PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(1)

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR (Impatiens balsamina L.) TERHADAP KULTUR SEL T47D

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh: Anni NIM : 058114005

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2009

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(2)

ii

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR (Impatiens balsamina L.) TERHADAP KULTUR SEL T47D

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh: Anni NIM : 058114005

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2009

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(3)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(4)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(5)

v

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Hati yang gembira adalah obat yang manjur,

tetapi semangat yang patah mengeringkan tulang”

(Amsal 17:22)

Perjalanan hidup ini tidak hanya berhenti setelah kita lulus,

tetapi perjalanan hidup ini baru akan dimulai.

Kehidupan bermasyarakat menjadi awal dari perjalanan hidup kita yang sebenarnya.

Maka dari itu kita harus siap untuk menjalaninya dengan penuh semangat dan hati

yang gembira, sehingga semua akan berjalan dengan lancar.

Kupersembahkan karya ini untuk:

Tuhan Yesus dan Bunda Maria yang selalu menyertaiku

Keluargaku (Papa, Mama, dan adek ‘Anton’) yang selalu mendukungku dalam doa

Kekasihku Hendra yang selalu mendukungku

Teman-teman dan Almamaterku

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(6)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(7)

vi PRAKATA

Puji dan Syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsamina L.) terhadap Kultur Sel T47D”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Penulisan skripsi ini tidak mungkin selesai tanpa adanya bimbingan, bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Rita Suhadi, M. Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing, yang selalu memberikan semangat, dukungan, bimbingan, dan saran selama penyusunan skripsi.

3. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan banyak memberikan masukan dan pengetahuan yang berkaitan dengan skripsi.

4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan masukan dan saran.

5. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam identifikasi dan determinasi tumbuhan.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(8)

vii

6. Drs. P. Sunu Hardiyanto S.G., M.Sc., yang telah memberikan masukan dan saran dalam pengolahan statistik.

7. Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama masa perkuliahan. 8. Mbak Yuli, mas Anief, dan segenap karyawan Laboratorium Hayati UGM

yang telah banyak membantu dalam penelitian skripsi.

9. Mama, Papa, dan Adek yang selalu bersedia mendengarkan keluh kesahku, memberi semangat dan mendoakanku.

10. Lise dan Dhita atas kerjasama dan diskusi selama penyusunan skripsi.

11. Dina dan Fetri atas dukungan, kebersamaan, dan kesediannya untuk berbagi suka dan duka.

12. Hendra, seseorang yang telah mengisi hatiku, mendukung dan selalu menemaniku dalam penyusunan skripsi.

13. Teman-teman angkatan 2005 dan temen-temen UKKA Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas kebersamaannya.

14. Semua pihak yang telah banyak memberikan dukungan dalam penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari tulisan ini masih banyak kekurangan dan kesalahan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran atas tulisan ini. Penulis berharap tulisan ini berguna untuk perkembangan ilmu kefarmasian.

Penulis

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(9)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(10)

ix

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

FBS : Fetal Bovine Serum

RPMI : Rosswell Park Memorial Institute

tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan leher

bengkok

96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat menanam sel pada uji sitotoksisitas

Hepes : 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid )

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(11)

x INTISARI

Banyak penelitian telah dilakukan untuk eksplorasi senyawa-senyawa baru sebagai antikanker, termasuk yang berasal dari bahan-bahan alam. Salah satu tanamannya adalah tanaman pacar air (Impatiens balsamina). Tanaman pacar air mengandung senyawa 2-methoxy-1,4- naphthoquinone dapat membunuh sel kanker hati. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek terhadap sel T47D. Sel T47D adalah sel kanker yang diambil pada jaringan payudara.

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memberikan perlakuan pada sel T47D menggunakan ekstrak kloroform daun pacar air dan sebagai pembanding adalah sel Vero. Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air terhadap sel T47D dan sel Vero menggunakan metode direct counting dengan larutan perwarna

trypan blue. Data yang diperoleh berupa persen kematian sel T47D dan sel Vero.

Analisis statistik efek sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air terhadap sel T47D dan sel Vero menggunakan uji z dan harga LC50 diperoleh dari analisis statistik probit.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun pacar air mengandung senyawa yang memilki efek sitotoksik terhadap sel T47D, dengan harga LC50 sebesar 33,8 µg/ml dan sel Vero, dengan LC50 sebesar 275,4 µg/ml.

Kata kunci: sitotoksisitas, daun pacar air, sel T47D, LC50

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(12)

xi ABSTRACT

Many researchs have been done to develop new active compounds as anticancer, including from natural substance. One of them is Impatiens balsamina plant. Impatiens balsamina contains 2-methoxy-1,4-naphthoquinone compound which capable to kill the liver cancer cell. The aim this research is to find out whether the chloroform extract of Impatiens balsamina leaves has cytotoxic effect to the T47D cell. The T47D cell is the cancer cell taken from breast tissue.

This research is a pure experimental research with random one way pattern design. The cytotoxic assay was carried out by applying chloroform extract of

Impatiens balsamina leaves, using Vero cell as normal control. The cell death data

were obtained by direct counting using trypan blue as indicator. Data used was percentage of the cell death. Data were analyzed statistically using Z-test and LC50 values.

The result show that chloroform extract from Impations balsamina leaves contain substances having cytotoxic effect to T47D cell with the LC50 value of 33,8 µg/ml and Vero cell with the LC50 value of 275,4 µg/ml.

Keyword: cytotoxixity, Impatiens balsamina leaves, T47D cell, LC50

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(13)

xii DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL………... . ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

HALAMAN PENGESAHAN ... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ... v

PRAKATA ... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... viii

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING ... ix

INTISARI ... x

ABSTRACT ... xi

DAFTAR ISI ... xii

DAFTAR TABEL ... xvi

DAFTAR GAMBAR ... xvii

DAFTAR LAMPIRAN ... xviii

BAB I PENGANTAR ... 1 A. Latar Belakang ... 1 B. Rumusan Masalah ... 2 C. Keaslian Penelitian ... 3 D. Manfaat Penelitian ... 3 E. Tujuan ... 3 1. Tujuan Umum ... 3 2. Tujuan Khusus ... 3

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(14)

xiii

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA……….. 4

A. Tanaman Pacar Air (Impatiens balsamina) ... 4

1. Klasifikasi Tanaman Pacar Air ... 4

2. Ketrangan Botani ... 4

3. Kandungan Kimia ... 4

4. Khasiat dan Penggunaan ... 4

B. Estraksi ... 5 1. Definisi Ekstrak ... 5 2. Cairan Pelarut ... 5 3. Ektraksi ... 5 4. Maserasi ... 6 C. Kanker ... 7 Kanker Payudara ... 7 D. Kultur Sel ... 7 1. Sel T47D ... 7 2. Sel Vero ... 8 E. Uji Sitotoksisitas ... 8

F. Haemocytometer Cell Count ... 8

G. Landasan Teori ... 9

H. Hipotesis ... 9

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 10

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 10

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ... 10

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(15)

xiv

1. Variabel Bebas ... 10

2. Variabel Tergantung ... 10

3. Variabel Pengacau Terkendali ... 10

4. Definisi Operasional ... 11

C. Alat dan Bahan ... 11

1. Alat ... 11

2. Bahan ... 11

D. Tata Cara Penelitian ... 12

1. Determinasi Tanaman ... 12

2. Pengumpulan dan Preparasi Daun Pacar Air ... 12

3. Ekstraksi ... 13

4. Sterilisasi Alat dan Bahan ... 13

5. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh ... 13

6. Propagasi dan Panen Sel T47D ... 14

7. Propagasi dan Panen Sel Vero ... 15

8. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air pada Sel T47D ... 15

E. Analisis Hasil ... 16

Metode Haemocytometer cell counting ... 16

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 17

A. Determinasi Tanaman ... 17

B. Sterilisasi Alat dan Bahan ... 17

C. Pengumpulan Daun Pacar Air ... 18

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(16)

xv

D. Pembuatan Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air ... 19

E. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh ... 20

F. Propagasi dan Panen Sel T47D ... 20

G. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air... ... 21

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 32

A. Kesimpulan ... 32

B. Saran ... 32

DAFTAR PUSTAKA ... 33

LAMPIRAN ... 35

BIOGRAFI PENULIS ... 58

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(17)

xvi

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I. Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati T47D dari Tiap Sumuran

dengan Metode Direct Counting ... 24

Tabel II. Tabel Persentase Kematian sel T47D ... 25 Tabel III. Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati Vero dari Tiap Sumuran

dengan Metode Direct Counting ... 28

Tabel IV. Tabel Persentase Kematian sel Vero ... 29 Tabel V. Hasil Perhitungan Sel T47D dengan Metode Direct Counting

