BAHAN DAN METODE. Waktu dan Tempat

(1)

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan April 2005 sampai dengan September 2006. Penelitian dilakukan di Laboratorium Pascapanen, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian Bogor; Laboratorium Hewan Percobaan, FATETA-IPB; dan Laboratorium Histologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB.

Bahan dan Alat Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain: Gabah dan beras giling sebanyak 10 varietas berasal dari Balai Penelitian Padi, Sukamandi. Varietas tersebut terdiri atas 4 varietas lokal (Pandan wangi, Rojolele, Bengawan Solo, dan Cenana yaitu beras merah dari Bali), serta 6 varietas unggul baru, yaitu 2 varietas beramilosa rendah (Memberamo dan Lusi), 2 varietas beramilosa sedang (Celebes dan Ciherang), dan 2 varietas beramilosa tinggi (Batang Piaman dan Cisokan). Teh hijau diperoleh dari Kebun Percobaan Pasir Sarongge, Cianjur. Untuk pengujian aktivitas hipoglikemik secara in vivo digunakan tikus putih strain Sprague Dawley jantan.

Bahan-bahan kimia untuk analisis, antara lain: α-amilase, alkohol, amiloglukosidase, horseradish peroksidase, chromogenico dianisidine, NaOH, etanol, Kalium Iodida, buffer tris maleat, enzim termamyl, enzim pankreatin, KOH, buffer Na-asetat, glukosa oksidase, HCLO4, indikator phenol red, pereaksi Cu, pereaksi Nelson, glukosa bubuk murni, dan buffer Na-fosfat. Untuk analisis histologi antara lain digunakan: NaCl fisiologis, larutan Bouin (campuran asam pikrat jenuh, Formalin, dan asam asetat glasial dengan perbandingan 15:5:1), alkohol absolut, xylol, parafin, gliserin, pewarna Hematoxylin dan Eosin, NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4.12H2O, monoklonal anti-insulin (Sigma I2018), H2O2, metanol, akuades, diaminobenzidine (DAB), DAKO envision peroxidase (Code No. K1491) dan bahan perekat preparat (neophren:toluen = 1:9). Selain itu

(2)

digunakan aloksan (Sigma A6313) untuk membuat hewan model diabetes melitus, sekam, serta bahan-bahan untuk ransum hewan percobaan, yaitu kasein, minyak jagung, vitamin (Fitkom), mineral mix, dan selulosa.

Alat

Peralatan yang digunakan yaitu: glukometer, HPLC, Soxhlet, Kieljtek Protein Analyser, rotary evaporator, sonde, freeze dryer, oven, spektrofotometer, ekstraktor, tanur, pH meter, water bath, grinder, hot plate, centrifuge, dan neraca analitik, serta alat-alat gelas. Untuk pembuatan produk diperlukan rice cooker, dandang bertekanan (presto), kompor, panci serta perlengkapan lain untuk uji organoleptik.

Peralatan untuk analisis histologi antara lain: Tissue embedding console, bunsen, cetakan, gelas obyek, gelas penutup, kotak preparat, keranjang preparat, jar, stop watch, mikrotom, mikroskop, pipet Eppendorf, magnetic stirer, mikrotip, kertas label dan aluminium foil, serta alat-alat gelas. Untuk pemeliharaan hewan percobaan diperlukan kandang plastik, tempat pakan dan minum tikus percobaan, serta peralatan untuk pembuatan ransum.

Metode Penelitian

Penelitian ini dibagi dalam empat tahapan percobaan. Masing-masing tahapan percobaan, diuraikan sebagai berikut:

Percobaan 1. Penapisan Aktivitas Hipoglikemik danAnalisis Komposisi Kimia Berbagai Varietas Beras Indonesia

Sepuluh varietas beras terdiri atas 4 varietas lokal (Pandan wangi, Rojolele, Bengawan solo dan Cenana/ beras merah dari Bali) serta 6 varietas unggul baru, yaitu 2 varietas beramilosa rendah (Memberamo dan Lusi/ketan), 2 varietas beramilosa sedang (Celebes dan Ciherang) dan 2 varietas beramilosa tinggi (Batang Piaman dan Cisokan), diuji aktivitas hipoglikemiknya menggunakan tikus percobaan. Sampel beras digiling dengan derajat sosoh 90%. Sebagai pembanding digunakan beras ponni herbal Taj Mahal (beras impor yang mencantumkan klaim sesuai untuk penderita diabetes).

Formatted: Finnish

Formatted: Finnish Deleted: pagoda

Deleted: k

Deleted: serta Evaluasi Sifat

Fisiko

(3)

Sebanyak tiga varietas yang memiliki aktivitas hipoglikemik tertinggi dan beras Taj Mahal sebagai pembanding diuji komposisi kimianya, terutama yang berkaitan dengan indeks glikemik. Analisis meliputi: komposisi proksimat beras (air, abu, lemak, protein dan karbohidrat), pati, komposisi amilosa dan amilopektin, gula total, pati resisten, serat pangan dan daya cerna pati in vitro. Berdasarkan hasil analisis, ditentukan satu varietas terpilih untuk diproses lebih lanjut menjadi beras fungsional untuk penderita diabetes melitus.

Uji Aktivitas Hipoglikemik

Pengujian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas hipoglikemik dari 10 varietas beras Indonesia dan beras Taj Mahal sebagai pembanding, menggunakan tikus percobaan (n = 6). Tikus putih (Ratus novergicus) strain Sprague-Dawley jantan dengan berat sekitar 150-200 g, dipuasakan selama satu malam, tetapi tetap diberi minum secara ad libitum. Keesokan harinya, kadar glukosa tikus diukur

menggunakan glukometer (pengukuran menit ke-0). Selanjutnya tikus diberi sampel ekstrak pati beras yang akan diuji aktivitas hipoglikemiknya. Pati beras dilarutkan dalam air dan diberikan secara oral (4.5 g/kg berat badan). Setelah 30 menit, tikus diberi larutan D-glukosa 10% sebanyak 1 ml secara oral. Tiga puluh menit kemudian, kadar glukosa darah tikus diukur dengan glukometer (pengukuran menit ke-30). Pengukuran kadar glukosa yang sama dilakukan pada menit ke-60, 90 dan 120. Hasil pengukuran kadar glukosa seluruh sampel beras yang diuji dibuat kurva dan dibandingkan aktivitas hipoglikemiknya.

Bentuk sampel uji pada percobaan ini ialah ekstrak pati beras. Sampel pati beras dipersiapkan dengan cara berikut: beras giling diproses menjadi tepung, kemudian ditambah air 1:3 (b/v) dan diblender sehingga diperoleh slurry. Selanjutnya slurry disaring, filtrat diuapkan sebagian airnya menggunakan rotary evaporator, kemudian dikeringbekukan menggunakan freeze dryer.

Pengukuran Kadar Glukosa Darah pada Tikus Percobaan

Kadar glukosa darah ditentukan dengan metode glucose oxidase biosensor,

menggunakan alat ”One Touch Ultra” (alat monitoring glukosa darah, diproduksi oleh Lifescan Johnson & Johnson Company, 2002). Darah diambil dari ekor

tikus, dengan cara ekor tikus uji dibersihkan lalu dipijat atau diurut

perlahan-Formatted: Font: Italic Deleted: Seluruh sampel Deleted: penelitian Deleted:

Deleted: sifat fisikokimia dan zat

gizinya

Deleted: (disebut: beras X)

Deleted: BI Deleted: buat Deleted: Deleted: vapor Deleted: menggunakan Deleted: B Deleted: I Deleted: BIl

(4)

lahan, kemudian bagian ujung ditusuk dengan jarum (lancet). Darah yang keluar kemudian ditempelkan pada strip glukometer (Soemardji 2004). Kadar glukosa darah akan terukur dan nampak pada layar glukometer setelah 5 detik, dinyatakan dalam mg/dl.

Kadar Amilosa (Khush et al. 1986)

Sampel tepung beras (60 mesh) sebanyak 100 g dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, ditambah 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1 N. Campuran tersebut disimpan pada suhu kamar selama 24 jam. Sampel kemudian ditambah air destilata sampai batas 100 ml, dan dikocok sempurna. Larutan pati diambil 8 ml, dimasukkan ke dalam tabung Autoanalyzer. Larutan segar (fresh working

solution) dipersiapkan dari 1 ml asam asetat 1 N dan 3 ml larutan stok iodine (2

mg iodine dan 200 mg potasium iodine per ml) dilarutkan sampai 100 ml. Sampel dan standar beras yang telah diketahui kadar amilosanya dianalisis menggunakan Technicon Autoanalyzer. Hasilnya dinyatakan sebagai persentase kadar amilosa beras giling, basis kering.

