3. BAHAN DAN METODE
Penelitian ini terbagi atas dua percobaan. Percobaan pertama dimaksudkan untuk mendapatkan informasi mengenai kapasitas dan aktivitas source dan sink dengan mengamati beberapa varietas kacang tanah, baik lokal, hasil persilangan maupun hasil introduksi. Percobaan kedua dimaksudkan untuk mengetahui pergerakan aliran karbon dalam tanaman kacang tanah yang berbeda kapasitas dan aktivitas source-sinknya.
3.1. Percobaan Kapasitas Source dan Sink Pada Beberapa Varietas Kacang Tanah
Percobaan ini dilaksanakan dengan tujuan untuk :
1. Membandingkan kapasitas dan aktivitas source-sink pada beberapa varietas kacang tanah lokal, hasil persilangan dan introduksi.
2. Mendapatkan karakter kapasitas dan aktivitas source dan sink yang mempengaruhi produksi dan pengisian biji
3. Mendapatkan sumber asimilat untuk pengisian biji 3.1.1. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan pada dua musim tanam, yaitu pada bulan Juni hingga September 2007 (Musim Tanam (MT) 2007) dan bulan Februari hingga Juni 2010 (MT-2010). Pada MT-2007, penelitian dilakukan di Kebun Percobaan (KP) Cikarawang, sedangkan penelitian pada MT-2010 dilakukan di KP Leuwikopo. Kedua lokasi penelitian terletak pada ketinggian ± 250 m di atas permukaan laut (dpl) dengan tipe tanah Latosol. Penelitian dilakukan di dua lokasi dan dua MT, karena produktivitas tanaman dapat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan tumbuh. Kondisi agroklimat selama penelitian berlangsung dan status hara tanah sebelum tanam dapat dilihat pada Tabel 1 dan 2.
Lahan penelitian bertekstur liat dan analisis tanah yang dilakukan sebelum percobaan menunjukkan bahwa kondisi kesuburan hara tanah di KP Leuwikopo lebih baik daripada Cikarawang (Tabel 1). Selama penelitian kondisi cuaca ditempat tanam sesuai dengan syarat tumbuh kacang tanah seperti yang tercantum dalam Van der Mesen dan Somaatmadja, 1992. Pertanaman MT-2010 mendapatkan kondisi curah hujan yang lebih tinggi daripada 2007 (Tabel 3).
Tabel 2 Hasil analisis tanah sebelum penelitian
Analisis Cikarawang (MT-2007) Leuwikopo (MT-2010) Nilai Kriteria Nilai Kriteria pH (H2O) 5,90 Agak masam 6,40 Agak masam C-organik (%) 1,44 Rendah 3,19 Tinggi N-total (%) 0,15 Rendah 0,28 Sedang Ca (me/100g) 7,73 Sedang 5,25 Rendah P (ppm) 1,70 Sangat rendah 18,80 Sangat tinggi K (me/100g) 0,26 Rendah 0,38 Sedang Keterangan : Kriteria berdasarkan Pusat Penelitian Tanah dan Agroklimat, 1983
Pengamatan-pengamatan lanjutan dilakukan di Laboratorium Pasca Panen, Laboratorium Teknik Mikro dan Laboratorium Biologi Molekuler di Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian IPB. Analisis kandungan karbohidrat non-structural dilakukan di Laboratorium Jasa Analisis Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB.
Tabel 3 Rata-rata kondisi agroklimat per bulan pada saat penelitian
Bulan Curah Hujan
(mm/bulan) Hujan Hari (hari)
Lama Penyinaran
dalam 8 jam (%) Suhu Rata-rata (oC) MT2007 Juni Juli Agustus September 274 134 248 206 21 12 15 12 76 86 89 90 25,6 25,6 25,4 26,0 MT2010 Februari Maret April Mei Juni 461 673 527 331 303 23 26 21 18 18 68 54 54 54 50 25,9 25,1 25,8 26,7 25,9 Sumber: Badan Meteorologi dan Geofisika, Stasiun Klimatologi Dramaga Bogor
3.1.2. Bahan dan Alat
Untuk mendapatkan keragaman pola pertumbuhan digunakan 12 varietas nasional yang telah dilepas dalam kurun waktu 1950 hingga 2003 sebagai bahan tanam. Deskripsi varietas-varietas yang digunakan disajikan dalam Lampiran 1.