Setelah Inkubasi 24 Jam ... 36 Tabel VI. Hasil Perhitungan Sel Vero dengan Metode Direct Counting

Setelah Inkubasi 24 Jam ... 36 Tabel VII. Data Log Konsentrasi, % Kematian dan Harga Probit Sel T47D

pada Replikasi I ... 46 Tabel VIII. Data Log Konsentrasi, % Kematian dan Harga Probit Sel T47D

pada Replikasi II ... 47 Tabel IX. Data Log Konsentrasi, % Kematian dan Harga Probit Sel T47D

pada replikasi III ... 48 Tabel X. Data Log Konsentrasi, % Kematian dan Harga Probit Sel Vero

pada Replikasi I ... 49 Tabel XI. Data Log Konsentrasi, % Kematian dan Harga Probit Sel Vero

pada Replikasi II ... 50 Tabel XII. Data Log Konsentrasi, % Kematian dan Harga Probit Sel Vero

pada Replikasi III ... 51

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(18)

xvii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Penampakan Morfologi Sel T47D ... 21 Gambar 2. Kultur Sel T47D dalam Haemocytometer Setelah Diberi Larutan

Trypan Blue ... 22 Gambar 3. Sel T47D yang Lisis pada Konsentrasi 225 µg/ml ... 23 Gambar 4. Kurva Konsentrasi Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air

vs Persen Kematian Sel T47D ... 25 Gambar 5. Kurva Log Konsentrasi vs Harga Probit pada Replikasi I

Sel T47D ... 26 Gambar 6. Kurva Log Konsentrasi vs Harga Probit pada Replikasi II

Sel T47D ... 27 Gambar 7. Kurva Log Konsentrasi vs Harga Probit pada Replikasi III

Sel T47D ... 27 Gambar 8. Kurva Konsentrasi Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air

vs Persen Kematian Sel Vero ... 29 Gambar 9. Kurva Log Konsentrasi vs Harga Probit pada Replikasi I

Sel Vero ... 30 Gambar 10. Kurva Log Konsentrasi vs Harga Probit pada Replikasi II

Sel Vero ... 30 Gambar 11. Kurva Log Konsentrasi vs Harga Probit pada Replikasi III

Sel Vero ... 31 Gambar 12. Tanaman Pacar Air ... 35

Gambar 13. Daun Pacar Air ... 35

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(19)

xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Tanaman Pacar Air dan Daun Pacar Air ... 35 Lampiran 2. Perhitungan Jumlah Kultur Sel yang Hidup ... 36 Lampiran 3. Perhitungan Persentase Kematian Kultur Sel T47D dan

Sel Vero ... 42 Lampiran 4. Perhitungan LC50 dengan Analisis Probit dan Uji Linearitas . 46

Lampiran 5. Analisis Statistik Uji Z pada Kelompok Kontrol

dan Perlakuan ... 53 Lampiran 6. Analisis Statistik Uji t Sampel Independen ... 56 Lampiran 7. Determinasi Tanaman Pacar Air ... 57

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(20)

1 BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kanker merupakan suatu penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan sel secara terus menerus, tidak terkendali, tidak terbatas dan dapat menyebabkan kematian. Kanker dapat menyerang pada semua lapisan masyarakat tanpa mengenal status sosial, umur, dan jenis kelamin. Anak-anak, remaja, dan orang dewasa tidak luput dari serangan kanker (Mardiana, 2008).

Kanker payudara merupakan kanker kedua setelah kanker cervix dan umum terjadi diantara wanita di Indonesia. Range frekuensi yang terjadi dari 17,7% di Malang hingga 27,9% di Makasar. Berdasarkan penelitian yang dilakukan beberapa tempat, wanita yang terkena kanker payudara banyak terdapat pada daerah Padang 25,8%, Yogyakarta 26,6%, dan Makasar 27,9%. Usia menjadi perhatian pada penyakit kanker payudara, banyak kasus yang didiagnosis sekitar kelompok usia 55-64 tahun. Secara histologi, banyak kasus didiagnosis seperti penerobosan jaringan karsinoma (88,3%) (Sarjadi, 2001).

Sebagian penderita, hingga saat ini memilih terapi alternatif untuk mendapatkan kesembuhan dari penyakitnya terutama kanker. Sehingga penelitian selanjutnya digunakan untuk menakar besarnya manfaat dan resiko terapi alternatif, sangat diperlukan makanan senyawa antioksidan serta vitamin dan preparat herbal yang dapat bekerja melawan kanker (Anonim, 2008). Hingga saat ini di Indonesia belum banyak dipublikasikan mengenai tanaman pacar air, karena tanaman ini

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(21)

2

dianggap sebagai tanaman liar/tanaman hias. Oleh sebab itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dan memperkuat penelitian sebelumnya.

Di Cina, dilakukan isolasi dan identifikasi suatu zat antitumor dari komponen daun pacar air (Impatiens balsamina) ditemukan senyawa aktif yaitu

2-methoxy-1,4-naphthoquinone. Senyawa tersebut dapat berefek antitumor pada hepatocellular carcinoma cell line HepG2 (Zhi-Shan, 2008). Dalam daun pacar air terdapat

senyawa-senyawa selain senyawa 2-methoxy-1,4-naphthoquinone yang memilki efek sitotoksik.

Berdasarkan penelitian Zhi-Shan, maka akan dilakukan penelitian yang digunakan untuk memperkuat penelitian tersebut. Penelitian ini akan dilakukan untuk mengetahui ketoksikan senyawa ekstrak kloroform dari tanaman pacar air terhadap sel T47D menggunakan metode direct counting. Hasil penelitian ini diharapkan menjadi dasar pengembangan tanaman pacar air yang mempunyai efek antikanker terutama pada sel T47D.

1. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang dari penelitian maka timbul permasalahan sebagai berikut:

a. Apakah ekstrak kloroform daun pacar air memberikan efek sitotoksik terhadap kultur sel T47D dan sel Vero?

b. Berapa besar harga LC50 yang ditunjukkan oleh ekstrak kloroform daun pacar air terhadap sel T47D dan sel Vero?

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(22)

3

2. Keaslian Penelitian

Sejauh yang diketahui penulis, belum pernah dilakukan penelitian tentang uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel T47D.

3. Manfaat Penelitian a. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat menambah informasi, melengkapi, memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat, penggunaan dan efek sitotoksik ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel T47D terutama dalam bidang farmasi.

b. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan khasiat daun pacar air sebagai antikanker dan dapat membantu dalam pengembangan dalam pengobatan alternatif yang berasal dari bahan alam.