Perhitungan:

Faktor konversi (fk) = Cs/ A608 Cs = Kadar amilosa standar

A608 = Absorban larutan standar pada λ = 608 nm Kadar amilosa (%) = A608 x fk,

Dimana A608 = Absorbansi sampel pada λ = 608 nm

Kadar Air, metode oven (AOAC 1995)

Sampel sebanyak 0.2 gram ditimbang dalam wadah yang sudah diketahui beratnya, kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 100 – 1050C selama 2 jam, setelah itu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Pengeringan dilakukan lagi sebanyak 2 x selama 4 jam dan didinginkan lalu ditimbang, sehingga didapatkan sampel dengan berat yang konstan, selisih berat bahan sebelum dan sesudah penguapan merupakan jumlah air bahan.

Kadar air = Berat bahan awal-berat bahan akhir x100 % Berat bahan awal

Deleted: Tetesan d Deleted: diperoleh Deleted: alat Deleted: L Deleted: BI Deleted: ¶ Deleted: ¶

(5)

Daya Cerna Pati in vitro (Muchtadi 1989)

Prinsip metoda ini ialah pati dihidrolisis oleh enzim α-amilase. Kemudian maltosa yang dihasilkan diukur jumlahnya menggunakan spektrofotometer setelah direaksikan dengan asam dinitrosalisilat. Daya cerna pati sampel dihitung sebagai persentase relatif terhadap pati murni.

Prosedur analisis daya cerna pati sbb:

Suspensi tepung (1% dalam air destilata) dipanaskan dalam penangas air selama 30 menit sampai mencapai suhu 90ºC, kemudian didinginkan, diambil

sebanyak 2 ml larutan tepung, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah 3 ml air destilata dan 5 ml larutan bufer Na-fosfat 0.1 M, pH 7.0. Kemudian diinkubasikan dalam penangas air 37ºC selama 15 menit. Kedalam larutan tersebut ditambahkan 5 ml larutan enzim α-amilase dan diinkubasikan lagi pada suhu 37ºC selama 15 menit.

Kedalam tabung reaksi lain ditempatkan 1 ml campuran reaksi. Kemudian ditambahkan 2 ml pereaksi dinitrosalisilat, dan selanjutnya dipanaskan dalam penangas air 100ºC selama 10 menit. Setelah didinginkan, campuran reaksi diencerkan dengan menambahkan 10 ml air destilata. Warna oranye-merah yang terbentuk dari campuran reaksi diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer, panjang gelombang 520 nm.

Kadar maltosa dari campuran reaksi dihitung dengan menggunakan kurva standar maltosa murni yang diperoleh dengan cara mereaksikan larutan maltosa standar dengan pereaksi dinitrosalisilat menggunakan prosedur seperti diatas. Daya cerna pati sampel dihitung sebagai persentase relatif terhadap pati murni sebagai berikut:

Kadar maltosa sampel setelah reaksi enzim

Daya cerna = --- x 100

Kadar maltosa pati murni setelah reaksi enzim

Penentuan Kadar Serat Pangan

Penentuan serat pangan larut, serat pangan tidak larut dan serat pangan total dilakukan menggunakan metoda enzimatik (Asp et al. 1983 diacu dalam Muchtadi 1992), sebagai berikut:

Deleted: ¶ ¶ Deleted: .

(6)

Satu gram sampel dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kedalamnya ditambahkan 25ml bufer Natrium Fosfat, dan dibuat menjadi suspensi. Penambahan bufer dimaksudkan untuk menstabilkan enzim termamyl. Selanjutnya ditambah 100 μl termamyl, ditutup dan diinkubasi pada suhu 100oC selama 15 menit, sambil sesekali diaduk. Tujuan penambahan termamyl dan pemanasan ialah untuk memecahkan pati dengan menggelatinisasikan terlebih dahulu. Setelah dingin, ditambah 20 ml air destilata dan pH-nya diatur menjadi 1.5 dengan menambahkan HCl 4 M. Selajutnya ditambahkan 100 mg pepsin. Pengaturan pH hingga 1.5 dimaksudkan untuk mengondisikan agar aktivitas enzim pepsin maksimum.

Erlenmeyer ditutup dan diinkubasikan pada suhu 40o_{C dan diagitasi} selama 60 menit. Kemudian ditambah 20 ml air destilata dan pH diatur menjadi 6.8 dengan NaOH. Pengaturan menjadi pH 6.8 ditujukan untuk memaksimumkan aktivitas enzim pankreatin. Ditambahkan 100 ml enzim pankreatin. Ditutup dan diinkubasi pada suhu 40oC selama 60 menit sambil diagitasi. Selanjutnya pH diatur dengan HCl menjadi 4.5, disaring melalui

crucible kering yang telah ditimbang beratnya (porositas 2) yang mengandung

0.5 g celite kering (berat tepat diketahui). Dicuci dengan 2 x 10 ml air destilata.

Residu (Serat pangan tidak terlarut = IDF)

Hasil diatas dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 95% dan 2 x 10 ml aseton, lalu dikeringkan pada suhu 105o_{C, sampai berat tetap (sekitar 12 jam), dan} ditimbang setelah didinginkan di dalam desikator (D1). Selanjutny diabukan ke dalam tanur 500o_{C selama paling sedikit 5 jam, lalu ditimbang setelah} didinginkan dalam desikator (I1).

Filtrat (Serat pangan larut = SDF)

Volume filtrat diatur dengan air sampai 100 ml, lalu ditambah 400 ml etanol 95% hangat (60oC), diendapkan selama 1 jam. Selanjutnya disaring dengan

crucible kering (porositas 2) mengandung 0.5 celite kering, dicuci lagi dengan

2 x 10 ml etanol 78 %, dan 2 x 10 ml aseton

Deleted: BI

(7)

Penentuan Kadar Pati Resisten

Bahan yang diperlukan: Buffer tris maleat, α-amilase, pancreatic, etanol, KOH, asam asetat, enzim amiloglukosidase, buffer Na-asetat dan pereaksi untuk glukosa oksidase. Pelarut : Larutan enzim amilase 50 unit/ml dalam buffer tris maleat 0.1 M pH (4mμ calcium clorida), Etanol 80%, KOH 4M, Asam asetat 2M, Amiloglukosidase (200 unit/ml dalam buffer Na-asetat 0.1M, pH 4.5)

Prosedur analisis :

Sampel bebas lemak ditimbang sebanyak 100 mg, ditambah 10 ml larutan enzim amilase, kemudian dikocok pada suhu 37oC selama 16 jam, ditambah 40 ml etanol dan dibiarkan selama 1 jam. Lalu disentrifuse (400 rpm), endapan dibilas dengan etanol 80% (2x), dan dikeringkan (60oC), ditambahkan 1.56 ml H2O kemudian ditambah lagi dengan 1.5 ml KOH 4 M. Dikocok selama 30 menit pada suhu kamar dan ditambah 12 ml H2O

Campuran diatas diambil 1.5 ml, ditambahkan 0.65 asam asetat 2 M (mencapai pH 4.5) dan 0.1 ml amiloglukosidase. Kemudian diinkubasikan selama 90 menit suhu 65o_{C. Kemudian diambil 2 ml untuk penentuan glukosa} dengan metoda glukosa oksidase.

Penentuan Glukosa Oksidase

Prinsip metode ini ialah glukosa dioksidasi secara enzimatis dengan glukosa oksidase menghasilkan H2O2. Selanjutnya, H2O2 akan membentuk warna stabil dengan bantuan enzim peroksidase. Intensitas warna tergantung dari konsentrasi glukosa.