Untuk menyediakan tambahan hara digunakan 100kg/ha Urea, 200 kg/ha SP18, 100 kg/ha KCL dan 500 kg/ha Dolomit. Pestisida berbahan aktif
karbofuran, deltametrin dan mankozeb digunakan untuk mengendalikan hama dan penyakit tanaman.
Peralatan yang digunakan selain peralatan budidaya adalah mistar, timbangan analitik dan oven pengering. Untuk pengamatan klorofil digunakan gunting dan kotak pendingin untuk membawa daun segar, sedangkan pengamatan stomata menggunakan kaca preparat, pewarna kuku transparan, selotip dan mikroskop.
3.1.3. Pelaksanaan
Sehari sebelum penanaman lahan ditaburi Dolomit. Benih ditanam dengan jarak tanam 40cm x 20cm (MT-2007) dan 40cm x 10cm (MT-2010). Seluruh dosis pupuk Urea, SP36 dan KCl diberikan saat tanam.
Serangan hama dan penyakit diupayakan serendah mungkin dengan penggunaan pestisida pada awal tanam serta penyemprotan 2 minggu sekali mulai dari 5 Minggu Setelah Tanam (MST) hingga 10 MST. Pertanaman juga diupayakan bersih dari gulma selama 5 minggu pertama dengan melakukan penyiangan secara manual. Setelah 5 minggu, pertanaman tidak disiang lagi karena dikhawatirkan ginofor yang telah masuk ke dalam tanah akan terganggu dengan kegiatan penyiangan ini. Pada umur tanaman 4 MST dilakukan pembumbunan dalam upaya agar ginofor yang terbentuk dapat dengan mudah menembus tanah dan membengkak membentuk polong.
Panen dilakukan serempak pada umur 100 MST. Tanaman dipanen dalam ubinan berukuran 1m2 yang diambil 2 kali pada tiap unit petak percobaan.
3.1.4. Pengamatan
Pengamatan yang dilakukan meliputi pengamatan pada karakter kapasitas dan aktivitas source serta kapasitas, aktivitas dan kekuatan sink. Enam varietas dengan kapasitas dan aktivitas source-sink berbeda kemudian digunakan untuk pengamatan kandungan karbohidrat non-struktural (Total Non-struktural Carbohydrate = TNC) dalam batang dan daun untuk mengukur pengaruh kadar TNC pada pengisian biji.
3.1.4.1. Kapasitas dan Aktivitas Source
Kapasitas source adalah banyaknya bagian tanaman yang mampu berfotosintesis sebelum dan selama periode pengisian biji, sedangkan aktivitas source adalah laju/kecepatan tanaman menghasilkan asimilat yang kemudian disimpan atau terukur dalam bobot keringnya. Yang dimaksud dengan periode pengisian biji dalam percobaan ini mengacu pada fase pertumbuhan kacang tanah R2 hingga R8 (Trustinah 1993). R7 dan R8 dimasukkan kedalam periode pengisian biji dikarenakan pola pertumbuhan kacang tanah yang semi determinate sehingga diduga ada pengisian biji setelah fase R6 (fase biji penuh). Pengamatan kapasitas source dilakukan dengan melakukan pengukuran bobot kering batang, daun, kandungan klorofil, kerapatan stomata, Indeks Luas Daun (ILD), percabangan dan tinggi batang utama. Pengamatan aktivitas source dilakukan dengan menghitung laju pertambahan luas daun, Laju Akumulasi Bersih (LAB) dan laju pertambahan bahan kering atau Laju Tumbuh Tanaman.
