ABSTRAK
ACHMAD LUDFI, J500100014, 2014. UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI
EKSTRAK ETANOL KAYU TANAMAN SECANG (Caesalpinia sappan Linn) TERHADAP BAKTERI Escherichia Coli ATCC 11229 DAN Staphylococcus Aureus ATCC 6538 SECARA IN VITRO. FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
Latar Belakang : Tanaman Secang (Caesalpinia sappan Linn) ialah termasuk tanaman yang mempunyai prospek yang sangat baik dalam pemanfaatannya sebagai obat terutama antibakteri. Pada tanaman secang terdapat senyawa tanin, saponin, serta flavonoid yang mempunyai aksi sebagai antibakteri.
Tujuan Penelitian : Tujuan pada penelitian ini ialah agar diketahuinya aktivitas dari ekstrak etanol tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) dalam kemampuannya untuk menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli serta Staphylococcus aureus.
Hasil Peneltian : Ekstrak etanol kunyit kuning (Caesalpinia sappan Linn) dengan konsentrasi 20% b/v, 40% b/v, 60% b/v, 80% b/v, serta 100% b/v dapat menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli dengan rerata masing-masing yaitu 7,6 mm, 10 mm, 12,2 mm, 13,8 mm, dan 16 mm dengan nilai uji statistik p = 0,000 sedangkan Staphylococcus aureus dengan masing-masing rerata diameter zona hambat yaitu 8,6 mm, 11,8 mm, 13,8 mm, 14,6 mm, dan 17,6 mm dan nilai uji statistik p = 0, 000.
Kesimpulan : Ekstrak etanol tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) mempunyai kemampuan dalam aksinya sebagai suatu antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 11229 serta Staphylococcus aureus ATCC 6538 secara in vitro
ABSTRACT
ACHMAD LUDFI, J500100014, 2014. ANTIBACTERIAL ACTIVITY TEST
OF ETHANOL EXTRACT OF SAPPAN WOOD (Caesalpinia sappan Linn) AGAINSTS Escherichia Coli ATCC 11229 AND Staphylococcus Aureus ATCC
6538 IN VITRO. FACULTY OF MEDICINE UNIVERSITY
MUHAMMADIYAH SURAKARTA.
Background : Sappan wood (Caesalpinia sappan Linn) is one of plants that have a prospect to be used as an antibacterial. Sappan wood (Caesalpinia sappan Linn) contain subtances like tanin, saponin, and flavonoid compound that have an antibacterial action.
Objective : This research to determine activity of ethanol extract of sappan wood (Caesalpinia sappan Linn) inhibiting the growth of Escherichia coli and Staphylococcus aureus.
Method : This research come with true experimental design laboratory with Post Test Only Control Group Design method. The ethanol extract of sappan wood (Caesalpinia sappan Linn) is tested by well method with concentration 20% w/v, 40% w/v, 60% w/v, 80% w/v, and 100 w/v. Wells is made on Muller Hinton germ growth media which is smeared by culture of Escherichia coli ATCC 11229 and Staphylococcus aureus ATCC 6538 which has been standardized by 0,5 McFarland standard. The ethanol extract of sappan wood (Caesalpinia sappan Linn) drip into the well with various concentrations. It is incubated with a temperature of 37°C for 24 hours and the form inhibition zone is measured.
while Staphylococcus aureus with mean of each is 8,6 mm, 11,8 mm, 13,8 mm, 14,6 mm, and 17,6 mm with p = 0,000.
Conclusion : The ethanol extract of sappan wood (Caesalpinia sappan Linn) has antibacterial activity against of Escherichia coli ATCC 11229 and Staphylococcus aureus ATCC 6538 in vitro.
