39
Lampiran 1. Pembuatan Ekstrak Daun Nangka
(a) (b) (c)
(d) (e)
Keterangan :
(a) Daun nangka segar dicuci kemudian dikeringkan (kering udara). (b) Daun nangka kering dihaluskan dengan cara diblender.
(c) Daun nangka halus direndam dengan etanol selama 24 jam. Perendaman dilakukan 3 kali.
(d) Supernatan diambil, kemudian dievaporasi dengan vakum rotavapour pada suhu ± 600C dengan kecepatan 120 rpm.
40 Lampiran 2. Uji Fitokimia Daun Nangka
No. Zat yang Diuji Hasil Positif Gambar 1. Alkaloid Terbentuk endapan putih
2. Flavonoid Terbentuk warna kuning kemerahan sampai merah
3. Saponin Terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari 1 -10 cm, tidak hilang pada penambahan satu tetes HCl 2N
4. Tanin Terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman
41
Lampiran 3. Pembuataan Konsentrasi Ektrak Daun Nangka
Pembuatan konsetrasi ektrak daun nangka untuk uji zona hambat :
0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml larutan stok larutan stok larutan stok larutan stok 9
0,9 ml 0,9 ml 0,9 ml 0,9 ml akuades akuades akuades akuades
100.000 ppm 10.000 ppm 1000 ppm 100 ppm 10 ppm (0,1 g ektrak +
0,9 ml akuades)
Pembuatan konsetrasi ektrak daun nangka untuk uji zona LC50 : A = 600 ppm = 600 mg/L = 9 g/15 L
B = 300 ppm = 300 mg/L = 4,5 g/15 L C = 100 ppm = 100 mg/L = 0,15 g/15 L D = 50 ppm = 50 mg/L = 0,75 g/15 L
Pembuatan konsentrasi ekstrak daun nangka untuk penelitian utama B = 20 ppm = 20 mg/L = 0,3 g/15 L
C = 30 ppm = 30 mg/L = 0,45 g/15 L D = 40 ppm = 40 mg/L = 0,6 g/15 L E = 50 ppm = 50 mg/L = 0,75 g/15 L
42
Lampiran 4. Pembuatan Media Nutrien Agar (NA)
Bahan
NA (28 g/L) = 1,05 g Aquades = 37,5 ml
Cara Pembuatan Media NA:
Memasukan NA dan aquades kedalam labu Erlenmeyer
Memasukan magnetik stirer agar NA dan akuades homogen kemudian ditutup dengan alumunium foil.
Memanaskan larutan pada hotplates sampai mendidih.
Memasukan media kedalam autoclave pada suhu 1210C pada tekanan 1 atm selama 15 menit.
43
Lampiran 5. Pembuatan larutan bakteri kepadatan 108 cfu/mL dengan Spektrofotometer
Langkah-langkah pembuatan larutan bakteri kepadatan 108 cfu/mL dengan menggunakan spektrofotometer adalah sebagai berikut :
1. Isolasi Aeromonas hydrophila dari media NA dari tabung reaksi. Penumbuhannya di cawan petri yang sudah berisi media NA.