Pengukuran kandungan klorofil dilakukan pada MT-2007. Satu contoh daun yang terletak pada buku ketiga dari tunas batang utama (daun ketiga), yang terbuka dan tidak terserang hama dan penyakit dipetik pada 42 dan 70 HST. Pengambilan dilakukan pada pagi hari sekitar pukul 8.00 – 9.00. Kandungan klorofil total diukur dengan metode Mass-Spektrofotometri.
Pengukuran kerapatan stomata pada permukaan bagian atas dan bawah daun dilakukan pada MT-2010. Pengamatan karakter ini dilakukan pada umur tanaman 70HST pada 5 tanaman contoh per petak percobaan. Untuk pengamatan stomata ini, dipilih satu anak daun dari daun ketiga yang tidak terserang penyakit. Permukaan daun atas dan bawah diolesi cairan aseton kemudian ditempeli selotip. Selotip kemudian dilepas dengan cepat dan dilekatkan pada gelas preparat. Stomata yang tercetak pada selotip dihitung dengan menggunakan mikroskop cahaya. Jumlah stomata/mm2 diperoleh dengan menkonversi jumlah stomata dalam luasan bidang pandang ke milimeter persegi.
Pengukuran bobot kering batang, daun, akar, ginofor, polong, Indeks Luas Daun (ILD) dilakukan dengan melakukan destruksi dua hingga tiga tanaman contoh dari bagian tengah petak. Destruksi pada MT-2007 dilakukan pada 26 HST (R1, periode sebelum berbunga), 42 HST (R3, periode pembentukan
polong), 70 HST (R6, periode akhir pengisian biji) dan 91 HST (R8, periode pemasakan jelang panen). Pada MT-2010 destruksi dilakukan pada waktu 50% tanaman berbunga, 42, 56 (R5, periode awal pengisian), 70 dan 84 HST (R7, periode awal pemasakan).
Setelah destruksi tanaman kemudian dibersihkan dan dipisahkan menjadi daun, batang, ginofor dan polong. Sebelum dikeringkan, daun diukur dahulu luas daunnya dengan menggunakan metode Gravimetri. Pada MT-2007, untuk pengukuran ILD hanya menggunakan luasan 10 daun/tanaman sebagai contoh, sedangkan pada MT-2010, pengukuran ILD menggunakan seluruh daun yang dihasilkan tanaman pada saat pengamatan dilakukan. Daun, batang, ginofor dan polong kemudian dikeringkan dalam oven selama dua hingga tiga hari pada suhu 70oC untuk kemudian ditimbang bobot kering setiap bagiannya.
Nilai ILD, Laju Akumulasi Bersih dan Laju Tumbuh Tanaman dihitung dengan menggunakan rumus seperti yang tercantum dalam Brown (1984) yaitu: ILD = Luas daun/tanaman
Jarak tanam
LAB = ln LDt2-ln LDt1 x (W2-W1) ,dimana LD = Luas daun
(t2 – t1) LDt2-LDt1 W = bobot kering tanaman
t1 dant2 = waktu
pengamatan
LTT = (W2 – W1) x ___1_____ (t2 - t1) jarak tanam
Pengamatan jumlah cabang dan tinggi batang utama dilakukan pada MT- 2010. Pengamatan jumlah percabangan dilakukan pada 42, 56, 70 dan 84 HST sedangkan tinggi batang utama dilakukan pada semua tanaman contoh yang dipanen dalam ubinan seluas 1m2.