B. Tujuan 1. Tujuan Umum

Untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air efek sitotoksik. 2. Tujuan Khusus

a. Untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel T47D dan sel Vero.

b. Untuk mengetahui harga LC50 dari ekstrak kloroform daun pacar air yang berpengaruh terhadap kultur sel T47D dan sel Vero.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(23)

4

4 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Pacar Air (Impatiens balsamina) 1. Keterangan Botani

Deskripsi tanaman: Tanaman berupa terna berbatang basah, bercabang, dengan daun tunggal, bentuk lanset dengan pinggir bergerigi warna hijau tanpa daun penumpu. Bunga berwarna cerah, ada beberapa macam warna, seperti merah,

orange, ungu, dan putih. Ada yang “engkel” dan ada yang “dobel”. Buahnya buah

kendaga, bila masak akan membuka menjadi bagian yang terpilin. Biasanya ditanam sebagai tanaman hias dengan tinggi 30-80 cm (Arisandi dan Andriani, 2006).

2. Kandungan Kimia

Kandungan kimia yang terdapat pada tanaman pacar air, antara lain biji: saponin dan fixed oil (terdiri dari γ-spinasterol, β-ergosterol, balsaminasterol,

parinaric acid, minyak menguap, quercetin, derivate kaempferol dan napthoquinone

(Dalimartha, 2003). Bunga: Anthocyanins, cyanidin, delphinidin, pelargonidin,

malvidin, kaempherol, quercetin, akar: cyaniding mono-glycoside (Arisandi dan

Andriani, 2006). Daun: 2-methoxy-1,4 napthoquinone (Tongnophua, 1991). 3. Khasiat dan Penggunaan

Kegunaan tanaman pacar air, antara lain: Peluruh haid (emenagog), mempermudah persalinan (perturifasien), kanker saluran pencernaan bagian atas, mengakhiri kehamilan (abortivum), pembengkakan akibat terpukul (haematom), rematik sendi, bisul (furunculolsis), gigitan ular, radang kulit (dermatitis), keputihan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(24)

5

(leucorrhoea), tulang patah/retak (fracture), mengurangi rasa nyeri (analgetik), antiinflamasi (Arisandi dan Andriani, 2006). Daun pacar air dapat berefek pada

hepatocellular carcinoma cell (Zhi-Shan, 2008).

B. Ekstraksi 1. Definisi Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 1995).

2. Cairan Pelarut

Cairan pelarut dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut yang baik (optimal) untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau senyawa aktif, dengan demikian senyawa tersebut dapat terpisah dari bahan dan senyawa kandungan lainnya, serta ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa kandungan yang diinginkan. Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari adalah selektivitas, kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan dan keamanan (Anonim, 2000).

3. Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan yang dapat larut hingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain. Senyawa aktif yang terdapat

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(25)

6

dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid, dan lain-lain. Maka dengan diketahuinya senyawa aktif yang dikandung simplisia akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat (Anonim, 2000).

4. Maserasi

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang ada di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak ke luar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain.

Keuntungan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana serta mudah diusahakan, sedangkan kekurangannya adalah pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna. Pada penyarian dengan cara maserasi, perlu dilakukan pengadukan. Pengadukan diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar butir serbuk simplisia, sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya derajat perbedaan konsentrasi yang sekecil-kecilnya antara larutan di dalam sel dengan larutan di luar sel (Anonim, 1986).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(26)

7

C. Kanker

Kanker adalah suatu penyakit sel dengan ciri gangguan atau kegagalan mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostasis lainnya pada organisme multiseluler (Meiyanto, 2003). Kanker merupakan kelompok penyakit dimana sel yang ada di dalam tubuh terjadi perubahan dan pertumbuhannya diluar kendali. Banyak tipe dari sel kanker berasal dari gumpalan dan massa yang dikenal sebagai tumor dan dinamakan sesuai dari bagian tubuh dimana tumor tersebut berasal (Williams, 2008).

Kanker Payudara

Kanker payudara adalah kanker yang banyak menyerang kaum wanita dan merupakan kanker penyebab kematian kedua di dunia. Kanker ini banyak menyerang wanita berumur antara 55-64 tahun. Kanker payudara dimulai dari jaringan payudara, dimana terbentuk pada kelenjar dari produksi susu, yang dikenal dengan lobules, dan saluran yang menghubungkan lobules hingga puting susu (Williams, 2008).

D. Kultur Sel 1. Sel T47D

Sel T47D merupakan continous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Continous cell line sering digunakan dalam penelitian kanker secara in vitro karena mudah penanganannya, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas yang tinggi serta mudah diganti dengan frozen stock jika terjadi kontaminasi. Sel T47D memiliki morfologi seperti sel epitel. Sel ini dikulturkan dalam media RPMI 1640 + 10% FBS

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(27)

8

2 mM L-Glutamin, diinkubasi dalam CO2 inkubator 5% dan suhu 37oC (Abcam, 2007).

2. Sel Vero

Sel Vero diindikasikan pertama kali pada tahun 1962 yang terdapat dalam ginjal kera dewasa (jenis African Green Monkey) yang sehat. Sel vero ini sering digunakan dalam produksi perkembangan vaksin. Sel Vero ini juga banyak digunakan dalam berbagai penelitian karena sebagai model atau contoh sel normal (Doyle and Griffiths, 2000).

E. Uji Sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas dilakukan secara in vitro untuk menentukan potensi sitotoksik senyawa-senyawa seperti produk-produk farmasi, kosmetik dan obat antikanker. Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti pengujian menggunakan hewan uji, mempunyai relevansi cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi ketoksikan suatu obat pada manusia (Doyle and Griffiths, 2000).

F. Haemocytometer Cell Count

Metode yang digunakan untuk menghitung jumlah sel yaitu dengan metode

direct counting dengan menggunakan haemocytometer. Haemocytometer adalah

suatu plat dengan dua bilik untuk meletakkan suspensi sel yang terbagi hingga sembilan kwadrat dengan dimensi 1x1 mm, dilengkapi penutup kaca yang mudah digeser dengan jarak ruang (kedalaman) sebesar 0,1 mm sehingga total volume yang berada dalam bilik 1 mm x 0,1 mm. Ketika suspensi sel dimasukkan ke bilik, suspensi tersebut dapat teramati dibawah kaca mikroskop dan dapat dihitung sel yang terpilih dari pengaturan kwadrat. Pada jumlah tersebut, sel yang dihitung per ml dari

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(28)

9

suspensi dapat dihitung. Zat warna yang digunakan seperti trypan blue untuk menjamin analisis kuantitas pada suatu kondisi tertentu. Zat warna trypan blue akan masuk menembus membran sel yang mati atau sel yang tidak hidup (Doyle and Griffiths, 2000).

G. Landasan Teori

Penelitian di Thailand yang melakukan determinasi pada daun pacar air dengan menggunakan metode HPLC menyebutkan bahwa di dalam ekstrak daun pacar air (Impatiens balsamina) mengandung 2-methoxy-1,4-naphthoquinone (Tongnophua, 1991). Di China, dilakukan isolasi dan identifikasi suatu zat antitumor dari komponen daun pacar air menemukan senyawa aktif yaitu

2-methoxy-1,4-naphthoquinone. Senyawa tersebut dapat berefek antitumor pada hepatocellular carcinoma cell line HepG2 (Zhi-Shan, 2008).

Berdasarkan penelitian tersebut diatas, maka akan dilakukan penelitian untuk memperkuat penelitian tersebut dengan mengekstraksi daun pacar air menggunakan pelarut kloroform untuk melihat ekstrak tersebut memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel T47D atau tidak.

H. Hipotesis

Ekstrak kloroform daun pacar air (Impatiens balsamina) dapat memberikan efek stitotoksik pada sel T47D.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(29)

10 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air (Impatiens

balsamina) terhadap kultur sel T47D merupakan penelitian eksperimental murni

dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel Bebas

Kadar ekstrak kloroform daun pacar air pada perlakuan yaitu:

a. Sel T47D sebesar 25 µg/ml, 50 µg/ml, 75 µg/ml, 100 µg/ml, 125 µg/ml, 150 µg/ml, 150 µg/ml, 175 µg/ml, 200 µg/ml, 225 µg/ml dan 250 µg/ml.

b. Sel Vero sebesar 100 µg/ml, 200 µg/ml, 300 µg/ml, 400 µg/ml, 500 µg/ml, 600 µg/ml, 700 µg/ml dan 800 µg/ml.