Reagen yang diperlukan meliputi: Glukosa oksidase 1000 unit/ml, Horseradish peroxidase, Chromogenico-dianisidine 2 HCl, Buffer asetat pH 5.5 (larutkan 13.608 gr NaOAc.3H2O dan dijadikan 1 liter dengan H2O, ditambahkan 2.7 ml HOAc dan jika perlu diatur dengan NaOAc atau HOAc)

Larutan penguji : Dilarutkan 40 mg chromogen, 40 mg horseradish peroxidase dan 0.4 ml glukosa oksidase di dalam buffer asetat dan encerkan hingga volume 100 ml dengan buffer serupa. Larutan standar : Glukosa 1 mg/ml (didiamkan selama satu jam agar terjadi mutarorasi). Persiapan kurva standar dan dilakukan penentuan glukosa dalam contoh

Formatted: Bullets and

Numbering Deleted: ¶ D Deleted: 16 jam Deleted: , Deleted: BI Deleted: BI

(8)

Percobaan 2. Pengembangan Proses Pembuatan Beras Pratanak dan Beras Instan Fungsional

Beras fungsional dalam penelitian ini dibuat dari beras Memberamo, yaitu varietas beras terpilih pada Percobaan 1, yang diberi perlakuan ekstrak teh hijau. Proses pengolahan dalam pembuatan beras fungsional yang dilakukan adalah: pengolahan beras pratanak (parboiled rice) dan pengolahan beras instan. Untuk mendapatkan beras fungsional tersebut, maka pada percobaan ini dibagi dalam tiga tahap yaitu: a) Penentuan kondisi ekstraksi teh hijau, b) Penentuan kondisi proses pengolahan beras pratanak dan beras instan, dan c) Proses pengolahan beras pratanak fungsional dan beras instan fungsional

a) Penentuan Kondisi Ekstraksi Teh Hijau

Pada tahap ini dilakukan optimasi ekstraksi teh hijau sehingga didapatkan kondisi optimum ekstraksi (waktu, suhu dan rasio teh dengan air). Ekstrak teh hijau dalam bentuk filtrat, dipekatkan menggunakan rotari evaporator, hingga diperoleh konsentrat. Analisis yang dilakukan meliputi rendemen dan aktivitas antioksidan.

Optimasi Ekstraksi Teh Hijau

Tujuan dari tahapan ini adalah mendapatkan metode ekstraksi teh hijau yang optimum. Ekstraksi dilakukan menurut metode Lee dan Widmer (2000) dengan modifikasi perlakuan suhu, waktu ekstraksi, dan perbandingan antara teh dengan air (Gambar 6).

Teh hijau kering dihancurkan dengan dish mill, kemudian diayak menggunakan ayakan goyang ukuran 32 mesh untuk mendapatkan ukuran teh hijau yang kecil dan seragam. Bubuk teh tersebut kemudian diekstrak dengan cara dilarutkan dan diaduk dalam air panas suhu 75, 85, dan 950C dengan perbandingan masing-masing teh dengan air sebesar 10:100, 15:100, dan 20:100 (b/v). Waktu ekstraksi yang digunakan adalah 2, 4, 6, 8, 10, 15 dan 20 menit. Teh yang telah diekstrak tersebut kemudian disaring dengan alat saring vacuum untuk mendapatkan ekstrak teh murni. Kemudian ekstrak teh murni dianalisis TPT (total padatan terlarut) dengan metode oven dan refraktometer. Hasil TPT oven dihitung rendemennya.

(9)

Analisis rendemen dihitung pada setiap perlakuan suhu (75, 85, dan 950_C), dengan pengaruh kombinasi perlakuan waktu ekstraksi (2, 4, 6, 8, 10, 15 dan 20 menit) dan rasio teh dengan air (10:100, 15:100, dan 20:100 (b/v) untuk mendapatkan kondisi rasio teh dengan air serta waktu ekstraksi optimal pada setiap perlakuan suhu. Tiga sampel dengan kombinasi optimal dari setiap perlakuan suhu tersebut dianalisis rendemen dan aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH, sehingga didapatkan satu kombinasi perlakuan suhu, waktu, dan rasio teh dengan air yang optimal untuk digunakan dalam penelitian selanjutnya.

Gambar 6. Diagram alir proses optimasi ekstraksi teh hijau.

Analisis Ekstrak Teh

Total Padatan Terlarut (metode oven)

Cawan kosong dikeringkan dalam oven 1000_{C selama 15 menit dan} didinginkan dalam desikator, lalu ditimbang (a gr, untuk cawan alumunium didinginkan selama 10 menit dan cawan porselin didinginkan selama 20 menit). Kemudian sampel yang telah dihomogenkan dengan cawan ditimbang dengan neraca analitik sejumlah kurang lebih 5 gram (x gr) dengan cepat. Cawan beserta

TEH HIJAU Penggilingan Ekstraksi : Teh:air = 10:100; 15:100; 20:100 (b/v) t = 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20 menit T = 75, 85, 95ºC EKSTRAK TEH HIJAU Pengayakan (32 mesh) Penyaringan Deleted: BI

(10)

isinya ditempatkan di dalam oven selama 6 jam. Kontak antar cawan dengan dinding oven dihindarkan. Cawan dipindahkan ke dalam deksikator untuk didinginkan, setelah dingin ditimbang kembali (y gr). Kemudian, dikeringkan kembali ke dalam oven sampai diperoleh berat yang tetap. (Apriyantono et al. 1989).

Perhitungan :

TPT (%bk) = y – a / x

a = berat cawan kosong kering (g) x = berat sampel awal (g)

y = Berat cawan + sampel kering

Total Padatan Terlarut ( Refraktometer ABBE)

Prisma refraktometer dibersihkan dengan alkohol, kemudian diteteskan sampel di atas prisma pengukuran, lalu ditutup. Alat refraktometer diarahkan ke cahaya dan dibaca skalanya (% brix).

Rendemen

Besarnya rendemen dihitung berdasarkan persentase berat serbuk ekstrak kering dibagi berat teh hijau kering yang diekstrak. Serbuk ekstrak kering diperoleh melalui hasil kali berat ekstrak murni teh dengan TPT oven. Rendemen ditentukan dengan rumus :

Rendemen = a/b x 100 % a : serbuk ekstrak kering

(berat ekstrak x TPT oven) b : berat sampel teh hijau

Pengujian Aktivitas Antioksidan.

Buffer asetat 100 mM 1 ml ( pH 5.5), 1.87 ml etanol dan 0.1 ml radikal

bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 3 mM dalam metanol dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian sebanyak 0.03 ml larutan sampel ditambahkan ke dalam tabung tersebut dan diinkubasi 250_{C selama 20 menit. Absorbansi yang} dihasilkan dibaca pada 517 nm. Penurunan absorbansi menunjukkan adanya aktivitas scavenging atau aktivitas antioksidan. Untuk pembuatan kurva standar

(11)

digunakan Trolox®_{, sehingga satuannya dinyatakan dalam TEAC (Trolox}

Equivalen Antioxidant Capacity). ( Kubo et al. 2002)

Rancangan Percobaan

Pada tahap optimasi proses ekstraksi teh hijau, rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Faktorial menggunakan dua faktor, yaitu rasio teh dengan air, dan waktu ekstraksi. Faktor rasio teh dengan air terdiri atas tiga taraf, yaitu: 10:100; 15:100 dan 20:100 b/v. Sedangkan faktor waktu ekstraksi terdiri atas tujuh taraf, yaitu 2; 4; 6; 8; 10; 15 dan 20 menit.

Model matematik umum yang digunakan adalah : Yijk = µ + Ai + Bj + (AB)ij + εijk

Keterangan :

Yijk = Rendemen hasil pengamatan dari faktor rasio teh dengan air level ke-i, faktor waktu ekstraksi level ke-j

µ = Nilai tengah populasi (rata-rata yang sesungguhnya) Ai = Pengaruh faktor rasio teh dengan air level ke-i,

Bj = Pengaruh waktu ekstraksi level ke-j

(AB)ij = Pengaruh interaksi antara rasio teh dengan air dan waktu ekstraksi εijk = Faktor galat (sisa)

Data diolah menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA). Jika terjadi beda nyata pada faktor perlakuan pada selang kepercayaan 95%, dilanjutkan dengan uji beda Duncan. Rancangan ini dilakukan untuk setiap taraf suhu (75; 85 dan 95ºC).

