Virologi-Isolasi & Pembiakan Virus

ISOLASI & PEMBIAKAN

ISOLASI & PEMBIAKAN

VIRUS

VIRUS

Oleh:

Oleh:

Drh

Is

Isol

olas

asii vi

viru

russ

 DDiiaaggnnoossaa kklliinniiss ppeennggaammbbiillaann ssppeessiimmeenn

     

     MMaterial Otopsiaterial Otopsi

R

Reessppiirraassii : : PPaarruu--ppaarruu & & TThhrraakkeeaa Si

Sisstetemm sasarrafaf: : ototakak & & susum2 m2 tutulalangng belbelakakanangg JJaannttuunngg : : jjaannttuunngg

P

 Feses : Rectal swab

 Darah

 Cairan tubuh: Cerebrospinal, pericard,

peritoneum & synovial serta eksudat yang keluar dari mata, hidung maupun mulut (swab)

PEMBIAKAN VIRUS

 Virus merupakan mikroorganisme yang bersifat parasit obligat dan hanya bisa hidup pada media yang hidup.

 Berkaitan dengan sifatnya tersebut, virus hanya dapat dibiakan pada sel hidup.

 Pemilihan media yang digunakan

tergantung dari jenis virusnya dan organ target dari virus tersebut.

Untuk menumbuhkan virus dalam rangka mengisolasi suatu virus dapat dilakukan secara :

1. in ovo yaitu metode menumbuhkan pada media telur berembrio (telur yang sudah dibuahi)

2. in vivo adalah metode menumbuhkan pada hewan percobaan sebagai model

3. in vitro yaitu menumbuhkan virus di dalam gelas- gelas atau tabung menggunakn

media biakan jaringan (tissue culture) atau biakan sel (cell culture).

Virus Isolation:

Virus Isolation: Telur 

Telur Embrio

Embrio Tunas

Tunas

(TET)

(TET)

 Telur berembrio telah

lama dan paling

sering digunakan

sebagai media isolasi

dan propagasi atau

 Telur berembrio atau sering disebut

dengan telur embrio tertunas (TET) atau telur ayam berembrio (TAB) sangat

penting dalam perkembangan virologi karena pada telur tertunas dapat

ditemukan bermacam-macam tipe sel yang mampu ditumbuhi/menjadi media tumbuhnya berbagai jenis virus.

Macam-macam sel tersebut adalah : 1. Sel epitel khorion yang berada pada

membran khorion

2. Sel epitel alantois yang merupakan sel

penyusun pada membran khorioalantaois. 3. Sel epitel amnion yang melapisi ruang

amnion

4. sel pada kantong kuning telur ( Yolk sac) dan sel endotel pada pembuluh darah

5. Sel dari embrionya itu sendiri yang umumnya adalah sel fibroblast.

Keberhasilan isolasi dan propagasi virus pada telur dipengaruhi oleh :

 Rute inokulasi

 Umur embrio pada telur 

 Temperatur/suhu inkubasi

 Lamanya waktu inkubasi setelah inokulasi

 Volume dan pengenceran inokulum yang digunakan

 Status kekebalan flok dari induk tempat telur berasal

 Dalam membiakan virus menggunakan telur, sebaiknya digunakan telur yang berasal dari breeding flock yang bebas

patogen tertentu (SPF/spesific pathogen free).

 Telur yang digunakan diinkubasikan pada suhu 37o-3 o Celcius dan kelembaban

 Sebelum diinokulasi telur diperiksa

dengan teropong (candling), pemeriksaan ini dilakukan untuk mengetahui apakah

telur dalam kondisi normal, sesuai dengan umurnya atau ada kelainan. Kelainan

yang terjadi misalnya tidak adanya

kantung udara, infertile (tidak dibuahi), embrio lemah atau mati. Telur-telur yang tidak normal tidak bisa digunakan.

 Inokulasi virus kedalam telur dapat

dilakukan dibeberapa tempat tergantung  jenis virusnya, misalnya pada virus yang lebih menyukai sel epitel sebagai tempat berkembang biaknya dapat diinokulasikan pada membran khorioalantois.