3.1.4.2. Kapasitas, Aktivitas dan Kekuatan Sink
Kapasitas sink diartikan sebagai ukuran besarnya sink yang dapat diisi oleh asimilat, aktivitas sink diartikan sebagai laju pengisian polong/biji. Pengamatan kapasitas sink terdiri dari jumlah bunga, jumlah ginofor, jumlah dan bobot polong serta bobot 100 biji, sedangkan aktivitas sink diukur dari Laju Tumbuh Polong. Kekuatan sink menggambarkan dominansi sink untuk
mendapatkan asimilat, dan diukur dari nilai koefisien partisi (partition coefficient) dan persentase polong penuh.
Jumlah bunga dihitung setiap dua hari sekali sejak tanaman berumur 42 HST hingga 70 HST pada 5 tanaman contoh/petak percobaan. Jumlah ginofor dan polong muda dihitung dari tiap tanaman yang didestruksi.
Jumlah dan bobot polong diamati pada saat panen. Pengamatan meliputi jumlah dan bobot polong per tanaman saat panen jumlah dan bobot polong yang terisi penuh biji, jumlah dan bobot polong yang tidak terisi penuh biji (polong ½ penuh) serta jumlah dan bobot polong cipo. Polong penuh adalah polong yang setelah dikeringkan dan dikupas, biji mengisi penuh ruang bagian dalam polong. Polong ½ penuh adalah polong yang setelah dikeringkan dan dikupas maka biji hanya mengisi kira-kira separuh ruang dalam polong atau kurang. Polong cipo adalah polong yang setelah dikeringkan berubah mengerut dan hampir tidak berbiji. Kriteria polong penuh, polong ½ penuh dan cipo dapat dilihat pada Lampiran 2. Bobot 100 biji didapatkan setelah polong dalam satu ubinan dikeringkan dan dibijikan.
Laju Tumbuh Polong dihitung sebagai selisih bobot kering polong pada saat panen dengan bobot polong muda pada periode pengisian biji (42 HST pada MT-2007 dan 56 HST pada MT-2010). Rumus yang digunakan untuk menghitung Laju Tumbuh Polong sama dengan rumus untuk menghitung Laju Tumbuh Tanaman tetapi dengan mengganti bobot kering tanaman dengan bobot kering polong.
Koefisien partisi merupakan rasio dari nilai LTP dan LTT pada 42 HST (MT-2007) atau 56 HST (MT-2010) (Duncan et al. 1978). Persentase polong penuh merupakan perbandingan jumlah polong yang terisi penuh biji dengan total jumlah polong/tanaman pada saat panen. Persentase polong penuh disamping untuk mengamati kekuatan sink juga untuk mengamati kemampuan pengisian varietas.
3.1.4.3. Translokasi Asimilat
Translokasi asimilat diamati dengan mengukur kandungan total karbohidrat non-struktural (Total Non-structural Carbohydrate = TNC) pada
batang dan daun. Pengamatan hanya dilakukan pada tanaman dari KP Cikarawang (MT-2007).
Pengukuran dilakukan dengan mengambil dua tanaman contoh dari setiap petak percobaan pada 42 dan 70HST. Kedua tanaman contoh tersebut dipisahkan menjadi batang, daun, akar, ginofor dan polong, dikeringkan 70oC selama 48 jam dan digiling halus. Kandungan karbohidrat total dan karbohidrat terlarut (TNC) diukur dengan menggunakan metode pengukuran karbohidrat by-difference. 3.1.4.4. Indeks Panen dan Produktivitas
Panen pada MT-2007 dilakukan pada umur tanaman 100 HST, sedangkan pada MT-2010 dilakukan pada umur 105 HST. Panen dilakukan dalam ubinan 1m2 yang dilakukan dua kali pada tiap unit percobaan. Tanaman dipisahkan menjadi brangkasan dan polong. Masing-masing ditimbang dan dikeringkan selama 3-5 hari. Pengamatan yang dilakukan meliputi Indeks panen dan produktivitas polong dan biji per tanaman dan per hektar.