2. Inkubasi dalam inkubator pada suhu 270C selama 24 jam.
3. Pemanenan bakteri secara aseptik kedalam Falcon Centrifuge Tube yang telah berisi larutan NaCl fisiologis.
4. Penghitungan kepadatan dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm dan absorban (OD) 0,235
5. Apabilah belum diperoleh nilai OD tersebut, penambahan larutan NaCl fisiologis atau stok bakteri harus dilakukan hingga diperoleh absorban 0,235. 6. Dari pengukuran dapat diasumsikan bahwa OD 0,235 setara dengan
44 Lampiran 6. Gambar Uji Zona Hambat
Hasil Uji Zona Hambat
(a) (b) (c)
(d) (e) (f) Keterangan :
(a) Zona bening pada konsentrasi ekstrak 100.000 ppm (b) Zona bening pada konsentrasi ekstrak 10.000 ppm (c) Zona bening pada konsentrasi ekstrak 1000 ppm (d) Zona bening pada konsentrasi ekstrak 100 ppm (e) Zona bening pada konsentrasi ekstrak 10 ppm
(f) Zona bening pada konsentrasi 10.000 ppm 1000 ppm, 100 ppm (ampisilin/kontrol)
45
Lampiran 7. Uji LC50 Perendaman Ekstrak Daun Nangka
a. Prosedur
Rancangan percobaan untuk ekstrak herbal daun nangka pada benih ikan mas masing-masing 15 ekor menggunakan 4 perlakuan dengan 2 ulangan, lama waktu pemeliharaan selama 2 hari, dengan prosedur kerja:
Benih ikan mas direndam menggunakan ekstrak daun nangka dengan konsentrasi yang berbeda, diamati kematian ikan setiap jam untuk perhitungan menentukan LC50
b. Hasil Analisis Probit
Analisis nilai toksisitas (LC50) dengan menggunakan Software Epa Probhit Analysis Version 1,5
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5 LC50 daun nangka
ProportionObserved Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 50.0000 30 0 0.0000 0.0000 0.0889 100.0000 30 20 0.6667 0.6667 0.4857 300.0000 30 28 0.9333 0.9333 0.9795 600.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.9996 Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 10.058 Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 2.008218
Sigma = 0.229437
Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ---
Intercept -3.752818 3.349210 (-18.164467,10.658831) Slope 4.358500 1.689636 (-2.912002, 11.629004) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
46
Lampiran 7. (lanjutan) LC50 daun nangka
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point Exposure Concentration LC/EC 1.00 29.818 LC/EC 5.00 42.738 LC/EC 10.00 51.781 LC/EC 15.00 58.943 LC/EC 50.00 101.910 LC/EC 85.00 176.200 LC/EC 90.00 200.569 LC/EC 95.00 243.007 LC/EC 99.00 348.302
Analisis nilai toksisitas (LC50) dengan menggunakan Software Epa Probhit Analysis Version 1,5 untuk perendaman ekstrak daun nangka terhadap benih ikan mas adalah 101.910 ppm.
47 Lampiran 8. Tata Letak Perlakuan
Keterangan : A, B, C, D, dan E = Perlakuan 1, 2, 3 = Ulangan E1 A 1 D2 D1 B2 E2 B1 C2 C 1 A 2 A3 D3 E 3 B 3 C3
48
Lampiran 9. Kelangsungan Hidup Benih Ikan Mas Setelah Pengobatan
Perlakuan Ulangan Jumlah Benih yang Mati Pada Pengamatan Hari ke- Total (Ekor) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 A 1 3 4 2 3 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 14 2 3 2 2 3 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 13 3 2 3 3 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 14 B 1 3 2 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 2 2 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 3 2 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 C 1 1 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 2 3 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 3 3 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 D 1 3 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 2 2 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 3 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 E 1 2 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 2 3 2 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 3 2 2 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7