Untuk menentukan waktu ekstraksi, rasio teh dengan air dan suhu optimum dilakukan analisis data rendemen dan aktivitas antioksidan

Yij = µ + Ai + εij Keterangan

Yij = Nilai hasil pengamatan dari faktor A level ke-i, ulangan ke-j µ = Nilai tengah populasi (rata-rata yang sesungguhnya)

Ai = Pengaruh suhu ekstraksi εijk = Faktor galat (sisa)

Formatted: Justified Formatted: German (Germany) Formatted: German (Germany) Formatted: German (Germany) Formatted: German (Germany) Formatted: German (Germany) Formatted: German (Germany) Formatted: German (Germany) Formatted: German (Germany) Formatted: German (Germany)

Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Indent: Left: 0

cm

Formatted: Danish Formatted: Dutch

(Netherlands)

Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Indent: First line:

1,01 cm

Formatted: No underline Formatted: Font: Not Bold Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Font: Not Bold,

Swedish (Sweden)

Formatted: No underline Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Spanish (Spain-Modern Sort) Formatted Formatted Formatted _{... [2]} ... [1] ... [3]

(12)

Data diolah menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA). Jika terjadi beda nyatapada faktor perlakuan pada selang kepercayaan 95%, dilanjutkan dengan uji beda Duncan.

b) Penentuan Kondisi Proses Pengolahan Beras Pratanak dan Beras Instan

Pada tahap ini dilakukan penentuan cara pembuatan beras pratanak dan beras instan yang sesuai untuk diaplikasikan dalam pengolahan beras fungsional un tuk penderita diabetes melitus.

Proses Pembuatan Beras Pratanak

Pembuatan beras pratanak merupakan proses yang unik, karena tahap pengolahan dimulai pada saat bahan masih berbentuk gabah (Garibaldi 1972; De Datta 1981). Oleh sebab itu proses ini dikenal dengan istilah pratanak (parboiled). Cara pembuatan beras pratanak sangat beragam, namun pada prinsipnya melalui tiga tahapan proses, yaitu perendaman (steeping) di dalam air, pengukusan (steaming), dan pengeringan (drying). Sebelum proses pratanak dimulai, bahan yaitu gabah terlebih dahulu dilakukan pembersihan (precleaning). Beberapa perlakuan yang diaplikasikan untuk mendapatkan proses yang diinginkan, akan diuraikan dibawah ini.

Pembersihan

Tujuan pembersihan adalah untuk mendapatkan gabah yang bersih dari kotoran-kotoran yang terdapat dalam gabah seperti jerami, kerikil dan tanah. Cara yang biasanya dilakukan, yaitu cara pengapungan dengan air, sehingga gabah hampa dan jerami dapat mengapung di bagian atas instalasi pembersih. Cara lain menggunakan aspirator untuk memisahkan kotoran kecil dan ringan, atau menggunakan mesin pembangkit magnit untuk memisahkan kotoran besar tetapi ringan dan kotoran kecil tetapi berat.

Menurut Garibaldi (1972), kotoran-kotoran tersebut dapat mempengaruhi hasil pratanak. Selama perendaman kotoran akan terdekomposisi, terfermentasi dan meninggalkan suspensi di dalam air kotor. Air terpolusi ini kemudian terabsorbsi oleh gabah yang mempengaruhi flavor, bau dan warna bahkan mengurangi mutu pangan.

Formatted: Portuguese

(Brazil)

Formatted: Indent: Left: 0,62

cm, Hanging: 0,04 cm, Tabs: Not at 2,31 cm

Formatted: Justified Formatted: Font: Not Italic,

Portuguese (Brazil)

Formatted: Font: Not Bold,

Not Italic, Portuguese (Brazil)

Formatted: Indent: First line:

0,99 cm Deleted: ¶ Deleted: BI Deleted: (precleaning) Deleted: , dll Deleted: BI Deleted: s

(13)

Pembersihan gabah penting sekali guna mendapatkan kondisi optimum dan keseragaman hasil. Selain itu, tingkat kemurnian varietas yang tinggi akan menghasilkan beras pratanak yang bermutu bagus.

Perendaman

Perendaman merupakan tahap pertama di dalam pembuatan beras pratanak. Perendaman dilakukan pada suhu 60oC, dengan perbandingan gabah dan air 1:2 dan 1:3 dan dengan lama perendaman 4 jam sehingga menghasilkan kadar air gabah ± 30 %. Suhu yang terlalu tinggi akan menghasilkan kadar air gabah lebih dari 30 % dan waktu perendaman yang terlalu lama menyebabkan terjadinya fermentasi (Garibaldi 1972).

Pengukusan

Pengukusan atau pemasakan dilakukan dengan menggunakan presto pada tekanan 80 Kpa (= 0.7895 ATM), dan mampu menghasilkan gabah dengan sekam yang sedikit pecah. Dengan sedikit pecahnya sekam diharapkan pada proses tersebut ekstrak teh hijau dapat masuk ke dalam gabah.

Lama pemasakan dalam presto dilakukan dengan berbagai waktu

pemasakan yaitu 10, 15, 20 dan 25 menit untuk mendapatkan gabah yang cukup tergelatinisasi dengan sekam yang sedikit terbuka (pecah).

Gelatinisasi terjadi apabila suspensi pati dalam air dipanaskan. Perubahan selama terjadinya gelatinisasi yaitu, mula-mula suspensi pati keruh seperti susu, kemudian berubah jernih pada suhu tertentu tergantung pada jenis pati yang digunakan. Terjadinya translusi larutan pati tersebut biasanya diikuti oleh pembengkakan granula.

Pengeringan

Pengeringan terhadap gabah yang telah direndam dan dimasak harus dilakukan dengan segera untuk menghindarkan pertumbuhan jamur dan terjadinya fermentasi. Pengeringan ini merupakan tahap akhir dalam pengolahan gabah secara pratanak. Pengeringan gabah pratanak ini menggunakan oven yang dilakukan dalam 2 tahap untuk mendapatkan kadar air 12-14 %. Pengeringan tahap pertama, pada suhu 100o_{C hingga} mencapai kadar air 18-20 %.

Deleted: ¶

Deleted: BI

(14)

Gambar 7. Diagam alir proses pembuatan beras pratanak (parboiled rice).

Apabila suhu yang digunakan kurang dari 100o_{C maka akan} menambah waktu pengeringan, dan waktu pengeringan yang terlalu lama akan menyebabkan gabah terfermentasi. Sedangkan bila suhu pengeringan lebih dari 100oC, maka penguranga air terlalu cepat sehingga jumlah gabah retak akan semakin banyak dan beras yang patah akan semakin banyak saat dilakukan penggilingan. Untuk mencegah retak pada butir beras selama pengeringan, proses pengeringan dihentikan untuk sementara waktu apabila kadar air telah mencapai 18-20%, kemudian pengeringan dimulai lagi. Pengeringan tahap kedua dilakukan secara lambat untuk mencegah butir beras retak lebih banyak, yaitu pada suhu 60o_{C hingga}

Perendaman: suhu 60oC Air:gabah = 1:2 dan 1:3 Pemasakan: P= 80 kPa t = 10, 15, 20 dan 25 menit Pengeringan I, T = 100oC t = 35, 45, 55, 60 menit (Ka 18-20%) Penggilingan Pengeringan II, T = 60o_C t = 25, 30, 35, 40 menit (Ka <12-14%) Gabah Beras pratanak Tempering selama 3 jam

suhu kamar

Gabah pratanak

Kadar air 30%?

Tergelatinisasi?

Deleted: Apabila proses

pengeringan tahap pertama telah selesai maka diperlukan interval waktu selama 3 jam pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan proses pengeringan tahap kedua pada suhu 60o_{C, dengan variasi} waktu yaitu 25, 30, 35, dan 40 menit sampai mendapatkan kadar air 12-14%. Pengeringan secara perlahan-lahan bertujuan untuk menghindari terjadinya beras pecah saat penggilingan. Tahap penentuan proses beras pratanak disajikan pada Gambar 7.¶

(15)

mencapai kadar air 12-14 %. Pengeringan tahap pertama pada suhu 100o_C dilakukan dalam 4 variasi waktu yaitu: 35, 45, 55, dan 60menit untuk mencapai kadar air 18-20%.

Apabila proses pengeringan tahap pertama telah selesai maka diperlukan interval waktu selama 3 jam pada suhu kamar. Kemudian dilanjutkan proses pengeringan kedua pada suhu 60oC, dengan variasi waktu yaitu 25, 30, 35, dan 40 menit sampai mendapatkan kadar air 12-14%. Pengeringan secara perlahan-lahan bertujuan untuk menghindari terjadinya beras pecah saat penggilingan. Tahap penentuan proses beras pratanak disajikan pada Gambar 7.

Proses Pembuatan Beras Instan

Beras instan pada dasarnya sudah mengalami pemasakan awal dan gelatinisasi sampai tingkat tertentu di dalam air, atau dikukus, atau dilakukan keduanya. Beras yang dimasak sampai matang atau hampir matang tersebut kemudian dikeringkan sedemikian rupa hingga biji-biji beras menjadi banyak berpori dan dalam keadaan struktur yang terbuka. Hasil olahan akhir berupa biji-biji kering, yang lepas satu sama lain, tanpa menggerombol, dan besar volumenya 1.5-3.0 kali volume beras mentahnya. Air mendidih yang digunakan pada penyiapan akhir untuk penyajian harus dapat meresap ke dalam biji-biji beras dengan waktu yang relatif pendek.