Indeks Panen merupakan rasio antara bobot kering polong dengan keseluruhan bobot kering tanaman (tajuk dan polong). Produktivitas polong dan biji per tanaman merupakan hasil rata-rata bobot kering polong dan biji sejumlah tanaman dalam ubinan. Produktivitas polong dan biji per hektar diperoleh dari konversi bobot kering polong dan biji ubinan ke dalam hektar.
3.1.5. Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Perlakuan varietas dalam masing-masing musim tanam disusun menggunakan Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) dengan 3 ulangan. Data yang terkumpul dianalisis dengan tujuan untuk dapat mengelompokkan varietas-varietas yang digunakan berdasarkan karakter-karakter terpilih. Data dari masing-masing musim tanam diolah ragamnya dan apabila hasilnya menyatakan adanya perbedaan antara perlakuan/varietas maka dilakukan uji lanjut DMRT dengan taraf 5%.
Untuk menentukan kecenderungan pengaruh genetik atau pengaruh lingkungan terhadap masing-masing karakter yang diamati dilakukan analisis untuk menduga besaran ragam genetik dan ragam lingkungan pada masing-masing musim tanam, kemudian dilakukan pula analisis ragam gabungan dengan
ulangan tersarang dalam lokasi/musim tanam. Analisis ragam gabungan dilakukan untuk memilih karakter-karakter yang dapat diperbandingkan antar varietas. Model analisis ragam pada masing-masing musim tanam dan analisis ragam gabungan menurut Gomez dan Gomez (2007) dapat dilihat pada Tabel 4 dan 5.
Tabel 4 Analisis ragam pada tiap musim tanam Sumber
Keragaman
Derajat Bebas Kuadrat Tengah E(KT) Ulangan Varietas Galat r-1 g-1 (r-1)(g-1) M3 M2 M1 σ2e + r σ2g σ2e Keterangan : Ragam lingkungan (σ2e) = M1
Ragam genetik (σ2g) = (M2 – M1)/r
Tabel 5 Analisis ragam gabungan dua musim tanam Sumber
Keragaman
Derajat Bebas Kuadrat Tengah E(KT) Lokasi Ulangan/lokasi Varietas Lokasi * Varietas Galat gabungan ℓ-1 ℓ(r-1) g-1 (ℓ-1)(g-1) ℓ(r-1)(g-1) M3 M2 M1 σ2e + r. σ2g ℓ +r. ℓσ2g σ2e + r. σ2g ℓ σ2e Keterangan : Ragam Lingkungan = M1
Ragam interaksi genetik dan lingkungan = (M2-M1)/r Ragam genetik = (M3-M2)/r. ℓ
Untuk mengetahui pengaruh suatu karakter terhadap karakter lainnya dilakukan analisis korelasi metode Pearson dan analisis lintas. Analisis korelasi akan menunjukkan tingkat keeratan karakter yang digambarkan dari nilai koefisien korelasinya. Nilai koefisien semakin mendekati -1 atau +1 maka tingkat keeratan antara dua karakter semakin kuat, sedangkan semakin mendekati nol maka tingkat keeratan semakin rendah.
