relatif falerin bertanda 131I pada bagian paha kanan antara mencit radang dan mencit sehat, pada rentang waktu satu jam setelah penyuntikan terdapat
kenaikan mengalami kenaikan sebesar 69,2%. Pada waktu empat jam setelah penyuntikan nilai penimbunan relatif falerin bertanda 131I pada paha kanan mencit radang lebih besar 26,4% dibandingkan dengan penimbunan pada paha kanan mencit sehat. Sedangkan pada waktu 24 jam setelah penyuntikan, nilai penimbunan falerin bertanda 131I pada paha kanan mencit radang lebih besar 4,7% dibandingkan dengan penimbunan pada paha kanan mencit sehat pada waktu yang sama. Data tersebut menunjukkan bahwa terjadi penimbunan falerin bertanda 131I pada lokasi radang dan penimbunan tersebut dapat diamati dengan jelas pada biodistribusi pada waktu satu jam setelah penyuntikan. Falerin bertanda 131I digunakan sebagai perunut radioaktif untuk mengetahui dampak penandaan falerin dengan isotop radioaktif 131I pada lokasi radang. Oleh karena itu dilakukan pula pengamatan biodistribusi pada mencit yang telah diinduksi radang pada paha kanan kemudian disuntik falerin tidak bertanda dengan dosis yang terbukti menghambat radang 36,7% pada jam kedua dan 23,4% pada jam kelima. Pengamatan biodistribusi ini dilakukan pada waktu satu jam setelah penyuntikan karena pada waktu tersebut menunjukkan perbedaan yang bermakna antara penimbunan relatif falerin bertanda 131I pada paha kanan mencit radang dan pada paha kanan mencit sehat.
Hasil pengamatan biodistribusi pada paha kanan menunjukkan bahwa nilai penimbunan falerin bertanda 131I lebih besar 51,9% dibandingkan dengan nilai penimbunan pada paha kanan mencit sehat. Data ini menunjukkan bahwa masih terjadi penimbunan di lokasi radang pada hewan yang telah disuntik dengan falerin tidak bertanda pada dosis yang telah terbukti menghambat radang.