49
Lampiran 10. Analisis Data Kelangsungan Hidup Benih Ikan Mas Data Hasil Pengamatan Selama Pemeliharaan
Perlakuan Konsentrasi (ppm)
Jumlah ikan awal
Jumlah ikan
akhir Jumlah Ikan Hidup Selisih Mortalitas/ Perlakuan U1 U2 U3 U1 U2 U3 A 0 15 15 15 1 2 1 4 41 B 20 15 15 15 6 5 5 16 29 C 30 15 15 15 10 9 8 27 18 D 40 15 15 15 9 10 12 31 14 E 50 15 15 15 10 7 8 25 20 Jumlah 103 122
Data Hasil Persentase
Perlakuan Konsentrasi (ppm)
Kelangsungan Hidup (%)
Total Rata-rata Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3
A 0 6,67 13,33 6,67 26,67 8,89 B 20 40,00 33,33 33,33 106,67 35,56 C 30 66,67 60,00 53,33 180,00 60,00 D 40 60,00 66,67 80,00 206,67 68,89 E 50 66,67 46,67 53,33 166,67 55,56 Jumlah 686,67
Hasil Transformasi arcsin Perlakuan Konsentrasi
(ppm)
Kelangsungan Hidup (%)
Total Rata-rata Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3
A 0 3,82 7,66 3,82 15,31 5,10 B 20 23,58 19,47 19,47 62,52 20,84 C 30 41,81 36,87 32,23 110,91 36,97 D 40 36,87 41,81 53,13 131,81 43,94 E 50 41,81 27,82 32,23 101,86 33,95 Jumlah 422,41
50
Penghitungan Analisis Ragam 1. Faktor koreksi = = = 11895,28
2. Jumlah Kuadrat Total = ∑
=
(
(3,82)2 + (7,66)2 + (3,82)2 + ... + (32,23)2)
− 11895,28 = 3144,253. Jumlah Kuadrat Perlakuan = ∑ − FK
= ( ) 11895,28 = 2835,96
4. Jumlah Kuadrat Galat = JK Total – JK Perlakuan = 3144,25 − 2835,96 = 308,29
Tabel Analisi Ragam
SK DB JK KT Fhit F 0,05
Perlakuan 4 2835,96 708,99 23,00 3,48
Galat 10 308,29 30,83
Total 14 3144,25
Keterangan : *) Fhitung > Ftabel maka H0 ditolak, artinya dengan taraf 0,05 terdapat perbedaan pengaruh yang signifikan diantara perlakuan berbagai konsentrasi ekstrak daun nangka dalam pengobatan penyakit Aeromonas hydrophila terhadap persentase kelangsungan hidup benih ikan mas.
51
Uji Jarak Berganda Duncan
Sx =
√
LSR = SSR 5% x Sx
=
√
= 3,21
SSR 5% = Tabel lampiran 10 (Gasperz 1995) dengan db Galat (error df) = 10 untuk taraf nyata 0,05
2 3 4 5
SSR 5% 3,15 3,3 3,37 3,43
LSR 10,10 10,58 10,81 11,00
Tabel Perbandingan Antar Perlakuan Konsentrasi (ppm) Perlakuan Rata-rata Hasil Perbandingan LSR Notasi A B E C A 0 8,89 a B 20 35,56 26,67 10,10 b E 50 55,56 46,67 20,00 10,58 c C 30 60,00 51,11 24,44 4,44 10,81 c D 40 68,89 60,00 33,33 33,33 28,89 11,00 d
Keterangan : *)Tiap rata-rata perlakuan yang diikuti huruf yang sama memberikan pengaruh tidak berbeda nyata menurut uji Duncan pada taraf kepercayaan 95 %.
52
Lampiran 11. Data Kualitas Air Selama Penelitian
Perlakuan Ulangan
Awal Pengamatan Akhir pengamatan
Suhu (0C) pH DO (mg/L) Amonia (mg/L) Suhu (0C) pH DO (mg/L) Amonia (mg/L) A 1 24 7,28 4,6 0 24 7,56 4,7 0,50 2 24 7,51 4,6 0 24 7,74 4,5 0,25 3 24 7,50 4,5 0 24 7,72 4,3 0,25 B 1 24 7,27 4,2 0 24 7,7 4,5 0,25 2 24 7,14 4,1 0 24 7,64 4,4 0,25 3 24 7,26 4,8 0 24 7,55 4,8 0,50 C 1 24 7,42 4,3 0 24 7,65 4,8 0,25 2 24 7,41 4,8 0 24 7,72 4,7 0,50 3 24 7,40 4,6 0 24 7,7 4,4 0,50 D 1 24 7,32 4,5 0 24 7,59 4,3 0,25 2 24 7,28 4,4 0 24 7,63 4,7 0,25 3 24 7,10 4,7 0 24 7,74 4,5 0,50 E 1 24 7,32 4,5 0 24 7,67 4,1 0,50 2 24 7,17 4,6 0 24 7,71 4,7 0,25 3 24 7,16 4,7 0 24 7,58 4,3 0,50 Optimal 23-25* 6,5-8,5* 3,0-5,0* < 1** 23-25* 6,5-8,5* 3,0-5,0* < 1** Keterangan : * Tim Lentera (2002)