 Rute inokulasi yang dapat dilakukan

antara lain adalah kedalam ruang amnion (amnionic cavity), ruang alantois (allantoic cavity), membran khorio alantois, kantong kuning telur (yolk sac), intravena

 Dalam menginokulasi virus ke telur selain rute, umur telur juga harus diperhatikan, sebab pada umur tertentu, pada daerah tertentu kondisinya optimal.

 Bila akan menginokulasi kedaerah ruang amnion , pembuluh darah (intra vena) dan kantong kuning telur sebaiknya digunakan telur yang berumur 5-7 hari karena pada umur tersebut embrio masih muda dan kecil sehingga kuning telur masih cukup besar ukurannya demikian juga ruang amnionnya.

 Untuk menginokulasi ke daerah ruang alantois dilakukan pada tekur yang

berumur 9-12 hari karena pada saat itu luas ruang alantois yang optimal dan bila akan menginokulasi ke membran khorio alantois sebaiknya pada telur yang

berumur 12-14 hari sebab pada umur 

tersebut mambran cukup kuat untuk ditarik dan dibuat kantung udara buatan.

 contoh pemanfaatan TET misanya untuk memperbanyak virus ND ataupun Pox.

Pembiakan virus pada kultur sel

Virus dapat diperbanyak dengan melakukan kultur sel yaitu menumbuhkan sel yang

terinfeksi virus secara invitro. Why do we need Cell culture?  Research

 ± Reduce animal use

 Commercial or large-scale production

CELL LINE* CELL TYPE AND ORIGIN 3T3 Fibroblast (mouse)

293 Kidney epithelium (human) BHK21 fibroblast (Syrian hamster) MDCK epithelial cell (dog)

HeLa cancer epithelial cell (human) PtK1 epithelial cell (rat kangaroo) L6 myoblast (rat)

PC12 chromaffin cell (rat) (neuroblastoma cell) SP2 plasma cell (mouse)

COS kidney (monkey)

CHO ovary (chinese hamster)

DT40 (chick) lymphoma cell for efficient targeted recombination R1 embryonic stem cells (mouse)

E14.1 embryonic stem cells (mouse) H1, H9 embryonic stem cells (human)

S2 macrophage-like cells (Drosophila)

BY2 undifferentiated meristematic cells (tobacco)

Jenis

Pembiakan virus pada kultur sel

Kelebihan :

 Dapat memproduksi dalam jumlah banyak

 Semua jenis virus dapat dibiakan pada kultur sel( tergantung jenis selnya)

Kekurangannya :

 Biaya lebih mahal

 Pengerjaan harus aseptis

 Perlu peralatan yang lebih kompleks dibanding pembiakan pada telur 

Pembiakan virus pada hewan

percobaan

 Sudah jarang dilakukan terkait dengan kesejahteraan hewan

 Penelitian sudah demikian maju, sudah banyak jenis kultur sel yang dapat

REAKSI VIRUS TERHADAP

AGEN

F

ISIK & KI

M

IA

1. _{Suhu dan Temperatur}

 Sebagian besar virus sangat labil dan dapat hidup diluar tubuh induk semang.

 Di dalam laboratorium harus diusahakan agar suspensi virus dan jaringan tubuh yang

mengandung virus secepatnya disimpan pada suhu 40°C atau akan lebih bagus pada suhu -70°C. Beberapa virus ada yang stabil pada

temperatur kamar serta dapat hidup dalam waktu yang cukup lama. Misalnya virus Pox.

 Pengawetan virus yang terbaik adalah melalui proses pengeringan dalam keadaan beku,

yang disebut dengan freeze drying.

Kebanyakan virus dapat disimpan berbulan-bulan bahkan bertahun-tahun pada ampul gelas hampa udara dalam nitrogen cair (-196°C) atau pada suhu -70°C sampai -90°C (untuk virus beramplop).