Keyword : The ethanol extract of sappan wood (Caesalpinia sappan Linn), antibacterial activity, Escherichia coli, Staphylococcus aureus
PENDAHULUAN
Anugerah terbesar bagi insan Indonesia sebagai negeri dengan keanekaragaman hayati begitu kaya. Terutama tanaman obat tradisional yang tumbuh di nusantara sebanyak 7500 spesies, telah teridentifikasi 940 spesies (1)
Obat tradisional ialah suatu bahan atau campuran bahan yang diperoleh dari bahan tumbuh-tumbuhan, hewani, mineral, sediaan sarian atau galenik, bisa juga campuran bahan tersebut, penggunaannya secara turun tenurun (2)
Berdasarkan data statistik pemakaian obat tradisional oleh masyarakat Indonesia untuk tahun 2011 telah terjadi penurunan persentase yang cukup signifikan yaitu 23,63 % dari tahun sebelumnya sebesar 27,58 % (3)
Pemerintah terus mendukung segala usaha untuk menempatkan penggunaan obat tradisional dalam upaya peningkatan derajat kesehatan rakyat Indonesia, serta mendukung pengembangan obat tradisional di Indonesia, salah satu diantaranya dengan adanya regulasi Peraturan Kepala BPOM RI Nomor 28 Tahun 2013 tentang obat tradisional yang intisarinya ialah memudahkan untuk mengimpor bahan-bahan ramuan untuk pembuatan obat tradisional di dalam negeri (4)
Indonesia masih sangat tinggi dibandingkan dengan negara-negara sesama anggota ASEAN lainnya (5)
Menurut sebuah laporan yang diterbitkan oleh Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) bertajuk The World Medicines Situation 2011 Rational Use Of Medicines, terdapat hampir 30 % tindakan meresepkan antibiotik masih tidak tepat berakibat terjadinya peningkatan kemunculan strain-strain baru bakteri resisten (6)
Bertepatan Hari Kesehatan Dunia tahun 2011, Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) mengangkat tema Combat Antimicrobial Resistance yang bertujuan agar Pemerintah di setiap negara lebih memperhatikan kondisi resistensi bakteri yang sedang mewabah di seluruh dunia (7)
Kemudian, perlu diketahui pula bahwa kini persentase untuk infeksi nosokomial yang disebabkan oleh bakteri Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) maupun bakteri Gram Negatif Multidrug Resistant masih cukup tinggi prevalensinya di seluruh dunia (8)
Salah satu tanaman obat tradisional tersebut diantaranya kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn). Tanaman ini mudah didapat, kayu tanaman secang ini sering dibuat dalam bentuk minuman wedang secang khas kerajaan mataram, teh secang khas sulawesi, bir pletok, maupun zat pewarna alami. Dari 40 bahan tanaman obat tradisional di Indonesia yang diekstraksi dengan metanol dan 50% etanol, didapatkan fakta bahwa Caesalpinia sappan Linn ini merupakan salah satu ekstrak terbaik yang mampu bekerja sebagai antibakteri potensial untuk diteliti lebih lanjut (9;
10; 11)
etanol 70%, nanti zat berupa tanin, saponin, flavonoid dari ektrak tersebut dilakukan pengujiaan pada bakteri Escherichia coli ATCC 11229 (sebagai gram negatif) dan Staphylococcus aureus ATCC 6538(sebagai gram positif) (15)
Berlandaskan pemaparan di atas, peneliti berminat untuk mengetahui efek dari ekstrak etanol kayu tanaman secang sebagai antibakteri dengan bakteri uji Escherichia coli ATCC 11229 (sebagai gram negatif) dan Staphylococcus aureus ATCC 6538(sebagai gram positif).
TUJUAN
1. Tujuan Umum
Mengetahui efek ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) sebagai antibakteri terhadap Escherichia coli ATCC 11229 (bakteri gram negatif) dan Staphylococcus aureus ATCC 6538 (bakteri gram positif) secara in vitro. 2. Tujuan Khusus
a) Untuk mengetahui efek ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) sebagai antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli ATCC 11229 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538.
b) Untuk mengetahui pada konsentrasi berapakah ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) mempunyai efek pada pertumbuhan bakteri Escherichia coliATCC 11229 maupun Staphylococcus aureus ATCC 6538.
METODE PENELITIAN
DEFINISI OPERASIONAL
1. Ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn)
Proses pembuatan ekstrak kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) memakai metode maserasi menurut prosedur Ansel (2008) dengan menggunakan pelarut etanol 70% dengan satuan ukur mililiter (ml) yang kemudian didapatkan suatu ekstrak kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) yang masing-masing pada konsentrasi 20% b/v, 40% b/v, 60% b/v, 80 % b/v, dan 100% b/v, dimana proses pembuatannya dilaksanakan di Laboratorium Biomedik III Sub Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Surakarta.
2. Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
Escherichia coli ATCC 11229 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538 adalah biakan murni yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Surakarta.
3. Aktivitas antibakteri
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilaksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Muhammadiyah Surakarta dengan memakai bahan uji berupa tanaman yaitu kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn). Determinasi dilaksanakan dengan mennyesuaikan morfologi tanaman dengan kunci-kunci yang ada dalam literatur guna memastikan identitas dari tanaman sehingga mampu mengurangi kekeliruan dalam pengumpulan bahan yang akan dipakai pada pembuatan ekstrak dalam penelitian. Buku acuan yang dipakai dalam determinasi ialah Flora of Java (spermatophytes only) volume I karangan Backer dan Van den Brink (1968). Hasil determinasi sebagai berikut :
1b, 2b, 3b, 4b, 12b, 13b, 14b, 17b, 18b, 19b, 20b, 21b, 22b, 23b, 24b, 25b, 26b, 27a, 28b, 29b, 30b, 31a, 32a, 33a, 34a, 35b, 37b, 38b, 39b, 41a, 49b,
Familia : Caesalpiniaceae
1a, 2b, 3b, 4b, 9b, 10b, 11b Genus : Caesalpinia
1a, 2b, 3b, 5b, 7b, 8a, Species : Caesalpinia sappan Linn atau Biancaea sappan Linn TodaroHortus Botanicus Panormitanus. (18; 19; 20)
B. Hasil pembuatan ekstrak kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn)
dilakukan proses pembuatan konsentrasi ekstrak menjadi 20% b/v, 40% b/v, 60% b/v, 80% b/v, serta 100% b/v.
C. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Sumuran
Pengujian ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) dalam aksinya sebagai antibakteri yang dilaksanakan di Laboratorium Biomedik II Sub. Lab Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Surakarta, memakai metode sumuran dan konsentrasi yang digunakan yaitu sebanyak lima jenis urutan dari ekstrak diantaranya 20% b/v, 40% b/v, 60% b/v, 80% b/v, serta 100% b/v ditambah dua perlakuan kontrol ialah kontrol positif (amoksisilin serta kloramfenikol) maupun kontrol negatif (DMSO 0,5%). Dan pada pengujian ini pula dilakukan lima kali replikasi atau pengulangan yang memperlihatkan hasil seperti dibawah ini :
1. Esherichia coli
Hasil yang diperoleh adalah sebagai berikut :
Tabel 1. Hasil Pengukuran zona hambat uji antibakteri Escherichia coliATCC 11229 Diameter Zona Hambat (mm)
Replikasi Kontrol Kontrol Konsentrasi Ekstrak Caesalpenia sappan Linn (+) (-) 20% 40% 60% 80% 100%
1 24 4 8 12 13 14 17
2 24 4 7 9 11 12 15
3 23 4 7 10 11 13 14
4 20 4 8 9 13 15 17
5 22 4 8 10 13 15 17
Mean 22,6 4 7,6 10 12,2 13,8 16
2. Staphylococcus aureus
Tabel 2. Hasil Pengukuran zona hambat uji antibakteri Staphylococcus aureusATCC 6538 Diameter Zona Hambat (mm)
Replikasi Kontrol Kontrol Konsentrasi Ekstrak Caesalpinia sappan Linn
(+) (-) 20% 40% 60% 80% 100%
1 36 4 7 13 15 13 19
2 37 4 11 7 13 14 15
3 37 4 8 13 12 14 18
4 36 4 9 13 15 16 19
5 35 4 8 13 14 16 17
Mean 36,2 4 8,6 11,8 13,8 14,6 17,6
HASIL ANALISIS DATA
Data penelitian dianalisis secara statistik dengan SPSS 17.0 for windows menggunakan uji statistik Anova dan kemudian dilanjutkan dengan uji statistik Post Hoc. Akan tetapi sebelumnya telah dilakukan uji distribusi data menggunakan uji Shapiro Wilk serta homogenitas dengan Levene Test.
Tabel 3. Hasil Uji Analisis Data Escherichia coli dan Staphyloccus aureus
Uji Statistik Escherichia coli Staphylococcus aureus
Uji distribusi data
Shapiro Wilk
0,196 0,164
Uji homogenitas
Levene test
0,260 0,605
Uji Anova 0,000 0,000
PEMBAHASAN
Tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) pada dasarnya telah lama dimanfaatkan masyarakat Indonesia, khususnya bagian kayunya dapat dipakai salah satunya untuk zat pewarna alami pada makanan maupun minuman serta masih banyak lagi manfaat lainnya.
