METODE PENELITIAN
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan bulan September 2016 - Maret 2017 di Laboratorium Ekologi Hutan Progam Studi Kehutanan, Fakultas Kehutanan dan Rumah Kaca Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara.
Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan adalah hand refraktometer, botol plastik, cutter, jangka sorong, penggaris, kamera, timbangan, alat tulis, micro pipette, pipette tips, botol kocol, botol ekstrak, kertas saring, corong, oven, silica gel 60-TLC,
RP-18 silica gel TLC / 2D TLC (Two Dimention Thin Layer Chromathography),
magnet batangan, hair dryer, chamber, dan scanner Canon PIXMA E400.
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah propagul Bruguiera cylindrica yang sehat dan matang, bubuk garam komersial (marine salt), air tawar
dan pasir dari sungai (tidak memiliki konsentrasi garam), chloroform, methanol, standard dolichol dan polyprenol, n-hexane, etanol, KOH, aquades, tolune, etyl acetat, aceton, silica gel 60-TLC, dan iodine.
Prosedur Penelitian Penyiapan Media Tanam
Propagul dari B. cylindrica ditanam dalam botol plastik yang dibagi menjadi 2 bagian, kemudian diisi dengan media pasir yang telah di sterilisasi
terlebih dahulu dan diberi salinitas yang bervariasi sesuai dengan penelitian. Pada penelitian ini, salinitas merupakan perbandingan massa bubuk garam dengan
massa larutan. Metode ini mengacu pada penelitian Fofonoff dan Lewis (1979).
Jenis garam yang dipakai adalah bubuk garam komersial (marine salt) dan konsentrasi salinitas 0%, 0,5%, 1,5%, 2% dan 3% dibuat dengan melarutkan 5,66 g, 17 g, 22,6 g, dan 34 g bubuk garam komersial untuk 1 liter air.
Pemilihan Propagul
Propagul B. cylindrica yang digunakan berasal dari pohon induk yang berumur 5 tahun atau lebih. Propagul yang dipilih sebaiknya telah matang secara fisiologi dengan warna propagul hijau kecoklatan dan sehat, tidak terserang oleh hama dan penyakit. Pengambilan propagul dari Pulau Sembilan dan Kabupaten Langkat.
Penanaman Propagul
Propagul B. cylindrica yang telah disediakan, ditanam ke dalam botol plastik yang telah berisi media tumbuh yang telah disesuaikan dengan perlakuannya masing-masing. Setelah 3 bulan, semai dibagi menjadi dua kelompok perlakuan dan ditumbuhkan selama 2 bulan : satu kelompok terus menerus dalam larutan garam dan yang lainnya disiram dengan air tawar untuk menghilangkan stres garam. Pada langkah ini, semua benih dicuci dengan air tawar selama 7 hari untuk menghilangkan garam dari perakaran.
Pengamatan respon toleransi garam
Setelah 5 bulan budidaya, tanaman dipanen dengan memisahkan bagian akar, daun dan batang kemudian dicuci. Sampel yang akan digunakan untuk proses ekstraksi dan isolasi isoprenoid segera dibekukan nitrogen cair dan disimpan pada -80 0C untuk analisis. Setelah itu dilakukan pengukuran respon toleransi garam dengan mengukur parameter pertumbuhan yaitu : tinggi tanaman
(mm), diameter (mm), jumlah daun, luas daun dan biomassa. Pengukuran biomassa dilakukan dengan mengovenkan bagian akar, batang dan daun selama 48 jam dengan suhu 70 0C sehingga diperoleh berat kering konstan.
Bahan tanaman
Daun dan akar B. cylindrica yang telah dipanen dari Rumah Kaca Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara dikumpulkan. Semua sampel segar disimpan pada suhu -80°C sampai digunakan.
Isolasi polyisoprenoid alkohol
Daun dan akar dikeringkan pada suhu 60°C - 75°C selama 1-2 hari. Jaringan daun dan akar kering (masing-masing 5 gram) dihancurkan menjadi bubuk halus dan direndam dalam 30 ml pelarut kloroform/metanol (2:1, vol/vol) selama 48 jam. Ekstrak lipid dari daun dan akar yang disaponifikasi pada suhu 65°C selama 24 jam dalam kosentrasi 2 M KOH yang mengandung 86% metanol. NSL setiap jaringan diekstrak dengan heksan dan pelarut organik ini diuapkan, kemudian dilarutkan kembali dengan pelarut heksan.
Analisis dengan dua dimensi kromatografi
Dimensi pertama TLC dilakukan selama 60 menit diatas silika-gel (20 x 3 cm) dengan sistem pelarut toluene-etil asetat (9:1). Tepi longitudinal dari dimensi pertama TLC dengan lebar 1 cm dan zona konsentrasi dari fase reverse C-18 TLC yang dijepit dengan cara menggunakan dua bar magnetik (4.0 x 1.1 x 0.8 cm) dengan menghadapkan setiap fase gel. Plat TLC yang terikat kemudian dikembangkan tegak lurus ke dimensi pertama untuk mentransfer polyprenol dan dolichol ke zona konsentrasi fase reverse TLC.
