Oleh : Hamong Suharsono

KARAKTERISASI PROTEIN SUB UNIT PILI 49.6 kDa HELICOBACTER PYLORI DAN POTENSINYA SEBAGAI ANTIGEN DIAGNOSTIK DALAM

STUDI IN VITRO DAN IN VIVO

(Kajian pada hewan model mencit)

Oleh : Hamong Suharsono

PENDAHULUAN

Latar belakang

• Adanya bakteri di dalam lambung mamalia, diketahui sejak abad ke 19, hal tersebut mematahkan paradadigma daya bakterisidal asam lambung, (Nunes, 1998)

• Pada awal tahun 1980 Barry Marshal dan Robin Warren menemukan bakteri yang diisolasi dari biopsi lambung menemukan bakteri yang diisolasi dari biopsi lambung manusia yang disebut Helicobacter pylori (H. pylori).

• H. pylori adalah bakteri gram negatif , berbentuk spiral, mempunyai flagella , dan hidup menempel pada sel-sel epithel mukosa lambung (Ruggiero et al. 2014)

• Kehadiran H. pylori di lambung berkaitan erat dengan

kejadian chronic atropic gastritis, peptic ulcer dan gastric

lymphoma/cancer.(Nunes,1998)

Mengapa tertarik dengan molekul hemagglutinin H. pylori ?

1.

Sampai saat ini H. pylori merupakan satu-satunya bakteri yang diketahui mampu menyebabkan kanker lambung pada manusia (Clyne, et al. 2007)

2.

Pernyataan dari WHO yang menggolongkan H.

2.

Pernyataan dari WHO yang menggolongkan H.

pylori sebagai bakteri karsinogen tipe 1.sejajar dg hepatitis type B dan C

3.

Kebanyakan penelitian yang telah dilakukan difokuskan pada post infeksi H. pylori pada

lambung, sementara itu patogenesis awal terjadinya

infeksi belum banyak diteliti.

Studi Pendahuluan (Suharsono, et al. 2009)

130 kDa 95 kDa 72 kDa 55 kDa 36 kDa

28 kDa

1. MARKER PROTEIN 2. POTONGAN 8 3. POTONGAN 4 4. POTONGAN 5 5. POTONGAN 7 6. POTONGAN 3 7. POTONGAN 6 8. POTONGAN 2

49,6 kDa

28 kDa 17 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 9

8. POTONGAN 2 9. POTONGAN 1

Analisis SDS-PAGE menunjukkan adanya beberapa pita protein pili HP, namun 1 pita protein dengan BM 49,6 kDa. nampak paling dominan. Protein ini cukup unik dan belum ada yang melaporkan. Oleh karena itu sangat

penting diteliti untuk membuktikan apakah protein 49,6 kDa. ini merupakan molekul hemaglutinin yang bersifat adhesi, antigenik dan protektif ???

Rumusan Masalah

1. Apakah protein pili 49,6 kDa. H. pylori merupakan molekul hemaglutinin dan bersifat adhesi pada sel epitel lambung ?

adhesi pada sel epitel lambung ?

2. Apakah antibodi terhadap protein pili 49,6 kDa.

H. Pylori, mempunyai daya hambat adhesi dan bersifat protektif. ?

3. Apakah protein pili 49,6 kDa. H. pylori bersifat

imunogenik ?

Tujuan Penelitian

1. Membuktikan protein pili 49,6 kDa. H. pylori merupakan molekul hemaglutinin dan bersifat adhesi pada sel epitel lambung.

2. Membuktikan antibodi terhadap protein pili 49,6 kDa. H. Pylori, mempunyai daya hambat adhesi dan bersifat protektif.

3. Membuktikan protein pili 49,6 kDa. H. pylori

bersifat imunogenik.