2. Variabel Tergantung

Persentase kematian sel T47D dan sel Vero. 3. Variabel Pengacau Terkendali

a. Medium tumbuh sel T47D dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640 dan medium sel Vero dengan medium M199.

b. Tempat pengambilan daun pacar air di tempat yang sama dan di waktu yang sama.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(30)

11

4. Definisi Operasional

a. Sitotoksisitas adalah sifat toksik atau beracun dari ekstrak daun pacar air terhadap sel T47D dan sel Vero yang ditandai dengan kematian sel.

b. Ekstrak daun pacar air adalah ektrak yang diperoleh dengan mengekstraksi daun pacar air dengan pelarut kloroform menggunakan metode maserasi. c. LC50 adalah konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air yang mampu

membunuh atau dapat menyebabkan kematian sel sejumlah 50% sel normal dan dinyatakan dalam µg/ml.

C. Alat dan Bahan 1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas, stamper, mortir, timbangan analitik, alumunium foil, magnetic stirrer, tabung conical (Nunc), autoklaf, tissue culture flask, swing rotor sentrifuge (PLC), inkubator (Memmert), mikropipet, lemari pendingin, cell counter (Nunc), 96-well plate (Nunc),

laminar air flow (Nuaire), mikroskop (Olympus IMT-2), haemocytometer (Nebauer),

alat serbuk ekstrak, tisu, sarung tangan, masker, waterbath, yellowtip, bluetip, tabung effendorf dan mikropore.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

a. Daun pacar air segar yang diambil di daerah Tajem, Sleman, Yogyakarta.

b. Kultur sel T47D yang diambil dari stok Laboratorium LPPT Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(31)

12

c. Kultur sel Vero yang diambil dari stok Laboratorium LPPT Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

d. Larutan penyari yang digunakan untuk preparasi ekstrak daun pacar air yaitu larutan kloroform.

e. Pereaksi-pereaksi yang digunakan untuk uji sitotosisitas:

1) Media pencuci: RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes.

2) Media penumbuh: RPMI 1640, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, Penisilin-Streptomisin 1% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco).

3) Bahan untuk melepas sel T47D: tripsin 0,25%. 4) DMSO 0,25%

5) Trypan blue 6) Aquabidest

D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi Tanaman

Determinasi daun pacar air dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acauan baku Backer dan Backuizen van den Brink.

2. Pengumpulan dan Preparasi Daun Pacar Air

Daun pacar air yang digunakan untuk penelitian diambil pada daerah Tajem, Sleman, Yogyakarta. Daun segar pacar air diseleksi, dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan hingga kandungan air hilang. Daun dijemur di bawah sinar matahari yang ditutupi oleh kain

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(32)

13

berwarna gelap supaya tidak merusak kandungan kimia dalam daun, kemudian dimasukkan ke dalam oven pada suhu 45oC. Setelah benar-benar kering, daun kemudian diserbuk menggunakan blender daun sampai halus dan diayak dengan ukuran 65 mesh.

3. Ekstraksi

Serbuk kering daun pacar air ditimbang, dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer dan ditambahkan dengan penyari, kemudian dilakukan pengadukan selama ± 3 x 24 jam. Penyari yang digunakan yaitu kloroform dan proses ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini adalah maserasi. Ekstrak yang didapat selanjutnya dilakukan penguapan dengan vacum rotary evaporator hingga didapat ekstrak kental. Ekstrak kental yang didapat dilanjutkan dengan penguapan di atas penangas air hingga kloroform menguap semua.

4. Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat-alat yang akan digunakan dibersihkan dengan pencucian, dikeringkan dan dilakukan pembungkusan dan kemudian dilakukan sterilisasi yang dimasukkan ke dalam autoklaf selama ± 15 menit pada suhu 121oC (Fardiaz,1992).

5. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh a. Pembuatan Medium Pencuci

RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natirum bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2 kemudian disterilkan dengan filter berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4oC (Freshney, 2000; Jacoby dan Pastan, 1979).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(33)

14

b. Pembuatan Medium Kultur (RPMI 1640-serum)

Untuk medium RPMI 1640-serum, ditambahkan FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, penisilin-streptomisin 1% dan fungison 0,5% dalam medium RPMI 1640 dan disterilkan dengan filter berdiameter 0,22 µm. Media disimpan dalam almari es pada suhu 4oC (Freshney, 2000; Jacoby dan Pastan, 1979).

6. Propagasi dan Panen sel T47D a. Propagasi Sel T47D

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel T47D dipindahkan dalam tabung conical steril yang sering berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pellet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney, 2000; Jacoby dan Pastan, 1979).

b. Panen Sel T47D

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(34)

15

tabung conical steril dan ditambahkan tripsin 0.25% sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pellet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan

haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh

konsentrasi sel sebesar 2,5x104/100 µl dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney, 2000; Jacoby dan Pastan, 1979).

7. Propagasi dan Panen sel Vero

Propagasi dan panen sel Vero menggunakan langkah yang sama dengan propagasi dan panen sel T47D. Perbedaannya hanya terletak pada medium yang digunakan. Sel Vero menggunakan medium M199.

8. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air pada Sel T47D

Pada uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel T47D dengan kepadatan 2x104_{/100 µl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang telah berisi} 100 µl ekstrak kloroform daun pacar air dengan kadar 25 µg/ml, 50 µg/ml, 75 µg/ml, 100 µg/ml, 125 µg/ml, 150 µg/ml, 150 µg/ml, 175 µg/ml, 200 µg/ml, 225 µg/ml, 250 µg/ml pada sumuran A1, B1 dan C1 pada kolom 1, kemudian pada sumuran A2, B2 dan C2 di kolom 2 ditambahkan 100 µl suspensi sel T47D pada sumuran yang telah berisi 100 µl ekstrak kloroform daun pacar air dengan kadar 25 µg/ml, 50 µg/ml, 75 µg/ml, 100 µg/ml, 125 µg/ml, 150 µg/ml, 150 µg/ml, 175 µg/ml, 200 µg/ml, 225 µg/ml, 250 µg/ml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640. Selanjutnya 96-well plate

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(35)

16

diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 (Freshney, 2000; Jacoby dan Pastan, 1979).

Pada akhir inkubasi, tiap sel disuspensi, kemudian ditambahkan 100 µl trypan

blue. Pipet 10 µl tiap sumuran dan masukkan dalam haemocytometer. Hitung jumlah

sel hidup dan mati pada tiap konsentrasi dan kontrol di bawah mikroskop. Sel yang hidup akan tampak relatif bulat transparan. Sedangkan sel yang mati akan tampak gelap dan tidak cemerlang (Doyle and Griffiths, 2000).

E. Analisis Hasil

Metode Haemocytometer cell counting

Analisis hasil dilakukan dengan perhitungan persentase kematian kultur sel T47D dan sel Vero dengan rumus :

% Kematian = A B A− x 100% Keterangan:

A : jumlah sel T47D dan sel Vero yang hidup pada sumuran kontrol media

B : jumlah sel T47D dan sel Vero yang hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan ekstrak kloroform daun pacar air

Untuk menghitung harga LC50 dilakukan perhitungan secara statistik menggunakan analisis probit sedangkan untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan pengolahan data menggunakan Z-test. Analisis yang digunakan untuk membandingkan LC50 antara sel T47D dengan sel Vero menggunakan uji t sampel independen.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(36)

17 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi dilakukan untuk memastikan kebenaran dan identitas mengenai tanaman yang akan digunakan untuk penelitian. Bahan yang akan digunakan dlam penelitian adalah daun pacar air. Determinasi tanaman dilakukan dengan menggunakan buku acuan Flora of Java (Backer dan Brink, 1965).

Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang akan digunakan sebagai bahan penelitian adalah benar

Impatiens balsamina (Lampiran 7).

B. Sterilisasi Alat dan Bahan

Sterilisasi bertujuan untuk menghilangkan mikroorganisme pada alat dan bahan yang akan digunakan. Sterilisasi merupakan langkah awal yang penting karena sel yang digunakan rentan terhadap kontaminan, apabila kontaminan tidak dikendalikan maka akan menyebabkan kematian sel sehingga kematian selnya bukan berasal dari senyawa uji yang diharapkan tetapi karena kontaminan.

Metode sterilisasi yang digunakan adalah uap panas bertekanan (pemanasan dengan tekanan/sterilisasi panas lembab). Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf, yang dimaksudkan untuk membunuh spora bakteri yang paling tahan panas. Sterilisasi menggunakan alat autoklaf dengan tekanan 1,2 atm pada suhu 121oC

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(37)

18

selama 20 menit, diharapkan pada tekanan, suhu dan waktu tersebut menjamin sudah tercapainya sterilisasi. Semakin besar tekanan yang digunakan maka makin tinggi temperatur sehingga waktu yang dibutuhkan semakin pendek (Ansel, 1989). Uap panas ini akan berpenetrasi ke dalam sel mikroorganisme, maka akan mengakibatkan kerusakan sel mikroorganisme dengan lebih cepat.

C. Pengumpulan Daun Pacar Air

Pada penelitian ini digunakan bagian daun tanaman pacar air. Tanaman pacar air diambil pada daerah Tajem, Sleman,Yogyakarta. Tidak semua daun digunakan, daun dipilih yang masih segar dan tidak berlubang (tidak berpenyakit), daun yang dipilih harus cukup tua sehingga akan diperoleh kandungan senyawa yang optimal. Daun yang telah dipetik, dikumpulkan kemudian dicuci dengan air mengalir satu per satu. Hal tersebut dilakukan dengan tujuan untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel pada permukaan.

Daun yang telah dicuci bersih kemudian dimasukkan ke dalam oven pada kisaran suhu 45oC bertujuan untuk pengeringan daun. Pengeringan ini dimaksudkan untuk mengurangi kadar air yang terdapat pada daun, karena air merupakan media yang cocok untuk terjadinya reaksi enzimatik dan mempermudah pertumbuhan mikroorganisme. Daun yang telah dikeringkan selanjutnya diserbuk dan diayak dengan ukuran serbuk 65 mesh, tujuannya untuk memperluas area kontak bahan yang akan disari dengan larutan penyari pada saat proses ekstraksi. Ukuran partikel tersebut tidak mengganggu dalam proses ekstraksi sehingga filtrat atau ekstrak tidak

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(38)

19

terdapat partikel-partikel yang tidak diharapkan atau selain

2-methoxy-1,4-naphthoquinone.

D. Pembuatan Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air

Ekstraksi yang dilakukan pada daun pacar air menggunakan metode maserasi. Pelarut yang digunakan pada proses ini adalah kloroform. Penggunaan pelarut kloroform ini didasarkan pada kelarutan senyawa yang akan dikeluarkan yaitu naftokuinon.

Proses maserasi ini dilakukan dengan perendaman dan pengadukan selama ± 3 x 24 jam dengan menggunakan wadah yang bertutup. Maserasi menggunakan wadah tertutup dengan tujuan untuk menghindarkan terjadinya penguapan larutan penyari dan pengaruh lingkungan, sedangkan pengadukan dimaksudkan untuk meratakan cairan penyari yang digunakan sehingga serbuk simplisia terbasahi sempurna oleh penyari. Pada saat perendaman, larutan penyari akan menembus dinding sel dan akan mengeluarkan zat aktif sesuai kelarutan larutan penyari. Adanya perbedaan konsentrasi di dalam sel dan di luar sel yang terjadi secara terus menerus maka zat aktif akan keluar dari sel.

Keuntungan metode maserasi adalah pengerjaannya mudah, peralatan yang digunakan sederhana dan tidak menggunakan panas sehingga tidak merusak senyawa yang tidak tahan panas. Kerugian metode maserasi adalah membutuhkan pelarut yang banyak dan membutuhkan waktu ± 3 hari untuk memaksimalkan penyarian.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(39)

20

E. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh

Medium yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari medium penumbuh dan medium pencuci sel. Pada medium penumbuh kultur sel T47D mengandung RPMI-1640, FBS (Foetal Bovine Serum) 10% digunakan sebagai suplemen pertumbuhan kultur sel T47D, penisilin-streptomisin 0,5% untuk menghindari kontaminasi oleh bakteri dan fungison 0,5% yang digunakan sebagai antifungi sehingga medium terbebas dari kontaminasi jamur. Medium penumbuh untuk kultur sel Vero adalah M199. Medium pencuci menggunakan RPMI-1640, natrium bikarbonat (sebagai buffer sintetik), Hepes (sebagai buffer organik), dan aquabidest.

F. Propagasi dan Panen Sel T47D

Sebelum sel digunakan untuk perlakuan perlu dibekukan dalam tangki nitrogen cair supaya kondisi sel tetap normal dan untuk menghindari terjadinya perubahan genetik sel. Medium dalam sel perlu diganti secara berkala ketika terjadi perubahan warna pada medium. Perubahan warna medium menandakan nutrisi telah habis dan perlu diganti dengan medium yang baru untuk memberi nutrisi kembali pada sel.

Sel T47D dipanen setelah berumur 7 hari, hingga mancapai keadaan konfluen dan jumlahnya cukup untuk digunakan pada penelitian. Sel T47D yang sudah dipanen dilakukan resuspensi menggunakan medium. Medium akan dibuang dan diberi tripsin untuk membantu sel terlepas dari dinding, kemudian dilakukan sentrifugasi untuk mengendapkan selnya dan supaya terpisah dari medium.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(40)

21

Sel T47D yang dipanen dan dihitung menggunakan haemocytometer dan dilihat penampakan morfologi sel T47D yaitu bentuk tidak beraturan (tidak berbentuk bulat hampir menyerupai daun), rapat (saling menempel), pada bagian tengah terlihat inti selnya.

Morfologi sel T47D dapat dilihat pada gambar berikut :

Gambar 1. Penampakan morfologi sel T47D

G. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air

Uji sitotoksisitas pada penelitian ini digunakan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel T47D. Uji sitotosisitas ini dilakukan secara in vitro karena digunakan sebagai pengganti pengujian pada hewan uji. Parameter yang digunakan untuk mengetahui berapa besar potensi ketoksikan suatu senyawa dapat dilihat dari LC50. Nilai LC50 merupakan konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air yang mampu menyebabkan kematian 50% populasi kultur sel T47D.

Pada penelitian ini tidak menggunakan metode MTT, sebab ekstrak yang didapat berwarna hijau kehitaman. Warna dari ekstrak yang hijau kehitaman tersebut dapat mempengaruhi dari serapan dan dapat mengacaukan absorbansi pada ELISA

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(41)

22

reader. Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah direct counting. Metode

ini menggunakan perhitungan sel secara langsung yang berada dibawah mikroskop dengan plat haemocytometer dengan bantuan alat hitung serta menambahkan reagen pewarna trypan blue pada kultur sel. Reagen pewarna trypan blue berfungsi untuk mewarnai sel sehingga dapat teramati sel yang hidup dan sel yang mati. Pada sel yang masih hidup akan terlihat bulat dan bersinar, sedangkan sel yang sudah mati akan terlihat bulatan lebih kecil dari sel hidup dan berwarna gelap karena trypan blue masuk dan menembus membran sel. Pemberian trypan blue perlu diperhatikan karena adanya pemaparan sel terhadap trypan blue yang terlalu lama akan menyebabkan kematian sel hidup, oleh sebab itu pemberian trypan blue dilakukan sesaat sebelum dilakukan perhitungan dan waktu perhitungan yang singkat (± 5 menit).