Penentuan Kondisi Pengolahan Beras Instan

Secara umum, proses pembuatan beras instan terdiri atas 5 tahap, yaitu: 1) Pencucian, 2) Perendaman, 3) Pemasakan dengan tekanan, 4) Pembekuan, dan 5) Pengeringan. Diagram alir proses pembuatan beras instan dapat dilihat pada Gambar 8.

1) Pencucian

Beras varietas terpilih dari percobaan 1, dilakukan pencucian untuk menghilangkan pasir, tanah atau kotoran yang lain. Pencucian dilakukan hingga tidak ada lagi benda kotor terlihat. Pencucian dilakukan sebanyak 3 kali.

(Brazil)

Formatted: Line spacing:

(16)

2) Perendaman

Proses perendaman dilakukan dalam tiga suhu yang berbeda, yaitu: 30, 40 dan 50o_{C, masing-masing selama 2 jam. Tahapan} perendaman dilakukan untuk mendapatkan kadar air yang sesuai dengan persyaratan kadar air akhir setelah perendaman. Kadar air akhir yang diinginkan dalam proses perendaman yaitu 40%. Perbandingan air perendaman dan beras adalah 1:1, atau untuk setiap 100 g beras, digunakan air perendaman sebanyak 100 ml.

3) Pemasakan dengan Tekanan

Penentuan metode pemasakan dengan tekanan dilakukan dalam satu faktor yaitu waktu pemasakan. Pada perbandingan air dengan beras adalah 1:1 atau untuk 100 gram beras maka air pemasakan 100 ml. Pemasakan pada beras instan dilakukan dengan presto yang bekerja pada tekanan 80 Kpa. Penentuan waktu pemasakan dilakukan dengan tiga taraf yaitu 5, 10, dan 15 menit.

Tujuan perlakuan ini untuk mendapatkan nasi yang matang dan telah tergelatinisasi sempurna. Penentuan tingkat kematangan nasi mengikuti metode IRRI (1986). Kriteria mutu nasi yang telah matang yaitu pada nasi sudah tidak ada lagi bintik putih seperti tepung, tetapi telah berubah menjadi bening atau transparan.

4) Pembekuan

Proses pembekuan dilakukan secara cepat dan tidak boleh ditunda hingga nasi dingin. Perlakuan pembekuan pada beras instan dilakukan selama 24 jam pada suhu -4oC. Setelah tahap pembekuan, kemudian dilakukan proses thawing. Proses thawing dilakukan dengan suhu 50oC selama 5 menit, hal ini dilakukan agar beras instan tidak menggumpal.

5) Pengeringan

Pengeringan dilakukan pada suhu 60oC selama 4 jam hingga bahan menjadi kering dan berbentuk seperti kristal bening dan keras.

(17)

Uji k.a. 40%

Uji mutu tanak

Gambar 8. Diagram alir pembuatan beras instan.

c) Pengolahan Beras Pratanak Fungsional dan Beras Instan Fungsional

Tahap ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi ekstrak teh hijau optimum yang mempunyai aktivitas hipoglikemik terbaik dari masing-masing cara pengolahan beras fungsional. Beras fungsional antidiabetes diproses dari beras Memberamo yang diberi perlakuan ekstrak teh hijau [hasil tahap a)].

Pengolahan Beras Memberamo Pratanak Fungsional

Penentuan Konsentrasi Penggunaan Ekstrak Teh Hijau

Penentuan konsentrasi ekstrak teh hijau dilakukan dalam dua taraf, yaitu 7 dan 14%. Beras X Pencucian Perendaman Beras:air = 1:1; t = 2jam T: A1 = 30 o_C A2 = 40 o_{C; A3 = 50} o_C Permasakan bertekanan

P = 80 kPa; Beras: air = 1:1 t: 5 ; 10,15 menit Pembekuan t = 24 jam; T = -4 o_C Thawing t = 5 mnt; T = 50 o_C Pengeringan t = 4 jam; T = 60 o_C Beras Instan

Deleted: 3) Pemasakan dengan tekanan¶

Penentuan metode pemasakan dengan tekanan dilakukan dalam satu faktor yaitu waktu pemasakan. Pada perbandingan air dengan beras adalah 1:1 atau untuk 100 gram beras maka air pemasakan 100 ml. Pemasakan pada beras instan dilakukan dengan presto yang bekerja pada tekanan 80 Kpa. Penentuan waktu pemasakan dilakukan dengan tiga taraf yaitu 5, 10, dan 15 menit. Tujuan perlakuan ini untuk mendapatkan nasi yang matang dan telah tergelatinisasi sempurna. Penentuan tingkat kematangan nasi mengikuti metode IRRI (1986). Kriteria mutu nasi yang telah matang yaitu pada nasi sudah tidak ada lagi lapisan putih seperti tepung, tetapi telah berubah menjadi bening atau transparan.¶

(18)

Pembuatan Beras Pratanak Fungsional

Gambar 9. Diagam alir proses pembuatan beras pratanak fungsional dengan ekstrak teh hijau.

Pada konsentrasi tersebut diharapkan mampu mendapatkan kadar total fenol dalam beras pratanak sebesar 1%. Penambahan ekstrak teh hijau dalam pembuatan beras pratanak fungsional dilakukan dalam dua tahap, yaitu tahap perendaman dan tahap pemasakan.

Diagam alir proses pembuatan beras pratanak fungsional dengan ekstrak teh hijau dapat dilihat pada Gambar 9. Proses pembuatan beras pratanak dengan penambahan ekstrak polifenol teh hijau dilakukan dengan cara pembersihan, perendaman selama 4 jam pada suhu 60o_{C, pemasakan}

Perendaman T=60o_{C, t=4 jam}

Ekstrak teh hijau 7 dan 14% Pemasakan P=80 kPa, t=20 menit

Ekstrak teh hijau 7 dan 14% Pengeringan I, T= 100o_C, t=60 menit (k.a. 18-20%)

Penggilingan, 2 kali sosoh

Pengeringan II, T=60o_C t=25 mnt (k.a. <12-14%) Gabah Memberamo Beras Memberamo pratanak fungsional Gabah pratanak

Tempering pada suhu kamar selama 3 jam

Formatted: Justified, Indent:

Left: 1 cm, First line: 0,98 cm, Line spacing: 1.5 lines

Deleted: Proses pembuatan beras

pratanak dengan penambahan ekstrak polifenol teh hijau dilakukan dengan cara pembersihan, perendaman selama 4 jam pada suhu 60o_{C, pemasakan} dengan menggunakan presto pada 80 Kpa selama 20 menit, serta pengeringan tahap I pada suhu 100o_{C selama 60 menit dan} pengeringan tahap II pada suhu 60o_{C selama 25 menit.}

(19)

dengan menggunakan presto pada 80 kPa (0.7895 STM) selama 20 menit, serta pengeringan tahap I pada suhu 100o_{C selama 60 menit dan}

pengeringan tahap II pada suhu 60o_{C selama 25 menit.}

Rancangan Percobaan

Pada tahap percobaan proses pembuatan beras pratanak dengan penambahan ekstrak teh hijau ini, rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Faktorial menggunakan dua faktor, yaitu proses pembuatan beras pratanak dan konsentrasi ekstrak teh. Faktor proses pembuatan beras pratanak fungsional, terdiri atas dua taraf yaitu perendaman dan pemasakan. Sedangkan faktor konsentrasi ekstrak teh hijau menggunakan dua taraf, yaitu 7 dan 14%.

Faktor A = Perendaman taraf 7% (A1) dan 14% (A2) Faktor B = Pemasakan taraf 7% (B1) dan 14% (B2) Model matematik umum yang digunakan adalah : Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk

Keterangan :

Yijk = Nilai pengamatan pada satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ij (taraf ke-i dari faktor A dan taraf ke-j dari faktor B)

µ = Nilai tengah populasi (rata-rata yang sesungguhnya) αi = Pengaruh perlakuan pada beras taraf ke-I dari faktor A βj = Pengaruh konsentrasi ke-j dari faktor B

(αβ)ij = Pengaruh interaksi taraf ke-i faktor A dan taraf ke-j faktor B

εijk = Pengaruh galat dari satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ij.