Pada bagian kayu dari tanaman secang ada sedikit terkandung minyak atsiri, namun jumlahnya tidak sebanyak zat saponin, flavonoid, dan tanin. Karena ketiga zat tersebut mendominasi maka sebagian besar penelitian selalu memfokuskan ketiga zat tersebut, akan tetapi pengaruh daripada minyak atsiri senantiasa tidak dapat dihindari.
Dalam penelitian ini, memakai metode pengujian aktivitas antibakteri yaitu menggunakan metode sumuran. Metode sumuran digunakan karena metode ini mudah, selain itu metode ini membuat kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) dapat berdifusi maksimal dikarenakan bahan akan bertemu langsung dengan media pertumbuhan bukan hanya permukaan media pertumbuhan saja, melainkan bisa terdifusi sampai kedasar media melalui sumur atau well atau lubang yang dibuat pada media pertumbuhan kuman. Penelitian aktivitas antibakteri ini dilihat dari terbentuknya zona hambat pertumbuhan kuman dengan melihat ada atau tidaknya zona bening pada media pertumbuhan kuman (21)
Pada penelitian ini masing-masing kuman yaitu Escherichia coli ATCC 11229 serta Staphylococcus aureus ATCC 6538 mendapat tujuh kelompok perlakuan, yang masing-masing perlakuan dilakukan pengulangan atau replikasi sebanyak lima kali dengan tujuan untuk meyakinkan keabsahan data hasil percobaan, dapat mengurangi experimental error sehingga menurunkan resiko kegagalan pada percobaan.
diberikan, semakin tinggi konsentrasi ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) yang diberikan maka semakin besar pula kemampuan zat aktif untuk menghambat pertumbuhan bakteri, seperti yang terlihat pada gambar 9 grafik mean daya hambat, pada uji Staphylococcus aureus seharusnya pada konsentrasi yang lebih tinggi mengalami penurunan daya hambat bakteri karena difusi semakin sulit terjadi akan tetapi pada penelitian ini bisa dikarenakan proses ekstraksi simplisia yang masih mengandung minyak atsiri sehingga masih dapat terjadi difusi dan menghasilkan daya hambat bakteri.
Hasil berbeda pada tabel 3 yaitu uji aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli ATCC 11229. Tabel tersebut menunjukan yaitu 7,6 mm (20%), 10 mm (40%), 12,2 mm (60%), 13,8 mm (80%), dan 16 mm (100%). Disini ditemukan adanya perbedaan dengan hasil dari Staphylococcus aureus, yaitu pada seri konsentrasi ekstrak 20% b/v, 40% b/v, 60% b/v, 80% b/v, dan 100% b/v dimana didapatkan hasil yang cukup luas zona hambatnya. Pada gambar 8 grafik Escherichia coli yang didapatkan yaitu terlihat adanya kenaikan signifikan. Hal tersebut bisa disebabkan karena beberapa penyebab, seperti pertumbuhan bakteri yang tidak merata pada medianya, kecepatan pertumbuhan kuman, selain itu bisa disebabkan kecepatan difusi dari zat aktif yang diujikan.
Selanjutnya apabila dibandingkan dari kedua hasil penelitian terdapat perbedaan zona hambat antara Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Pada Staphylococcus aureus zona hambat yang terbentuk lebih besar dibandingkan dengan Escherichia coli. Hal tersebut disebabkan faktor kemampuan difusi bahan uji, interaksi antar komponen medium, dan metabolit sekunder zat aktif.
Selain itu, pada penelitian Ramesh (2002) didapatkan fakta Staphylococcus aureus memiliki zona inhibisi lebih besar dibandingkan Escherichia coli karena mekanisme zat aktif tanaman menganggu sintesis protein dan peptidoglikan pada dinding bakteri sehingga perbedaan stuktur dinding bakteri mempengaruhi efek zat aktif. Pada Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif memiliki selubung sel sederhana dibandingkan Escherichia coli.