Gambar 2. Kultur Sel T47D dalam Haemocytometer Setelah diberi Larutan Trypan blue Ket.: i= sel hidup, ii= sel mati

Pada flask sumuran terdapat kontrol sel yang berisi sel T47D yang diberi medium RPMI 1640 dan perlakuan sel yang diberi ekstrak kloroform daun pacar air dengan konsentrasi 25 µg/ml, 50 µg/ml, 75 µg/ml, 100 µg/ml, 125 µg/ml, 150 µg/ml, 150 µg/ml, 175 µg/ml, 200 µg/ml, 225 µg/ml, 250 µg/ml. Kontrol digunakan untuk

i

ii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(42)

23

membandingkan hasil dengan yang diberi perlakuan ekstrak apakah terdapat perbedaan atau tidak. Pada konsentrasi 175 µg/ml, 200 µg/ml, 225 µg/ml, 250 µg/ml didapatkan kematian 100% (Tabel I). Hal ini disebabkan karena sel lisis, dapat pula disebabkan karena efek yang diberikan oleh senyawa sangat toksik sehingga menyebabkan kematian pada konsentrasi tinggi dan proses kematian alami sel (factor usia sel) (Gambar 3). Konsentrasi yang menyebabkan sel lisis tidak diikutkan dalam perhitungan persen kematian sel dan probit, karena dapat mengacaukan harga LC50 yang sebenarnya dimana LC50 0 tidak terlihat pada kurva log dosis vs harga probit yang berbentuk sigmoit. Kurva berbentuk sigmoit tersebut dapat dibaca pada kisaran 20% hingga 80%.

Gambar 3. Sel T47D yang lisis pada konsentrasi 225 µg/ml

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(43)

24

Data yang diperoleh pada jumlah pada sel T47D pada setiap sumuran dengan metode direct counting:

Tabel I. Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati T47D dari Tiap Sumuran dengan Metode Direct Counting

No. Konsentrasi (µg/ml)

Replikasi

I II III Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati

1. Kontrol 38.500 0 38.000 0 39.000 0 2. 25 20.000 10.000 20.000 9.500 20.000 9.500 3. 50 16.000 12.000 16.000 12.000 16.000 11.500 4. 75 13.000 13.000 13.000 13.000 13.000 13.000 5. 100 10.000 14.000 10.500 14.000 10.000 14.000 6. 125 8.000 15.500 8.000 15.500 8.000 15.000 7. 150 3.000 17.500 3.000 17.500 3.500 17.500 8. 175 0 20.500 0 20.500 0 20.500 9. 200 0 19.000 0 18.500 0 19.000 10. 225 0 18.000 0 18.000 0 18.000 11. 250 0 16.000 0 16.000 0 16.500

Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa semakin besar konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air dapat membunuh sel T47D yang dapat dilihat dari jumlah sel yang hidup dan yang mati, tetapi konsentrasi > 150 µg/ml dapat menyebabkan lisis pada sel (kematian sel 100%).

Kemudian akan dilakukan perhitungan persentase kematian, dengan mengurangkan jumlah sel T47D hidup kelompok kontrol dengan jumlah sel T47D kelompok perlakuan yang dibagi dengan jumlah sel T47D hidup kelompok kontrol (Tabel II).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(44)

kurv T47D ekstr kema air. antar deng menu 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 persentase kematian sel T47D (%) Konse (µg/ 25 50 75 10 12 15 Setelah va antara k D. Persen rak kloro atian yan Gamba Anal ra kontrol gan uji z. unjukkan 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0 ko Tab ntrasi /ml) 5 0 5 00 25 50 h didapat konsentras ntase kem oform dau ng berband r 4. Kurva lisis yang l dan yan Analisis z hitung 50 onsentras

bel II. Tab

Repli 48 58 66 74 79 92 t persenta si ekstrak matian sel un pacar ding luru a konsentr g digunak ng diberi p uji z ini > z tabe 0 si ekstrak ( bel Persen % ikasi I 8,05 8,44 6,23 4,03 9,22 2,21 se kemati k kloroform T47D me air (Gam s dengan rasi ekstra Kematia kan untuk perlakuan i menggun el (Lampir 100 k klorofor (ug/ml) ntase Kem % Kemat Rep 4 5 6 7 7 9 ian diatas m daun pa eningkat d mbar 4). konsentr ak klorofo n sel T47D k menget n dengan nakan α ran 5). H 150 rm daun p repli repli repli matian sel T tian sel T4 likasi II 47,37 57,89 65,79 72,37 78,95 92,10 s maka ak acar air vs dengan m Hal terse rasi ekstra orm daun D tahui apa ekstrak d = 0,05 m Hasil yang pacar air ikasi 1 ikasi 2 ikasi 3 T47D 47D Rep kan diliha s persenta meningkatn ebut berd ak klorofo pacar air akah terda dianalisis d memperole g diperoleh 200 r plikasi III 48,72 58,97 66,70 74,36 79,49 91,00 at dalam b ase kemati nya konse dasarkan p orm daun vs persen apat perb dengan st eh hasil d h menunj 25 I bentuk ian sel entrasi persen pacar bedaan tatistik dengan jukkan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(45)

terda kelom kultu deng mela uji li grafi repli linie apat perbe mpok per Untuk ur sel T47 gan analis akukan an inearitas y ik replika ikasi II lin r terhadap Gambar 5 0. 2. 4. 6. 8. Harga Probi t edaan yan rlakuan. mendapa 7D, maka sis regres nalisis reg yang dida asi I linie nier terhad p persama 5. Kurva L 00 00 00 00 00 0.00 ng signifi atkan nila a dilakuka si antara gresi maka apat menu er terhada dap persa aan y = 1,5 Log Konse ikan antar ai LC50 e an dengan log kons a perlu dil unjukkan ap persam amaan y = 54x + 2,6 entrasi vs 1.00 Log K ra jumlah ekstrak kl n analisis entrasi de lakukan u r hitung maan garis = 1,65x + 7 (Gamba Harga Pr 2 Konsentras rep Liny h sel hidu loroform probit. A engan har uji linearit > r tabel s y = 1,6 2,46 (Ga ar 7). obit pada 2.00 i plikasi 1 near (replika y= 1,63x + up kelomp daun pac Analisis p rga probi tas terlebi l, yang di 63x + 2,5 ambar 6) d Replikasi 3. asi 1)2,51 pok kontro

car air ter probit dila it. Untuk ih dahulu. itunjukkan 51 (Gamb dan replik i I Sel T47 00 26 ol dan rhadap akukan dapat . Hasil n pada bar 5), kasi III 7D

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(46)

Ekst yaitu pada Canc meng mem Gambar Gambar 7 Dari p trak kloro u pada se a sel Hela cer Instit ghasilkan miliki pote Harga Probit Harga Probi t 6. Kurva 7. Kurva l persamaan form daun el Siha de a dengan tute (NC n nilai LC ensi untuk 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 0.00 log konsen log konsen n regresi d n pacar a engan har n harga L CI) menya C50 ≤ 20 k dikemb ntrasi vs H ntrasi vs H diperoleh ir juga m rga LC50 LC50 sebe atakan b 0 µg/ml, bangkan s 1.00 Log 1.00 Log Harga pro Harga prob harga LC memberikan sebesar 5 sar 53,4 ahwa jik maka sua sebagai se g Konsentr r L g Konsentr re L obit pada r bit pada r C50 sel T4 n efek sit 52,7 µg/m µg/ml (N ka uji sit atu senya enyawa a 2.00 rasi eplikasi 2 Linear (repliy= 1,65x + 2.00 rasi eplikasi 3 Linear (repliy= 1,54x + replikasi I replikasi II 47D sebe totoksik te ml (Adhita Natalia, 2 totoksik awa terse antikanker ikasi 2)+ 2,46 kasi 3) + 2,67 II Sel T47D II Sel T47 sar 33,8 µ erhadap s ama, 2009 2009). Na suatu sen ebut diny r (Suffnes 3.00 3.00 27 D 7D µg/ml. el lain 9) dan asional nyawa atakan ss and

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(47)

28

Pezzuto,1991 cit., Rahmawati, Katno dan Triyono, 2008). Ekstrak kloroform daun pacar air memberikan efek sitotoksik pada kultur sel T47D, sel Siha dan sel Hela.