Jika F hitung menunjukkan perbedaan nyata, maka dilanjutkan dengan uji beda Duncan.

Pengolahan Beras Memberamo Instan Fungsional

Pembuatan Beras Instan Polifenol Ekstrak Teh

Pembuatan beras instan dengan penambahan ekstrak teh hijau dilakukan pada dua tahapan inti yaitu: perendaman (Steeping) dan

Deleted: ¶

Pembuatan beras pratanak fungsional dilakukan dengan penambahan ekstrak teh hijau pada 2 tahap dengan konsentrasi yang berbeda yaitu pada tahap perendaman dan pemasakan, masing-masing menggunakan 2 taraf konsentrasi yaitu 7 dan 14%. Analisis yang dilakukan terhadap beras pratanak fungsional tersebut meliputi uji organoleptik pada beras pratanak (warna dan tekstur) serta nasi pratanak (warna, rasa dan tekstur), serta analisis komposisi kimia meliputi kadar air, abu, amilosa, pati, total fenol, dan serat pangan (serat larut dan serat tidak larut air). ¶ ¶

(20)

pemasakan dengan tekanan (Pressure cooking). Penambahan ekstrak teh hijau ini dilakukan untuk mendapatkan hasil terbaik penyerapan polifenol dalam beras instan.

Gambar 10. Diagram alir pembuatan beras instan fungsional

Perlakuan penambahan ekstrak teh hijau pada beras instan adalah sebagai berikut : pada saat perendaman, digunakan dua konsentrasi ekstrak teh hijau, yaitu: C1 = 2% dan C2 = 4%, serta pada saat pemasakan juga digunakan dua konsentrasi, yaitu D1 = 2% dan D2 = 4%. Diagram alir proses pengolahan dapat dilihat pada Gambar 10.

Pengolahan Beras Memberamo Fungsional

Beras Memberamo fungsional (BMF) tidak termasuk perlakuan, tetapi sebagai pembanding. BMF dibuat dengan merendam beras dalam ekstrak

Beras Memberamo

Pencucian

Perendaman T = 50o_{C, t = 2 jam}

Beras : ekstrak teh 2 dan 4% = 1 : 1

Permasakan T= 10 mnt; P = 80 Kpa

Beras: ekstrak teh 2 dan 4% = 1:1

Pembekuan t = 24 jam; T = -4 o_C Thawing t = 5 menit; T = 50 o_C Pengeringan t = 4 jam; T = 60 o_C Beras Memberamo Instan Fungsional Deleted: ¶

(21)

teh hijau 4% (T = 50ºC, t = 2 jam, perbandingan ekstrak teh hijau dengan beras = 1 ; 1), kemudian dikeringkan hingga kadar air 12 %.

Gambar 11. Diagram alir pembuatan beras Memberamo fungsional Analisis Komposisi Kimia

Analisis komposisi kimia yang dilakukan terhadap beras Memberamo instan fungsional meliputi: kadar air, abu, total fenol bebas, daya cerna pati.

Uji Aktivitas Hipoglikemik

Tikus putih (Ratus novergicus) strain Sprague-Dawley jantan dengan berat badan 150 – 200 g dipuasakan selama satu malam, tetapi tetap diberi minum secara ad libitum (n = 6). Keesokan harinya, kadar glukosa tikus percobaan

diukur menggunakan glukometer (kadar glukosa darah puasa), dilanjutkan pemberian ekstrak pati beras pratanak fungsional atau beras instan fungsional yang akan diuji aktivitas hipoglikemiknya. Sampel dibuat tepung lalu dilarutkan dalam air, dan diberikan secara oral (4.5g/kg berat badan tikus). Setelah 30 menit, tikus percobaan diberi 1 ml larutan D-glukosa 10% secara oral. Tiga puluh menit

Beras Memberamo

Pencucian

Perendaman

Beras : ekstrak teh 4 % = 1 : 1 T = 50 o_{C, t = 2 jam} Penirisan Beras Memberamo Fungsional Pengeringan t = 4 jam; T = 60 o_C

Formatted: Italian (Italy) Deleted: ¶

Deleted: dan Gizi Deleted: mutu kimia dan gizi

Deleted:

-Deleted: . Se

Deleted: nya tikus percobaan Deleted: di

(22)

kemudian, kadar glukosa darah tikus percobaan diukur menggunakan glukometer (pengukuran menit ke-30). Pengukuran kadar glukosa yang sama dilakukan pada menit ke-60, 90, dan 120. Hasil pengukuran kadar glukosa seluruh sampel beras fungsional yang diuji dibuat kurva dan dibandingkan pengaruh aktivitas hipoglikemiknya. Pada masing-masing cara pengolahan diambil satu perlakuan terpilih untuk penelitian selanjutnya.

Percobaan 3. Evaluasi Daya Hipoglikemik Beras Fungsional dan Analisis Histologi Jaringan Pankreas

Beras fungsional dari varietas terpilih (Memberamo) diuji daya hipoglikemiknya menggunakan tikus percobaan sebagai hewan model DM. Empat macam beras yang diuji yaitu: beras Memberamo instan fungsional (BMIF) dan beras Memberamo pratanak fungsional (BMPF), serta beras Memberamo fungsional (BMF) dan beras Taj Mahal (BTM). BMF bukan perlakuan dalam penelitian ini, namun digunakan sebagai pembanding apakah terdapat perbedaan daya hipoglikemik dengan beras Memberamo yang diproses pratanak dan instan. BMF dibuat dengan caramerendam beras Memberamo di dalam ekstrak teh hijau dengan konsentrasi 4 % (sesuai dengan perendaman beras instan) lalu dikeringkan hingga kadar air 12-14 %. Kontrol yang digunakan ialah beras Memberamo (tanpa perlakuan ekstrak teh hijau). Lama perlakuan adalah 36 hari. Pengamatan dilakukan terhadap konsumsi ransum per hari, peningkatan berat badan setiap 3 hari, dan kadar glukosa darah diukur setiap 3 hari menggunakan ”One Touch Ultra” glukometer. Pada akhir percobaan dilakukan pengamatan : morfologi jaringan pankreas dengan pewarnaan Hematoxylin-Eosin dan sel-β pankreas dengan pewarnaan imunohistokimia

Uji Daya Hipoglikemik

Tikus normal dan model yang digunakan dalam penelitian ini ialah tikus putih strain Sprague Dawley berumur sekitar 60 hari, berat badan rata-rata 150-200 gram. Tikus model dikondisikan menjadi diabetes (DM) melalui penyuntikan dengan aloksan, dosis 110 mg/kg BB (Kesenja 2005). Aloksan akan merusak sel-β pankreas sehingga tikus tidak mampu menghasilkan insulin. Kondisi tersebut

Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Formatted Deleted: dengan Deleted: s X Deleted: perlakuan Deleted:

Deleted: pada hewan model Deleted:

Deleted: X Deleted: , Deleted: X

Deleted: (hasil terpilih dari Deleted: . Sebagai

Deleted: pembanding adalah Deleted: X

Deleted: adalah beras X Deleted: yang di Deleted: terpilih Deleted: , lalu Deleted: Sebagai k Deleted: positif Deleted: X Deleted: non-fungsional Deleted: Kontrol negatif, yaitu Deleted: , ... [6] ... [10] ... [11] ... [18] ... [21] ... [19] ... [12] ... [22] ... [5] ... [7] ... [8] ... [24] ... [9] ... [13] ... [17] ... [20] ... [14] ... [26] ... [15] ... [4] ... [25] ... [27] ... [16] ... [23] ... [28]

(23)

menyebabkan timbulnya DM. Tikus dikatakan DM jika kadar glukosa darah sesaat di atas 200 mg/dL.

Masing-masing tikus yang akan digunakan dalam penelitian, ditimbang dan dicatat berat badannya. Kemudian, sebanyak 30 ekor tikus DM dibagi dalam lima kelompok, ditambah satu kelompok tikus normal (enam ekor tikus per kelompok). Jadi dalam percobaan ini terdapat enam kelompok tikus percobaan sebagai berikut:

1. Kelompok KN (kontrol negatif): tikus normal diberi ransum standar, sumber pati dari beras Memberamo (BM)

2. Kelompok KP (kontrol positif): tikus DM diberi ransum standar, sumber pati beras Memberamo (BM)

3. Kelompok BMIF : tikus DM diberi ransum dengan sumber pati beras Memberamo instan fungsional.

4. Kelompok BMPF : tikus DM diberi ransum dengan sumber pati beras Memberamo pratanak fungsional.

5. Kelompok BMF : tikus DM diberi ransum dengan sumber pati beras Memberamo fungsional.

6. Kelompok BTM : tikus DM diberi ransum dengan sumber pati beras Taj Mahal

Seluruh tikus percobaan dalam setiap kelompok diberi perlakuan selama 36 hari. Selama perlakuan berlangsung, berat badan tikus ditimbang per tiga hari, pengukuran konsumsi ransum per hari, dan pengukuran kadar glukosa darah per 3 hari. Pada akhir percobaan dilakukan pembedahan dan pengambilan organ tikus untuk pengamatan histologi jaringan pankreas.