Manfaat Penelitian

Berkontribusi secara ilmiah, melalui penemuan

protein yang bersifat imunogenik dan

imunodominan sebagai kandidat vaksin dan

bahan diagnosis, untuk pencegahan dan

diagnosa akibat patogenesis infeksi H. pylori

diagnosa akibat patogenesis infeksi H. pylori

Flagella

Sebagai alat gerak & kemotaksis Dalam usaha kolonisasi mukosa

Urease

Menetralkan asam lambung

(Amonia) melukai mukosa lambung

Lipopolisakarida

Faktor perlekatan ke sel inang Inflamasi (peradangan)

Outer Proteins

Melekat pada sel inang

TINJAUAN PUSTAKA

Faktor-faktor virulen dari H.pylori (Tambe, 2007)

Eksotoksin

• Vacuolating toksin (vacA) Melukai mukosal gastric

Enzim Sekretori

• Mucinase, protease, lipase Melukai mukosal gastric

T4SS T4SS

Strukturnya menyerupai pili Untuk menginjeksi efektors

Efektor (cagA, dll)

Actin remodelling

IL-8 induction, host cell growth and apoptosis inhibition

1. Mula-mula terjadi perakitan pada sistem sekresi tipe IV 2. kemudian muncul sinyal

dari sel hospes/sel epitel (integins α₅ dan β₁)

3. Sinyal tersebut

menginduksi pili, sehingga menyebabkan

pertumbuhan pili

Peranan pili dalam patogenesis H.pylori (Kwok, et.al., 2007)

pertumbuhan pili

4. Terjadi aktivasi integrins dan penempelan pili, yang dilanjutkan dengan Aktifasi FAK dan Src

5. CagA kemudian

diinjeksikan melewati pili

kemudian melekat pada integrin ab pada dinding sel epitel

CagY dan CagL membentuk struktur pili T4SS. Pada Shigella flexneri dan bakteri gram negatif yang berhubungan dengan eukaryotik disebut type III secreton (Blocker et al. 2001;Galan 2006 ).

CagA diinjeksikan

Peranan sub unit CagA dalam proses kolonisasi dan kerusakan sel mukosa lambung

CagA diinjeksikan kedalam sel epitel

Injeksi CagA menimbulkan dampak lokal berupa kerusakan pada hubungan antar sel dan dampak pada sel keseluruhan berupa rusaknya sitoskeleton (rangka sel).

Dampak lainnya adalah aktivasi gen yang berkaitan dengan proses peradangan

Peranan adhesin pada proses interaksi H.pylori dengan sel inang

Aktifitas Urease, produksi ammonia dan perpindahan ke periplasma

Adhesin yang utama : BabA dan SabA, protein CagA dipindahkan melalui pili dipindahkan melalui pili T4SS serta akibat yang ditimbulkannya

Dampak berupa kerusakan sel akibat sekresi VacA

? ? ? ?

KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN

Kerangka Konseptual

H. pylori

Kolonisasi

Menempel pada sel epitel lambung mencit (Mol. Adhesi)

Receptor pada sel epithel

Manifestasi klinik:

-Ulkus gaster -Ulkus duodenum -Gastritis akut -Gastritis kronik -MALT limfoma -Kanker lambung

Infeksi

Rumusan masalah 1.

Rumusan masalah 3:

Apakah protein pili 49,6 kDa H.pylori merupakan molekul hemaglutinin dan bersifat adhesi pada sel epitel lambung ?

Apakah protein pili 49,6 kDa H.pylori bersifat imunogenik ?

Rumusan masalah 2.

Apakah antibodi terhadap protein pili49,6 kDa H. Pylori, mempunyai daya hambat adhesi dan bersifat protektif. ? Faktor virulensi:

Urease, CagA, VacA

H ^IPOTESIS P ^ENELITIAN

1. Protein pili 49,6 kDa. H. pylori merupakan molekul hemaglutinin dan bersifat adhesi pada sel epitel lambung.

2. Antibodi terhadap protein pili 49,6 kDa. H. Pylori, mempunyai daya hambat adhesi dan bersifat protektif.

1. Protein pili 49,6 kDa. H. pylori merupakan molekul hemaglutinin dan bersifat adhesi pada sel epitel lambung.

2. Antibodi terhadap protein pili 49,6 kDa. H. Pylori, mempunyai daya hambat adhesi dan bersifat protektif.

protektif.

3. Protein pili 49,6 kDa. H. pylori bersifat imunogenik.

protektif.

3. Protein pili 49,6 kDa. H. pylori bersifat imunogenik.

MATERI DAN METODA

dibiakkan

H. pylori

(Mataram) Isolasi pili

(pili cutter)

Konfirmasi dengan mikroskop

elektron

Karakterisasi dan Isolasi

Kerangka Operasional Penelitian Tahap 1

Elektroelusi Karakterisasi dan Isolasi protein 49,6 kDa. (SDS-

PAGE) Uji In Vitro

• Hemaglutinasi

• Uji adhesi/ IHK

• Uji hambatan adhesi

Elektroelusi 49,6 kDa.