Model umum persamaan penduganya adalah Y = α + βX (Gomez dan Gomez 2007). Nilai koefisien korelasi Pearson dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :
r = ____∑ xy____ √(∑ x2) (∑ y2)
Keterangan : x dan y adalah karakter-karakter yang diduga memiliki hubungan
Apakah suatu karakter memiliki pengaruh langsung atau tidak langsung terhadap karakter lainnya didapatkan dengan melakukan analisis lintas (Rohaeni 2010). Analisis lintas akan menjelaskan seberapa besar pengaruh langsung atau tidak langsung suatu karakter source dan sink terhadap hasil atau bobot polong/tanaman, Indeks Panen dan persentase polong penuh. Adanya informasi tentang hubungan suatu karakter dengan karakter hasil polong dan persentase polong penuh dapat dimanfaatkan untuk melakukan metode seleksi yang lebih efisien dan perbaikan teknologi produksi tanaman. Model analisis lintas adalah sebagai berikut :
Y = β0 + β1X1 + β2X2 + ……. + βpXp
Pendugaan pengaruh langsung dan tidak langsung suatu karakter dengan hasil dihitung menggunakan koefisien analisis lintas seperti dalam Dewey dan Lu (1959). Koefisien korelasi antara berbagai karakter source dan sink dengan karakter produksi (bobot polong/tanaman, Indeks Panen atau persentase polong penuh) diuraikan menjadi pengaruh langsung dan tidak langsung menggunakan rumus :
P01 + P02r12 ……… + P0pr1p = r01 P01r12 + P02 r2p+ …………. + P0pr2p = r02 P01 r1p + P02 r2p + …………. + P0p = r0p
Keterangan, P01, P02 ………Pop = koefisien variabel langsung 1, 2 ……p pada variabel tidak bebas 0.
r12, r13…..r1p…rp(P-1) = koefisien korelasi yang mungkin antara berbagai variabel bebas
r01, r02…………....r0p = korelasi antara variabel tidak bebas dengan variabel bebas
Pengaruh langsung variabel ith melalui variabel jth ditunjukkan sebagai (poj x rij). Koefisien korelasi adalah jumlah total pengaruh langsung dan tidak langsung terhadap variabel tidak bebas. Pengaruh sisa (P20x) dihitung dengan menggunakan rumus :
3.2. Percobaan Translokasi Karbon Pada Dua Varietas Kacang Tanah Menggunakan Penjejak Isotop 13C
Percobaan ini dilakukan dengan tujuan untuk membuktikan adanya perbedaan translokasi karbon pada varietas kacang tanah dengan kapasitas dan aktivitas source dan sink yang berbeda. Percobaan ini termasuk percobaan untuk mengamati translokasi asimilat pada kacang tanah. Kadar karbon tanaman diamati dengan menggunakan penjejak isotop karbon 13 (13C).
3.2.1. Waktu dan Lokasi Percobaan
Tanaman dikecambahkan pada 19 Juni 2009 dan feeding dilakukan 30-31 Agustus 2009 di kebun percobaan Cikabayan, Institut Pertanian Bogor. Pengukuran kandungan isotop 13C dilakukan pada bulan Nopember 2009 di Laboratorium Pengujian Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi BATAN, Jakarta. Kandungan kadar karbon dalam bagian tanaman di lakukan di Laboratorium Departemen Ilmu Tanah dan Sumberdaya Lahan Faperta IPB.
3.2.2. Bahan dan Alat
Sebagai sumber isotop 13C digunakan Barium karbonat (Ba13CO3) mengandung 98% isotop 13C. Sebagai tempat feeding digunakan kotak bersungkup plastik berukuran 120cm x 60 cm x 80 cm (Gambar 2) yang kemudian direndam dalam kolam berisi air untuk mencegah bocornya 13CO2.
Bahan tanaman menggunakan varietas Sima dan Jerapah. Peralatan tanam yang digunakan mencakup bak semai dan pot plastik. Ke dalam pot plastik diisikan campuran tanah dan kompos dengan perbandingan berat 1:1 sebanyak ± 4 kg. Dolomit sebanyak 20 gram/pot dan 5 gram pupuk majemuk NPK ditambahkan pula ke dalam pot sebagai tambahan hara.
Untuk mengukur suhu udara dan kelembaban digunakan termometer bola basah dan bola kering yang digantungkan di dalam rak plastic (Gambar 2). Kipas plastik, yang digantungkan ditengah kotak feeding, digunakan untuk menyebarkan 13C pada saat feeding. Photosynthetic Active Radiation (PAR) dan Carbon Exchange Rate (CER) diukur menggunakan LICOR-6400XT pada beberapa tanaman contoh.