Pembuatan Ransum Standar dan Ransum Perlakuan

Pembuatan ransum tikus percobaan mengikuti metode AOAC (1995). Pemberian ransum dilakukan setiap hari sebanyak 20 g/ekor, dengan komposisi ransum sebagai berikut:

Protein (a) = . 1.6 x 100 . Kadar N Kasein

Lemak (b) = [ 8 – (a) x Kadar Lemak ]

100

single

Deleted: atau Deleted: ,

Deleted: (beras X non

perlakuan)

Deleted: atau Deleted: ,

Deleted: (beras X non

perlakuan)

Deleted: X

(24)

Mineral (c) = [ 5 – (a) x Kadar Abu ]

100

Air (d) = [ 5 – (a) x Kadar Air ]

100

Serat (e) = [ 1 – (a) x Kadar Serat ] 100

Vitamin (f) = 1 %

Pati = 100 – (a + b + c + d + e + f )

Sumber protein yang digunakan ialah kasein, dan sebagai sumber lemak ialah minyak jagung. Mineral yang digunakan merupakan mineral mix yang terdiri atas KI 0.79 g, NaCl 139.30 g, KH2PO4 389.00 g, MgSO4 anhidrat 53.70 g, CaCO3 381.40 g, FeSO4.7H2O 27.00 g, MnSO4.2H2O 4.01 g, ZnSO4.7H2O 0.55 g, CuSO4.5 H2O 0.48 g, dan CoCl2.6 H2O 0.02 g (Muchtadi 1989). Air yang digunakan adalah akuades, sebagai sumber serat adalah selulosa dan vitamin merupakan vitamin mix. Pati yang digunakan ialah tepung beras dari masing-masing perlakuan seperti yang telah disebutkan sebelumnya (BM, BMPF, BMPF, BMF dan BTM).

Pengukuran Jumlah Konsumsi Ransum

Jumlah ransum yang dikonsumsi diukur setiap hari selama masa perlakuan (36 hari). Konsumsi ransum ditentukan dengan cara mengumpulkan dan menimbang ransum sisa yang ada di dalam wadah makanan maupun yang tercecer. Ransum yang tercecer diayak terlebih dahulu untuk memisahkan dari sekam yang tercampur. Ransum sisa selanjutnya ditimbang dan dinyatakan dalam satuan gram. Jumlah konsumsi ransum dihitung dengan mengurangi jumlah ransum yang diberikan dengan sisa ransum yang telah ditimbang.

Pengukuran Berat Badan

Berat badan tikus selama masa perlakuan diukur setiap tiga hari, dengan tujuan untuk memonitor tingkat pertambahan atau penurunan berat badan tikus percobaan. Pengukuran berat badan tikus dilakukan menggunakan timbangan dan dinyatakan dalam satuan gram.

single

single Deleted: Untuk p Deleted: ter Deleted: diatas Deleted: ¶ Deleted: ¶ Deleted: ¶ Deleted:

(25)

Analisis Histologi Jaringan Pankreas

Analisis histologi jaringan pankreas bertujuan untuk mengamati terjadinya kerusakan pada pankreas tikus setelah diberi ransum ekstrak beras fungsional, yaitu beras yang diberi perlakuan ekstrak teh hijau. Analisis dilakukan pada akhir masa perlakuan, dengan cara membedah tikus dan mengambil organ pankreasnya. Analisis ini terdiri atas delapan tahapan, yaitu pengambilan sampel (sampling), fixasi (pengawetan), dehidrasi, penjernihan (clearing), infiltrasi parafin, pencetakan (embedding), pemotongan (sectioning) dan pewarnaan (staining) Hematoxylin-Eosin dan imunohistokimia terhadap sel β, serta pengamatan jaringan pankreas.

Sampling. Tikus yang akan dibedah, dipingsankan terlebih dahulu dengan cara dislocatio cervicalis. Setelah tikus pingsan, dilakukan pembedahan dan pengambilan organ pankreas. Kemudian organ pankreas dicuci dalam larutan fisiologis (NaCl 0.9%) dan dimasukkan ke dalam larutan pengawet.

Fiksasi (Pengawetan) dan Stopping Point. Pengawetan dilakukan dalam larutan Bouin yang dipersiapkan pada hari pembedahan. Larutan fiksatif (Bouin) dibuat dengan cara mencampurkan asam pikrat jenuh : formalin p.a. : asam asetat glasial, dengan perbandingan 15 : 5 : 1. Proses pengawetan (perendaman di dalam larutan fiksatif) dilakukan selama 24 jam. Kemudian pankreas dipindahkan ke dalam larutan alkohol 70%. Perendaman di dalam larutan ini berfungsi sebagai

stopping point, berarti proses pengawetan dihentikan, dan organ pankreas dapat

disimpan di dalam larutan ini sampai tahapan berikutnya dilakukan.

Dehidrasi. Tahapan ini dilakukan dengan tujuan untuk menarik air dari jaringan secara perlahan-lahan. Dehidrasi dilakukan dengan menggunakan larutan alkohol bertingkat. Sebelum dilakukan dehidrasi, pankreas dipotong menggunakan silet secara melintang menjadi bagian kecil-kecil dengan ukuran 0.5-1.0 cm3. Potongan-potongan tersebut lalu dimasukkan ke dalam tissue

cassete. Proses penarikan air dilakukan dengan cara merendam tissue cassete

berisi sampel ke dalam alkohol bertingkat, yaitu 24 jam di dalam alkohol 80%, 24 jam di dalam alkohol 90%, dan 12-24 jam di dalam alkohol 95%, dilanjutkan

(26)

dengan perendaman 1 jam di dalam alkohol absolut I, 1 jam di dalam alkohol absolut II, dan 1 jam di dalam alkohol absolut III.

Clearing. Tahapan ini bertujuan untuk menjernihkan dan menghilangkan sisa larutan alkohol yang tersisa dalam jaringan. Penjernihan dilakukan dengan cara memindahkan tissue cassete berisi sampel dari alkohol absolut III ke dalam xylol I selama 1 jam (pada suhu kamar), lalu perendaman dilanjutkan ke dalam xylol II (pada suhu kamar) selama 1 jam dan xylol III selama 30 menit pada suhu kamar dan 30 menit pada oven bersuhu ± 60o_C.

Infiltrasi Parafin. Tahapan ini dilakukan untuk memudahkan pemotongan jaringan. Parafin dapat larut di dalam xylol, sehingga dalam proses ini diharapkan xylol yang telah masuk ke seluruh bagian organ, dapat digantikan oleh parafin. Dengan demikian, jaringan mudah dipotong. Setelah tahapan penjernihan selesai (jaringan berada dalam xylol III, oven suhu 60oC), potongan jaringan dikeluarkan dari tissue cassete, lalu dimasukkan ke dalam parafin cair I, II, dan III berturut-turut selama 1 jam. Infiltrasi parafin dilakukan di dalam oven suhu 60o_C. Selanjutnya sampel dicetak dalam parafin.

Embedding. Pencetakan potongan jaringan pankreas dalam parafin

(embedding), dilakukan dengan bantuan Tissue Embedding Console. Parafin cair

dituangkan pada cetakan yang telah diberi gliserin dan potongan-potongan pankreas diletakkan di dalam parafin. Posisi potongan pankreas diletakkan sedemikian rupa sehingga bagian potongan yang rata dan lebar berada di dasar. Parafin didinginkan sampai membeku, lalu dilepaskan dari cetakan. Bagian parafin yang memuat potongan pankreas dipotong menjadi bentuk segi empat, kemudian ditempelkan pada balok kayu. Sampel diatas balok kayu ini disimpan di dalam refrigerator minimal 1 jam sebelum dipotong menggunakan mikrotom. Hal ini dilakukan agar dihasilkan pita jaringan yang baik.