Untuk membuktikan apakah ekstrak kloroform aman terhadap sel normal maka dilakukan pula pengujian terhadap sel Vero. Dalam penelitian ini digunakan sel Vero yang diasumsikan sebagai sel normal yang dimaksudkan untuk membandingkan efek sitotoksik ekstrak kloroform daun pacar air dengan sel T47D. Kultur sel Vero menggunakan medium M199. Konsentrasi ekstrak yang digunakan pada sel Vero yaitu 100 µg/ml; 200 µg/ml; 300 µg/ml; 400 µg/ml; 500 µg/ml; 600 µg/ml; 700 µg/ml; dan 800 µg/ml.

Data yang diperoleh pada jumlah pada sel Vero pada setiap sumuran dengan metode direct counting:

Tabel III. Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati Vero dari Tiap Sumuran dengan Metode Direct Counting

No. Konsentrasi (µg /ml)

Replikasi

I II III

Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati 1 Kontrol 37.000 0 37.000 0 37.000 0 2 100 26.500 5.000 27.000 5.000 27.000 4.500 3 200 23.000 6.500 23.000 6.000 23.000 6.500 4 300 20.000 8.000 20.000 8.000 20.000 8.000 5 400 16.500 9.000 17.000 9.000 17.000 9.000 6 500 14.000 10.500 14.000 10.500 14.500 10.000 7 600 12.000 12.000 12.000 12.000 12.000 12.000 8 700 8.000 17.000 8.500 15.000 8.000 14.500 9 800 1.500 19.000 2.000 18.500 2.000 18.500

Kemudian akan dilakukan perhitungan persentase kematian, dengan mengurangkan jumlah sel Vero hidup kelompok kontrol dengan jumlah sel Vero kelompok perlakuan yang dibagi dengan jumlah sel Vero hidup kelompok kontrol (Tabel IV).

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(48)

kurv Vero ekstr kema air. Konsen (µg/ 10 20 30 40 50 60 70 80 Setelah va antara k o. Persent rak kloro atian yan Gamba persentase

kematian sel Vero (%)

Tabe ntrasi ml) 00 00 00 00 00 00 00 00 h didapat konsentras tase kema oform dau ng berband r 8. Kurva 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 0 ko el IV. Tab Repli 28 37 45 55 62 67 78 95 t persenta si ekstrak atian sel un pacar ding luru a konsentr 20 onsentras bel Persen % ikasi I 8,38 7,84 5,94 5,40 2,16 7,57 8,38 5,94 se kemati k kloroform Vero me air (Gam s dengan rasi ekstra kematia 00 4 si ekstrak ntase Kem % Kemat Rep 2 3 4 5 6 6 7 9 ian diatas m daun pa eningkat d mbar 8). konsentr ak klorofo n sel Vero 400 k klorofor (ug/ml) matian se tian sel V likasi II 27,03 37,84 45,94 54,05 62,16 67,57 77,03 94,59 s maka ak acar air vs dengan m Hal terse rasi ekstra orm daun o 600 rm daun p el Vero Vero Rep kan diliha s persenta meningkatn ebut berd ak klorofo pacar air 800 pacar air replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 plikasi III 27,03 37,84 45,94 54,05 60,81 67,57 78,38 94,59 at dalam b ase kemati nya konse dasarkan p orm daun vs persen 1000 r 1 2 3 29 I bentuk ian sel entrasi persen pacar

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(49)

kultu deng mela uji l grafi repli linie diper Untuk ur sel Ve gan analis akukan an inearitas ik replika ikasi II lin r terhadap roleh harg Gambar 9 Gambar Harga p robit Harga p robit mendapa ro, maka sis regres nalisis reg yang did asi I linie nier terhad p persam ga LC50 se 9. Kurva L 10. Kurva 0 2 4 6 8 0.0 Harga probit 0 2 4 6 8 0.0 Harga probit atkan nila dilakuka si antara gresi maka apat men er terhada dap persam maan y = 2 el Vero se Log Konse a log konse 0.5 0.5 ai LC50 e an dengan log kons a perlu dil nunjukkan ap persam maan y = 2,02x + 0 ebesar 275 entrasi vs entrasi vs 1.0 Lo 1.0 Lo ekstrak kl n analisis entrasi de lakukan u n r hitung maan garis 2,01x + 0 0.08 (Gam 5,4 µg/ml. Harga Pr Harga pr 1.5 og Konsent replikasi 1 Linear (rey= 2,05x 1.5 og Konsent replikas Linear (y= 2,0 loroform probit. A engan har uji linearit g > r tabe s y = 2,0 0,10 (Gam mbar 11). . robit pada robit pada 2.0 trasi 1 eplikasi 1)x + 0,02 2.0 trasi i 2 replikasi 2) 01x + 0,10 daun pac Analisis p rga probi tas terlebi el, yang d 05x + 0,0 mbar 10) d Dari per a Replikas replikasi 2.5 2.5

car air ter probit dila it. Untuk ih dahulu. ditunjukan 02 (Gamb dan replik rsamaan r i I Sel Ver II Sel Ver 3.0 3.0 30 rhadap akukan dapat . Hasil n pada bar 9), kasi III regresi ro ro

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(50)

G sel V kepe berm paca didap seba dikar seny seny prose mend Gambar 11 Untuk Vero me ercayaan makna anta Dari h ar memilik pat belum agai antika renakan s yawa tung yawa antik es fraksin dapat seny Harga p robit 1. Kurva L mengetah nggunaka 95%. Ha ara LC50 s hasil yang ki efek sito m dapat di anker seb senyawa u ggal. Terd kanker yan nasi. Pad yawa yan 0 2 4 6 8 0.0 Harga probit Log Konse hui apaka an analisi asil yang sel Vero d g diperole otoksik te ikatakan ab LC50 ≥ uji yang dapat kem ng dilakuk da proses ng lebih sp 0.5 entrasi vs ah terdapa is statistik diperoleh dan LC50 s eh, dapat erhadap se apakah ek ≥ 20 µg/m digunakan mungkina kan denga s fraksina pesifik. 1.0 Lo Harga Pr at perbeda k uji t s h menyat sel T47D ( dikatakan el T47D m kstrak klo ml (Nation n masih b an akan m an mempe asi ini ak 1.5 og Konsent replikasi 3 Linear (repy= 2,02x obit pada aan antara sampel in takan bah (Lampiran n bahwa maupun se oroform d nal Cance berupa ek memberik erkecil nil kan didap 2.0 trasi plikasi 3)+ 0,08 Replikasi LC50 sel ndependen hwa terd n 6). ekstrak k el Vero. H daun paca er Institut kstrak dan kan efek lai LC50 y patkan fr 2.5 i III Sel V T47D dan n dengan apat perb kloroform Harga LC5 ar air berp e). Hal te n belum b toksik s yaitu mela raksi dan 3.0 31 ero n LC50 n taraf bedaan m daun 0 yang potensi ersebut berupa ebagai akukan n akan

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(51)

32 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN

Ekstrak kloroform daun pacar air memiliki efek sitotoksik terhadap sel T47D dan sel Vero yang ditunjukkan dengan nilai LC50 yaitu 33,8 µg/ml untuk sel T47D dan 275,4 µg/ml untuk sel Vero.