 Material penyakit yang mengandung virus harus

ditempatkan dalam tabung tertutup kedap udara bila didinginkan dengan CO2 padat (es kering)

untuk menghindari perusakan virus oleh gas CO2. Sejumlah virus dapat diinaktifkan oleh proses

pembekuan pencairan (feezing-thawing).

 Sebagian besar virus dapat diinaktifkan pada suhu 56°C selama 30 menit atau 100°C selama beberapa detik karena terjadi proses denaturasi virus.

2. Perubahan pH

 Secara umum sebagian besar virus tetap hidup pada pH 5-9 akan tetapi virus akan

cepat rusak atau inaktif pada pH yang terlalu asam atau terlalu basa.

 Asam kuat dan basa kuat menyebabkan denaturasi protein virus, oleh karena itu sangat efektif untuk membasmi virus.

M_{isalnya Natrium hidroksida 2% (caustic soda)}

digunakan untuk desinfeksi virus Penyakit

3. Radiasi Ultraviolet

 Sinar matahari langsung mematikan

mikroorganisme karena mengandung sinar

ultraviolet. Berdasarkan panjang gelombangnya sinar ultraviolet dapat dikelompokkan menjadi: 3150-4000A, 2800-3150A, dan kurang dari

2800A.

 Sinar ultraviolet yang kurang dari 2800A, mempunyai efek fermisidal (merusak

mikroorganisme) dan dapat menyebabkan

peradangan kulit (erythema) dan peradangan mata (conjunctivis).

4. Formaldehid

 Larutan formaldehid, yaitu formalin yang banyak digunakan untuk pembuatan vaksin inaktif.

 Hanya RNA yang dapat diinaktifkan dengan formalin

5. Pelarut Lemak

Virus-virus yang mengandung lemak pada amplopnya dapat diinaktifkan oleh : ether,

kloloform, natrium deoksikolat, fosfolifase, dan bahan pelarut lemak lainnya.

6. Deterjen

Untuk melarutkan virus beramplop dan sebagai pembersih alat-alat laboratorium. Untuk

meningkatkan daya penetrasi deterjen dapat dicampur dengan formalin atau glutaraldehid.

Metode dan bahan kimia yang berbeda

digunakan untuk keperluan inaktivasi yaitu: A. Sterilisasi : Tekanan uap,pemanasan

kering,oksidasi ethylene,irradiasi sinar g.

B. Disinfeksi permukaan : natrium hipoklorin, gluataraldehid, formaldehid,asam pirasetik.

C. Disinfeksi kulit : Klorheksidin, ethanol 70%, iodophore

CARA

M

ENGAWETKAN VIRUS

1.Temperatur

Kebanyakan virus tahan hidup selama beberapa hari dalam temperatur 4 C . keuntungan

penyimpanan virus dalam suhu ini ialah dapat menghindari proses pembekuan dan pencairan

(freeze thawing) suspensi virus yang dapat merusak partikel virus. Untuk menyimpan virus dalam waktu lama ( berbulan-bulan atau sampai

bertahun-tahun) digunakan temperatur -70 C (dalam freezer) atau -196 C (dalam tabung berisi nitrogen cair).

2. Bahan Kimia

a. Jika virus disimpan pada temperatur -70 C, bahan kimia yang dapat dipakai untuk mengurangi

kerusakan virus adalah DMSO dengan konsentrasi

10%

b. Bila virus tersebut Cell associated, disamping DMSO 10%, pada media penyimpanan virus

ditambahkan pula serum sampai 10% untuk menjaga keutuhan sel.

c. Gliserol sebagai alkohol polihidrat dapat

menstabilkan dinding sel dan partikel virus. Pada konsentrasi 50% gliserol digunakan untuk

mengawetkan virus pox dan sel epitel yang mengandung virus PMK.

3. Proses Kering Beku

Cara ini juga disebut liofilisasi dan merupakan yang terbaik dalam mengawetkan virus. Virus yang sudah kering beku dapat disimpan dalam temperatur 4 C selama berbulan-bulan. Metode