Gambar 2 Rak tempat feeding dengan isotop 13C. 3.2.3. Pelaksanaan
Benih kacang tanah sebelumnya direndam dalam larutan fungisida kemudian disemai terlebih dahulu dalam kotak semai berisi kompos. Metode ini digunakan untuk menyeragamkan umur tanaman yang akan diberi label 13C. Setelah berumur 5 hari dipilih tanaman-tanaman dari kedua varietas yang berkecambah pada hari yang sama dan pertumbuhannya relatif seragam. Didapat 12 tanaman dari masing-masing varietas yang pertumbuhannya relatif seragam. Bibit kemudian dipindahkan ke pot dengan dua bibit per pot yang kemudian dijarangkan menjadi satu bibit pada minggu berikutnya. Didapat 12 tanaman dari masing-masing varietas yang pertumbuhannya relatif seragam. Ke dalam setiap pot dicampurkan kapur Dolomit sebanyak 20 gram/pot dan 5 gram pupuk majemuk NPK. Pot-pot berisi bibit kemudian diletakkan di tempat terbuka dan dijaga pertumbuhannya hingga siap diberi label isotop 13C. Sebanyak 6 tanaman dari masing-masing varietas akan digunakan dalam penelitian sedangkan sisanya sebagai cadangan. Tanaman dipelihara dalam pot hingga berumur 10 MST, yaitu fase pengisian biji.
Pada umur 10 minggu setelah transplanting, masing-masing 3 pot dari tiap varietas dipindahkan ke dalam rak plastik. Rak kemudian ditutup dengan sungkup plastik (Gambar 2). Di dalam sungkup plastik itu 10 gram Ba13CO3 dicampur dengan H2SO4 pekat sehingga menghasilkan gas 13CO2. Feeding atau pelabelan dengan isotop 13C berjalan selama 90 menit. Agar gas 13CO2 menyebar merata
digunakan kipas angin kecil yang digantungkan diatas sungkup plastik. Setelah 90 menit pot dikeluarkan dari sungkup dan dipindahkan ketempat semula.
Pengukuran Photosynthetic Active Radiation (PAR) dan CER dilakukan pada tanaman contoh yang tidak di feeding. Pengukuran dilakukan di laboratorium fisiologi tanaman Biotrop Bogor.
Tanaman dari tiap varietas didestruksi pada 1, 2 dan 4 hari setelah feeding. Tanaman dibongkar dari dalam pot, dicuci dan dikeringanginkan selama ± 24jam. Tanaman dipisahkan menjadi batang, daun, akar dan polong. Masing-masing bagian kemudian dimasukkan dalam kantong kertas dan dikeringkan dalam oven bersuhu 70oC selama tiga hari dan dihaluskan. Sebagian contoh kemudian diukur kandungan karbon dalam tiap bagian tanaman. Sebagian contoh lagi (10 mg) dibawa ke laboratorium Badan Tenaga Atom Nasional (BATAN) untuk dilakukan analisis kandungan isotop 13C dengan menggunakan metode mass spektrofotometri.
Pengukuran kandungan isotop adalah dengan mengukur pengayaan 13C (13 C-enrichment = δ13C) pada tanaman. Pengukuran δ13C menggunakan rumus yang tercantum dalam Zhang et al. (2009) yaitu :
δ13C = R sample – 1 X 1000 ‰ Rstandard
Keterangan: R sample = rasio 13C/12C pada sample ; R standar = rasio 13C/12C standar batu kapur PDB South Carolina
Persentase 13C atom excess diukur dengan menggunakan formula dari Inanagi dan Yoshihara (1997) yaitu :
%13C atom excesss = % 13C atom - 13C dalam atmosfir (1,106 %) Kadar 13C dalam bagian tanaman diukur dengan formula :
Kadar 13C bagian tanaman (g) = (% 13C atom x kadar karbon bagian tanaman, g) ( 1 + % 13C atom)