B. SARAN

Saran yang dapat disampaikan dari penelitian ini perlu dilakukan isolasi senyawa yang berefek sitotoksik adalah melakukan proses fraksinasi untuk mendapatkan senyawa yang lebih spesifik sehingga dapat dikembangkan sebagai antikanker.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(52)

33

DAFTAR PUSTAKA

Abcam, 2007, T47D (Human ductal breast epithelial tumor cell line) Whole Cell

Lysate (ab14899) datasheet. www. abcam.com/index.html?datasheet=14899,

diakses Agustus 2008

Adhitama, W., 2009, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsamina L.) terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 10-16, Departemen Kesehatan Repubilik Indonesia, Jakarta

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi V, 7, Departemen Kesehatan Indonesia, Jakarta

Anonim, 2000, Parameter Standart Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan 1,1-61 Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 2008, Terapi Nutrisi dan Herbal untuk Kanker, http://rumahkanker.com/index.php?option=com_content&task=view&id=39 &Itemid=54, diakses tanggal 13 Juni 2008

Ansel, C. H., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, Edisi IV, 410-413, Penerbit UI, Jakarta

Arisandi, Y., dan Andriani, Y., 2006, Khasiat Berbagai Tanaman untuk Pengobatan, 310-312, Eska Media, Jakarta

Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I dan II, N. V. Noordhoff, Graningen.

Dalimartha, S., 2003, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, 84-86, Puspa Swara, Jakarta Doyle, A., & Griffiths, J. B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research,

49, 155, John Willey & Sons Inc., USA

Fardiaz, S., 1992, Mikrobiologi Pangan I, 130-131, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta

Freshney, R.I., 2000, Animal Cell Culture A Practical Approach, second edition, IRL Press Ltd, Washington DC.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(53)

34

Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII, Academia Press Inc, New York.

Natalia, L., 2009, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens

balsamina L.) terhadap Kultur Sel Hela, Skripsi, Fakultas Farmasi USD,

Yogyakarta

Mardiana, L., 2008, Seri Agrisehat: Kanker pada Wanita, 11-12, Penebar Swadaya, Jakarta

Meiyanto, E., Sismindari, Lany Candra dan Moordiani, 2003, Efek Antipoliferatif Ekstrak Etanol Daun dan Kulit Tanaman Cangkring (Erythrina furca lour.) terhadap Sel Hela, Majalah Farmasi Indonesia 14(3), 124 – 131, 2003, diakses tanggal 10 Juni 2008

Sarjadi dan Padmi T., 2001, Cancer Regristration In Indonesia, Asian Pasific Journal

of Cancer Prevention, Vol. 2, IACR Supplement

Rahmawati, N., Katno dan Triyono, A., 2008, Uji Efek Sitotoksik Ekstrak Etanolik Daun Bandotan (Ageratum conzoides L.) terhadap Sel HeLa, Jurnal

Tumbuhan Obat Indonesia, Vol.1, No.1, 51

Thongnopnua, P., Jutima, B., Vilai, C., dan Wallet, V., 1991, Quantitative

Determination og 2-methoxy-1,4-naphthoquinone in Plasma by High-Performance Liquid Chromathography,

http://www.journalarchive.jst.go.jp/jnlpdf.php?cdjournal=analsci1985&cdvol =7&noissue=Supple&startpage=1529&lang=en&from=jnlabstract, diakses tanggal 2 April 2009

Williams, St., A., 2008, Breast Cancer Facts and Figures 2007-2008, American Cancer Society, Inc, GA 30303-1002

Zhi-Shan, D., Fu-Sheng, J., Ni-Pi Chen, Gui-Yuan Lv dan Cheng-Gang Z., 2008, Isolation And Indentification of an Anti-Tumor Component from Leaves of Impatiens balsamina, Molecule, 13, 220-229

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(54)

35

LAMPIRAN

Lampiran 1. Tanaman Pacar Air dan Daun Pacar Air

Gambar 12. Tanaman Pacar Air

Gambar 13. Daun Pacar Air

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(55)

36

Lampiran 2. Perhitungan Jumlah kultur sel yang hidup

Tabel V. Hasil Perhitungan Sel T47D dengan Metode Direct Counting Setelah Inkubasi 24 Jam

No. Konsentrasi (µg/ml)

Replikasi

I II III Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati

1. Kontrol 77 0 76 0 78 0 2. 25 40 20 40 19 40 19 3. 50 32 24 32 24 32 23 4. 75 26 26 26 26 26 26 5. 100 20 28 21 28 20 28 6. 125 16 31 16 31 16 30 7. 150 6 35 6 35 7 35 8. 175 0 41 0 41 0 41 9. 200 0 38 0 37 0 38 10. 225 0 36 0 36 0 36 11. 250 0 32 0 32 0 33 Tabel VI. Hasil Perhitungan Sel Vero dengan Metode Direct Counting Setelah

Inkubasi 24 Jam No. Konsentras i (µg /ml) Replikasi I II III

Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati

1 kontrol 74 0 74 0 74 0 2 100 53 10 54 10 54 9 3 200 46 13 46 12 46 3 4 300 40 16 40 16 40 6 5 400 33 18 34 18 34 16 6 500 28 21 28 21 29 20 7 600 24 24 24 24 24 24 8 700 16 31 17 30 16 29 9 800 3 38 4 37 4 37

Perhitungan jumlah sel tiap sumuran dengan rumus: N : 4 = N x 10 x 200

Keterangan :

N = jumlah sel hasil perhitungan langsung pada haemocytometer 4 = jumlah bilik dalam haemocytometer

10 = jumlah volume yang masuk dalam bilik haemocytometer (10 µl) 200 = jumlah volume total (200 µl)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(56)

37

Perhitungan jumlah sel T47D yang hidup pada setiap sumuran: 1. Kontrol Replikasi I = 10 200 4 77 x x = 38.500 Replikasi II = 10 200 4 76 x x = 38.500 Replikasi III = 10 200 4 78 x x = 39.000 2. Konsentrasi 25 µg/ml Replikasi I = 10 200 4 40 x x = 20.000 Replikasi II = 10 200 4 40 x x = 20.000 Replikasi III = 10 200 4 40 x x = 20.000 3. Konsentrasi 50 µg/ml Replikasi I = 10 200 4 32 x x = 16.000 Replikasi II = 10 200 4 32 x x = 16.000 Replikasi III = 10 200 4 32 x x = 16.000 4. Konsentrasi 75 µg/ml Replikasi I = 10 200 4 26 x x =13.000 Replikasi II = 10 200 4 26 x x =13.000 Replikasi III = 10 200 4 26 x x =13.000 5. Konsentrasi 100 µg/ml Replikasi I = 10 200 4 20 x x = 10.000

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

(57)

38 Replikasi II = 10 200 4 21 x x = 10.500 Replikasi III = 10 200 4 20 x x = 10.000 6. Konsentrasi 125 µg/ml Replikasi I = 10 200 4 16 x x = 8.000 Replikasi II = 10 200 4 16 x x = 8.000 Replikasi III = 10 200 4 16 x x = 8.000 7. Konsentrasi 150 µg/ml Replikasi I = 10 200 4 6 x x = 3.000 Replikasi II = 10 200 4 6 x x = 3.000 Replikasi III = 10 200 4 7 x x = 3.500 8. Konsentrasi 175 µg/ml Replikasi I = 10 200 4 0 x x = 0 Replikasi II = 10 200 4 0 x x = 0 Replikasi III = 10 200 4 0 x x = 0 9. Konsentrasi 200 µg/ml Replikasi I = 10 200 4 0 x x = 0 Replikasi II = 10 200 4 0 x x = 0 Replikasi III = 10 200 4 0 x x = 0