Tabel 4. Perbedaan struktur dinding bakteri gram negatif dan gram positif
Gram Negatif (Selubung kompleks) Gram Positif (Selubung sederhana)
1. Membran Sitoplasma atau inner membrane
1. Membrane sitoplasma
2. Dinding sel : a. Peptidoglikan b. Lipoprotein c. Outer membrane
d. Lipopolisakarida e. Perilasmic space
2. Dinding sel : a. Peptidoglikan
b. Asam Teikoat dan Asam Teikuronat
c. Polisakarida
3. Kapsul 3. Kapsul
ukurannya lebih kecil seperti glukosa serta asam amino. Sedangkan pada molekul-molekul yang besar seperti antibiotik dan zat aktif ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) lebih sukar masuk ke dalam sel bakteri. Hal inilah yang menyebabkan Escherichia coli lebih resisten daripada Staphylococcus aureus pada penelitian ini (17; 22; 23).
Penelitian ini hanya dilaksanakan yaitu pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) sehingga dapat diketahuinya proses penghambatan pertumbuhan bakteri uji Staphylococcus aureus ATCC 6538 serta Escherichia coli ATCC 11229. Dan menurut Davidson dan Branen (2005), proses penghambatan aktivitas antikuman oleh senyawa aktif tanaman mampu diakibatkan beberapa faktor, yang diantaranya ialah :
1. Senyawa dinding sel bakteri mengalami gangguan
2. Permeabilitas membran sel bakteri mengalami peningkatan sehingga berakibat kehilangan komponen penyusun sel
3. Enzim metabolik mengalami inaktifasi 4. Material genetik mengalami ketidakutuhan
Didasarkan pendapat Yamashita et al (2012), bahwa proses penghambatan antibakteri terjadi akibat adanya perlekatan antara zat aktif antibakteri dengan permukaan sel bakteri atau zat aktif yang terkandung di dalam ekstrak melakukan difusi ke bagian dalam dari sel bakteri.
Pada riset Alvita Widyastuti (2010), efektifitas ekstrak kayu secang dalam menghambat pertumbuhan Shigella dysentriae ialah kadar 5 gram. Dari penelitian ini, ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) mempunyai efek antibakteri pada Escherichia coli ATCC 11229 serta Staphylococcus aureus ATCC 6538.
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) memiliki aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli ATCC 11229 dan Staphylococcus aureusATCC 6538 secara in vitro.
2. Ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) memiliki aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureusATCC 6538 bermula pada seri konsentrasi 20% b/v - 100% b/v akan tetapi potensi antibakterinya tidak signifikan jika dikomparasi terhadap kontrol positif (Amoksisilin).
3. Ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) memiliki aktivitas antibakteri yang sangat kecil terhadap pertumbuhan Escherichia coli ATCC 11229 dan jauh lebih efektif dibandingkan antara kontrol positif (Kloramfenikol) dengan ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn).
B. Saran
1. Perlunya dilaksanakan penelitian lebih komprehensif dan presisi pada masa mendatang mengenai kandungan zat aktif dari kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) serta mekanisme aksinya dalam proses penghambatan sebagai antibakteri.
3. Perlunya dilakukan uji aktivitas kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) dengan menggunakan metode pengukuran aktivitas antibakteri yang lain. 4. Perlu dilakukan uji aktivitas kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn)
yang lain seperti antioksidan, antiartritis, maupun antidiabetik dan lain sebagainya.
5. Perlu dilakukan uji aktivitas antibakteri lanjutan terhadap ekstrak etanol kayu tanaman secang (Caesalpinia sappan Linn) secara in vivo atau metode dilusi. 6. Perlunya kerjasama dengan pihak yang ahli dalam bidang tanaman obat
sehingga hasil penelitian dapat dikembangkan pada langkah berikutnya.