Lanjutan…

dibiakkan

H. pylori

(Mataram) Isolasi pili

(pili cutter)

Konfirmasi dengan mikroskop

elektron Karakterisasi dan Isolasi

Kerangka Operasional Penelitian Tahap 2

Elektroelusi Karakterisasi dan Isolasi

protein 49,6 kDa. (SDS- PAGE

Uji In Vivo

• Produksi Ab pada kelinci

• Uji titer Ab ELISA (sensitifitas)

• Uji dot blot & WB (spesifisitas)

• Uji vaksinasi/tantang

• Uji diagnostik Elektroelusi

49,6 kDa.

Tahap I (uji In Vitro).

1. Konfirmasi isolasi pili dengan pili cutter

Dengan pemeriksaan mikroskop elektron, terbukti bahwa pili H.pylori dapat diisolasi secara murni (Metoda Sumarno, 2000;

Agustina et al. (2012).

Hasil dan Pembahasan

Hasil ini sesuai dengan publikasi Ehara et al. 1991 bahwa Fimbriae (pili) pada Vibrio Cholerae dapat dibuktikan dengan mikroskop

elektron, menjulur extra-cellularly dan merupakan molekul HA.

Pili terpisah dari sel H. pylori Sel H. pylori utuh (panah) Pili Vibrio Cholera (Ehara et al. 1991)

2. Profil protein pili H. pylori dengan SDS-PAGE

Lanjutan…

Protein pili mengandung empat pita protein utama dengan BM 40-64 kDa, dan protein target 49.6 kDa muncul konsisten dan jelas.

konsisten dan jelas.

Sangat sulit mendapatkan satu pita protein target (49,6 kDa) karena adanya banyak faktor virulen yang terkandung dalam 1 unit protein. Tenaya, M. et al,1998 melaporkan 13 pita protein utama utk. isolasi 1 pita protein 72 kDa.;

Jungblut P.R et al. 2000, melaporkan 152 protein H. pylori (termasuk 9 faktor virulen dan 28 antigen)

3. Uji Hemaglutinasi dengan protein pili

Lanjutan…

Fraksi III

mempunyai daya HA paling tinggi (1/16), dan kontrol menunjukkan nilai

Fraksi I Fraksi II Fraksi III

Kontrol (PBS)

menunjukkan nilai HA yang negatif

Uji HA ini membuktikan: protein pili H. pylori 49,6 kDa adalah molekul adhesin dengan daya HA cuktp tinggi. Molekul adhesin pada pili Shigella dysentriae dengan MW 49,8 kDa (Agustina et al. 2012) dan pili protein 250 kDa Bordetella pertussis (Inatsuka et al. 2005) juga dilaporkan mempunyai HA dengan potensi yang cukup tinggi.

Fraksi III

Kontrol (PBS)

4. Uji ^Western Blot Protein pili

Lanjutan…

Terjadi reaksi antara protein pili 49,6 kDa dengan antiserum anti protein yang sama.

Protein pili 49,6 kDa terdeteksi secara konsisten dan dominan.

secara konsisten dan dominan.

Walaupun hanya 1 pita protein pili 49,6 kDa yang digunakan untuk imunisasi kelinci, terjadi reaksi terhadap lebih dari 1 pita protein.

Hasil yang sama juga dilaporkan oleh Tenaya, IW.M. et al.1998, bahwa walaupun hanya 1 pita protein (72 kDa) digunakan untuk mengimunisasi kelinci, terjadi reaksi lebih dari 4 pita protein.

Phenomena ini diduga karena adanya pecahan protein akibat

proses denaturisasi pada uji SDS-PAGE.

Lanjutan…

5. Uji Adhesi dengan uji Imunositokimia)

A (protein 100 µg/ml) B (protein 50 µg/ml) C (protein 12,5 µg/ml)

Hasil ini menunjukkan: protein pili 49,6 kDa H.

pylori: protein imunogenik. Daya adhesi

protein pili dengan sel target juga dilaporkan oleh peneliti lain (Jeung S, W et al..2003;

Sukartaji et al, 2013).