Sectioning. Pemotongan dilakukan menggunakan mikrotom, agar dihasilkan pita jaringan dengan ketebalan sekitar 5 μm. Sebelum pemotongan jaringan dengan ketebalan 5 μm, terlebih dahulu dilakukan trimming parafin dengan ketebalan sekitar 10 μm hingga diperoleh pita jaringan yang baik. Jika

(27)

telah diperoleh pita yang baik, hasil sayatan di apungkan diatas aquades dingin. Sayatan yang bagus diambil dan dibentangkan diatas akuades hangat (45o_{C), lalu} ditempelkan pada gelas objek, dan diinkubasi selama satu malam pada suhu 37ºC. Sampel siap untuk diwarnai.

Staining (HE dan Imunohistokimia terhadap Sel

β

). Dua macam

pewarnaan dilakukan dalam tahapan ini yaitu pewarnaan HE dan pewarnaan dengan metode imunohistokimia. Pewarnaan HE dilakukan untuk pengamatan terhadap struktur umum jaringan. Tahapan pewarnaan dimulai dengan deparafinisasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan xylol III, II dan I, dengan maksud untuk melarutkan parafin dari jaringan. Tahap berikutnya ialah rehidrasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan alkohol (alkohol absolut III, II, dan I, alkohol 100, 95, 90, 80 dan 70%). Kemudian sediaan disiram dengan air mengalir (running water), dan dimasukkan ke dalam aquades. Sediaan kemudian diwarnai dengan pewarna hematoxylin dan kembali disiram dengan air kran mengalir untuk menguatkan warna hematoxylin, dilanjutkan dengan memasukkan ke dalam aquades. Sediaan kemudian diberi pewarna Eosin, selanjutnya dilakukan proses dehidrasi dengan mencelupkan sediaan ke dalam serial larutan alkohol 70, 80, 90, dan 95 %, alkohol absolut I, II dan III. Penjernihan atau Clearing dengan xylol I (carboxylol), xylol II dan xylol III. Tahap akhir dari pewarnaan ini ialah mounting, yaitu penempelan gelas penutup pada sediaan dengan perekat entelan. Sediaan yang telah diwarnai lalu diamati dengan mikroskop untuk melihat jumlah dan luas pulau Langerhans.

Pewarnaan imunohistokimia dalam penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi sel-β pankreas, yaitu sel penghasil insulin. Tahapan analisis juga dimulai dengan deparafinisasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan xylol III, II dan I, dengan maksud untuk melarutkan parafin dari jaringan. Tahap berikutnya ialah rehidrasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan alkohol (alkohol absolut III, II, dan I, alkohol 100, 95, 90, 80 dan 70%). Sediaan lalu direndam dalam air bebas ion (deionized water) selama 5-10 menit, direndam H2O2 dalam metanol (1:100), selama 15 menit. Sediaan direndam dalam air bebas ion dan PBS, masing-masing selama 2 x 10 menit. Sediaan lalu diletakkan pada

Deleted: nya peradangan,

(28)

kotak sediaan dan ditetesi dengan serum normal 10% dalam PBS (50-60 μl/sediaan), diinkubasi pada suhu 37o_{C, 30-60 menit. Sediaan dicuci dengan PBS} 3 x 5 menit, lalu ditetesi antibodi primer/monoklonal terhadap insulin (Sigma I2018) dalam PBS (1:1000) sebanyak 50-60 μl/sediaan, inkubasi dalam refrigerator semalam, lalu dicuci dengan PBS 3 x 10 menit. Sediaan kemudian ditetesi dengan antibodi sekunder DAKO envision peroxidase (Code No. K1491) yang telah diencerkan dengan PBS (DAKO : PBS = 3:1), sebanyak 50-60 μl/sediaan, lalu diinkubasi pada ruangan gelap suhu 37o_{C, 30-60 menit. Sediaan} dicuci dengan PBS 3 x 5 menit, lalu ditetesi DAB (diaminobenzidine) sebanyak 50-60 μl/sediaan dalam tris buffer dan H2O2 . DAB dibiarkan bereaksi pada ruang gelap selama 25 menit, dan hasilnya dicek dibawah mikroskop. Pewarnaan dilanjutkan dengan counterstain menggunakan hematoxylin. Kemudian sediaan dicuci dengan air bebas ion dan didehidrasi dengan alkohol bertingkat (alkohol 70,80, 90, dan 95%, lalu alkohol absolut I, II, dan III). Penjernihan dengan xylol I, xylol II dan xylol III. Tahap akhir dari pewarnaan ini ialah mounting, yaitu penempelan gelas penutup pada sediaan dengan perekat entelan. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna coklat pada sel yang mengandung insulin. Sel positif terhadap pewarnaan ini ialah sel-β

Pengamatan dan Pemotretan. Sediaan yang telah diwarnai dengan metode HE maupun imunohistokimia kemudian diamati dibawah mikroskop cahaya, yang telah dilengkapi dengan kamera. Pengamatan pada sediaan yang diberi pewarnaan HE meliputi pengamatan pulau Langerhans secara deskriptif, penghitungan jumlah pulau Langerhans per lapang pandang dengan pembesaran 20X. Untuk sediaan yang diwarnai dengan metode imunohistokimia dilakukan penghitungan jumlah sel-β per 15 pulau Langerhans per sediaan dengan pembesaran 20X

Percobaan 4. Penentuan Indeks Glikemik Beras

Pada tahap ini akan ditentukan indeks glikemik dari lima sampel uji, yaitu beras Memberamo, beras Memberamo instan fungsional (BMIF), beras Memberamo pratanak fungsional (BMPF), serta beras Memberamo fungsional (BMF), dan beras Taj Mahal (BTM) sebagai pembanding. Hasil yang diperoleh

Formatted: Subscript Formatted: Subscript Deleted: air bebas ion (1 ml air

bebas ion ditambah 1 tetes reagen 1, 1 tetes reagen 2, 1 tetes reagen 3). DAB

Deleted: BI

Deleted: 10-20

(29)

diharapkan dapat memberikan gambaran bahwa sumber karbohidrat yang sama, dapat mempunyai indeks glikemik yang berbeda apabila diolah dan diberi perlakuan yang berbeda.

Penentuan Indeks Glikemik (Miller et al. 1996)

Setiap porsi nasi yang akan ditentukan IG nya (mengandung 50g karbohidrat) diberikan kepada relawan yang telah menjalani puasa penuh (kecuali air) selama semalam (sekitar pk 20.00 sampai pk 08.00 besoknya). Relawan yang digunakan ialah individu normal, tidak menderita diabetes, sebanyak 10 orang.

Selama dua jam pasca konsumsi pangan uji, sampel darah sebanyak 50 μL (finger-prick cappillary blood samples method) diambil setiap 30 menit untuk diukur kadar glukosanya (pengukuran kadar glukosa menit ke-30, ke-60, ke-90 dan ke-120). Selang 3 hari, hal yang sama dilakukan dengan memberikan 50 g glukosa murni (sebagai pangan acuan) kepada relawan. Hal ini dilakukan untuk mengurangi efek keragaman glukosa darah dari hari ke hari.

Kadar glukosa darah (pada waktu setiap pengambilan sampel) di plot pada dua sumbu, yaitu sumbu waktu ( X ) dan sumbu kadar glukosa darah (Y). Indeks Glikemik ditentukan dengan membandingkan luas daerah dibawah kurva antara pangan yang diukur IG-nya dengan pangan acuan dikalikan 100.

Analisis Data

Analysis of variance. Analysis of variance (ANOVA) dilakukan dengan

menggunakan program SPSS untuk menganalisis perbedaan pada parameter fisiko kimia dan gizi. Tingkat signifikansinya dinyatakan dalam α = 5 %. Pada penapisan aktivitas hipoglikemik, rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap. Sedangkan pada pembuatan beras fungsional rancangan percobaan yang digunakan ialah rancangan acak faktorial, dengan dua perlakuan, masing-masing dengan dua kali ulangan.

BAHAN DAN METODE. Waktu dan Tempat

BAHAN DAN METODE

β

Spanish (Spain-Modern Sort)

Spanish (Spain-Modern Sort)

Italian (Italy)

Finnish

Finnish

Finnish

Finnish

pada hewan model (tikus diabetes)

Finnish

Finnish

Finnish

(hasil terpilih dari percobaan 4)

Finnish

Finnish

Finnish

Finnish

Finnish

Finnish

Finnish

Finnish

Finnish

Finnish

Finnish

Finnish

Kontrol negatif, yaitu beras X non-fungsional yang diaplikasikan pada tikus

normal.