7. Perlunya pengambilan tanaman sebagai bahan uji yang sesuai dengan habitat asalnya.
DAFTAR PUSTAKA
1. Yuwono A., 2013. Keanekaragaman Hayati. JakartaKementerian Lingkungan HidupRepublik Indonesia. http://www.menlh.go.id/harikeanekaragam an-hayati-22-mei-2013/ (Diakses oktober 2013)
2. Badan Pengawas Obat dan Makanan RI., 2005. Pedoman Cara Pembuatan Obat Tradisional Yang Baik. Jakarta : BPOM RI
3. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia., 2012. Profil Data Kesehatan Indonesia Tahun 2011. Jakarta. http://www.depkes.go.id (Diakses oktober 2013)
4. Badan Pengawas Obat dan Makanan RI., 2013. Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan Makanan Republik Indonesia Nomor 28 Tahun 2013. Jakarta : BPOM RI
5. Badan Pusat Statistik RI., 2012. Indikator Kesehatan 1995-2011. Jakarta. Badan Pusat Statistik Republik Indonesia. http://www.bps.go.id/tab_ sub/view.php?kat=1&tabel=1&daftar=1&id_subyek=30¬ab=33
(Diakses oktober 2013)
http://www.who.int/world-health-day/2011/WHD201_FS_EN.pdf
(Diakses september 2013)
7. WHO., 2013. Antimicrobial Resistance. World Health Organisation. http://www.who.com (Diakses september 2013)
8. Holloway K, Dijk L.V., 2011. The World Medicines Situation 2011 Rational Use Of Medicines. Geneva : World Health Organization
9. Batubara I, Mitsunaga T, Ohashi H., 2009. Screening anticne potency of Indonesian medicinal plants : antibacterial, lipase inhibition, and antioxidant activities. Journal of Wood Science.
http://link.springer.com/article/10.1007/s10086- 008-1021-1 (Diakses desember 2013)
10.Kurniati N, Prasetya A.T, Winarni., 2012. Ekstraksi Dan Uji Stabilitas Zat Warna Brazilein Dari Kayu Secang (Caesalpinia Sappan L.). Semarang. Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Semarang. Indo. J. Che. Sci. http://journal.unnes.ac.id/sju/index.php/ijcs (Diakses september 2013)
11.Prastiwi B.Y., 2008. Pengaruh pH dan Lama Pemanasan Terhadap Perubahan Warna dan Intensitas Warna pada Kayu Secang
(Caesalpinia Sappan L.). Fakultas Keguruan Dan Ilmu Pendidikan Universitas Muhammadyah Malang.
12.Hemalatha K., 2011. Wound Healing Activity Of Heartwood Extracts Of Caesalpinia Sappan Linn. (Caesalpiniaceae). www.deccanpharma journals.com (Diakses september 2013)
13.Saenjum C, Chaiyasut C, Kadchumsang S, Chansakaow S, Suttajit M., 2010. Antioxidant activity and protective effects on DNA damage of
14.Wang Y.Z, Sun S.Q, Zhou Y.B., 2011. Extract of the dried heartwood of Caesalpinia sappan L. attenuates collagen-inducedarthritis. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21557995 (Diakses desember 2013)
15.Laxminarayan R, Duse A, Wattal C, Zaidi A.K, Wertheim H.F, Sumpradit N, Vlieghe E, Hara G.L, Gould I.M, Goossens H, Greko C, So A.D, Bigdeli M, Tomson G, Woodhouse W, Ombaka E, Peralta A.Q, Qamar F.N, Mir F, Kariuki S, Bhutta Z.A, Coates A, Bergstrom R, Wright G.D, Brown D.E, Cars O., 2013. Antibiotic resistance the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases Commission. http://dx.doi.org/10.1016/S14733099(13)70318-9 (Diakses januari 2014)
16.Notoatmojo, Soekidjo., 2010. Metodologi Penelitian Kesehatan. Jakarta : Rineka Cipta
17.Brooks, G.F, Janet, S.B, Stepens, A.M., 2007. Jawetz, Melnick, Adellberg Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 23.Alih bahasa Hartanto et al. Jakarta : EGC.
18.Backer, C. A, Van d’hen Brink Jr, R. C. B., 1968. Flora of Java (Spermatophytes only) vol I dan II. Groningen The Netherland : Wolters Noordhoff N. V
19.Tjitrosoepomo, G., 2007. Taksonomi Tumbuhan Spermatophyta.Yogyakarta : Gadjah Mada University Press
20.Van Steenis, C.G.G.J., 2005. Flora. Jakarta : Penerbit PT. Pradnya Paramita. 21.Azwar, Agoes., 2010. Tanaman Obat Indonesia. Jakarta : Salemba Medika
22.Cohen, G, N., 2011. Microbial Biochemistry-The outer membrane of gram
negative bacteria. Springer Science Bussines Media vol 26; 11-16.