Y= 0,06469X 0,411, R²= 0,957 dan p < 0,01

Terjadi adhesi protein pili 49,6 kDa. H.

pylori pada sel epithel lambung mencit secara positive correlation

Lanjutan…

6. Uji ^Hambatan Adhesi

Terjadi hambatan adhesi H. pylori pada sel epithel lambung mencit oleh antibodi anti protein pili 49,6 kDa.

Hambatan adhesi terjadi secara negative correlation : A (1:2), B (1:4) & C(1:8),

Hasil uji ini mengkonfirmasi bahwa protein pili 49,6 kDa bersifat imunogenik, dapat memacu indirect protective antibody. Pada kuman E. coli, protein pili 32,2 kDa dilaporkan mempunyai daya direct adhesion dan mampu mencegah perlekatan bakteri E. coli pada sperma manusia ( Sukarjati et al, 2013).

Y= 0,057^e-2.208X, R²⁼0,727 p=0,026.

Tahap II (uji In Vivo).

A. Protein pili 49,6kDa + adju.

cholera toxin sub-unit B;

B. Adju.cholera toxin sub-unit B, C. PBS,

D. Lambung mencit normal

Uji vaksinasi dengan uji tantang H. pylori hidup

Lanjutan…

A B

C

D

Hasil ini mengindikasikan bahwa protein sub unit pili 49,6 kDa: protein yang imunogenik. Belum ada laporan tentang protein H. pylori dapat mencegah kerusakan sel epithel lambung pasca uji tantang.

Hal ini mengindikasikan bahwa protein pili 49,6 kDa mungkin dapat

digunakan sebagai kandidat vaksin yang potensial

Tahap III (uji Diagnostik).

1. Uji Dot Blot

Lanjutan…

Mencit 1

Mencit 2

Uji Dot blot sero-conversi dan protein pili 49,6 kDa dapat mengenali antibodi akibat infeksi oral H. pylori

0 , 2, 4 M

inggu pasca infeksi H.pylori)

Mencit 3

Hasil ini menandakan bahwa infeksi H. pylori memberikan respon

humoral dan dapat dideteksi secara serologi, menggunakan protein pili

49,6 kDa. Dengan demikian protein ini sangat potensial bila digunakan

dalam diagnostik.

2. Uji ELISA

Lanjutan…

• Antibodi mencit terhadap kuman H. pylori, dapat di deteksi dengan uji ELISA, namun antibodi dari mencit normal tetap negatif.

• Uji validasi (Metoda Sugiyono, 2006) uji ELISA ini mempunyai sensitivitas dan spesifisitas masing-masing : 96%. (48/50 X 100%)

Skematik uji

ELISA

Protein pili 49,6 kDa) Antibodi anti H. pylori

Anti-mouse HRP (Conjugate) HRP subtrat.

ELISA

Hasil ini menandakan: infeksi H. pylori dapat dideteksi secara serologi

(ELISA), menggunakan protein pili 49,6 kDa. Belum ada laporan penggunaan protein ini dalam uji diagnostik, sehingga dapat digunakan untuk diagnosa serologi infeksi H. pylori terutama terkait kejadian peptic ulcer.

Kesimpulan dan Saran Umum

1. Kesimpulan umum

Telah terbukti bahwa protein pili 49,6 kDa. H. pylori adalah molekul HA dan bersifat adhesi pada sel epitel lambung, mempunyai daya hambat adhesi dan bersifat imunogenik dan Protektif

2 Kesimpulan khusus:

1. Secara in Vitro, protein pili H. pylori BM 49,6 kDa. adalah 1. Secara in Vitro, protein pili H. pylori BM 49,6 kDa. adalah protein HA yang merupakan molekul adhesi pada sel epitel lambung.

2. Dalam uji In Vitro juga diketahui bahwa antibodi protein pili 49,6 kDa H. Pylori, mempunyai daya hambat adhesi.

3. Protein pili BM 49,6 kDa. secara In Vivo bersifat imunogenik

dan protektif dalam mengurangi rusaknya epithel lambung

pasca uji tantang dengan H. pylori patogen.

Saran-Saran:

1. Protein sub pili 49,6 kDa. H.pylori diketahui

mempunyai sifat imunogenik dan protektivitas yang

potensial. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian pembuatan protein rekombinan untuk kepentingan vaksin dan diagnostik.

2. Hasil studi pada hewan percobaan seyogyanya dapat

diaplikasikan pada manusia , sehingga hasil penelitian

mempunyai nilai tepat guna dan aplikatif.

TERIMA KASIH