Dimensi kedua fase reverse RP-18 silika-gel TLC dilakukan dengan pelarut aseton selama sekitar 30 menit. Posisi polyisoprenoid alkohol dipisahkan dan dikembangkan oleh silika-gel dua dimensi TLC, kemudian diidentifikasi dan divisualisasikan dengan uap yodium (iodine vapor). Gambar kromatografi yang diperoleh dan discan. Konsentrasi polyprenol dan dolichol yang terdeteksi pada HPTLC RP-18 diukur dengan menggunakan ImageJ 1.46r.
Analisis Data
Penelitian ini adalah metode analisis dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 perlakuan konsentrasi garam (salinitas) berdasarkan tingkat salinitas yang ada di lapangan dengan masing-masing 10 ulangan :
a. Salinitas 0 % d. Salinitas 2 %
Yij = hasil pengamatan pada perlakuanke-i dan ulangan ke-j
μ = nilai rataan umum (mean)
τi = pengaruh faktor perlakuan ke-i
i = 1, 2, 3, 4, 5 dan j = 1, 2, 3, 4, 5
εij= pengaruh galat perlakuan ke-iulangan ke-j
Data dianalisis dengan ANOVA satu arah menggunakan uji Dunnett untuk perbandingan seluruh perlakuan terhadap kontrol, nilai P< 0,05 dan P<0,01 dipakai sebagai batas untuk menunjukkan pengaruh perlakuan.
Jumlah daun yang paling banyak berdasarkan konsentrasi garam pada gambar 2A pada penelitian ini adalah salinitas 0.5% yaitu 8 helai daun, dan jumlah daun yang paling sedikit atau bahkan tidak menghasilkan daun yaitu pada salinitas 3%. Berdasarkan adaptasi air tawar, jumlah daun yang paling banyak adalah pada adaptasi 0.5% - 0% yaitu 9 helai daun dan jumlah daun yang sedikit atau bahkan tidak menghasilkan daun adalah pada adaptasi 3% - 0% yaitu 0. Perhitungan luas daun menggunakan software imageJ menghasilkan daun yang paling luas adalah berdasarkan konsentrasi garam yaitu pada salinitas 0.5% yaitu 1.43% mm dan berdasarkan adaptasi air tawar yaitu pada adaptasi 0.5% - 0% yaitu 1.55 mm, sedangkan luas daun yang paling sedikit berdasarkan konsentrasi garam dan adaptasi air tawar adalah pada salinitas 3% dan pada adaptasi 3% - 0% yaitu 0 mm.
Perhitungan jumlah daun dan luas daun menunjukkan bahwa semakin tinggi salinitas maka semakin rendah jumlah dan luas daun yang diperoleh. Hal ini sesuai dengan Harjadi dan Yahya (1998) yang melaporkan pengaruh salinitas terhadap pertumbuhan dan perubahan struktur tanaman yaitu antara lain lebih kecilnya ukuran daun. Sehingga penyerapan hara dan air yang berkurang akan menghambat laju fotosintesis yang pada akhirnya akan menghambat pertumbuhan tanaman.
Analisis polyisoprenoid pada jaringan daun dan akar semai B. cylindrica
Selain mengetahui pengaruh konsentrasi garam dan adaptasi air tawar juga mengetahui komposisi polyisoprenoid pada semai B. cylindrica. Hasil yang diperoleh dari ekstraksi semai B. cylindrica adalah total lipid, distribusi dolichol dan polyprenol dapat dilihat pada table berikut ini :
Tabel 1. Nilai total lipid dan distribusi dolichol dan polyprenol pada jaringan daun dan akar semai B. cylindrica.
Jenis Jaringan Salinitas Total lipids Polyisoprenoids Polyprenols Dolichols % pada total lipid % pada polyisoprenoid Tipe (mg/g dw) (mg/g dw) (mg/g) (mg/g) Polyisoprenoid Polyprenol Dolichol Polyprenol Dolichol
daun 0% 590.57±11.64 68.03±4.12 nd 68.03±4.12 11.52 nd 11.52 nd 100 I
0.5% 591.13±63.57 182.35±121.56 nd 182.35±121.56 30.85 nd 30.85 nd 100 I
0.5% - 0% 781.17±184.70 100.34±24.40 nd 100.34±24.40 14.12 nd 14.12 nd 100 I
1.5% 611.63±44.88 129.84±15.40 nd 129.84±15.40 21.23 nd 21.23 nd 100 I
1.5% - 0% 547.70±16.14 102.32±26.25 nd 102.32±26.25 18.7 nd 18.7 nd 100 I
B. cylindrica
akar 0% 693.33±12.79 49.07±6.34 nd 49.07±6.34 76.75 nd 76.75 nd 100 I
0.5% 714.57±30.15 59.98±15.51 nd 59.98±15.51 8.39 nd 8.39 nd 100 I
0.5% - 0% 674.17±72.67 63.51±7.74 nd 63.51±7.74 9.42 nd 9.42 nd 100 I
1.5% 551.83±13.83 55.56±27.79 nd 55.56±27.79 10.06 nd 10.06 nd 100 I
1.5%-0% 634.30±45.86 129.12±16.38 nd 129.12±16.38 20.36 nd 20.36 nd 100 I
2% 657.87±71.68 689.76±363.13 nd 689.76±363.13 104.84 nd 104.84 nd 100 I
2%-0% 575.23±38.40 382.94±250.23 nd 382.94±250.23 66.57 nd 66.57 nd 100 I
nd (not detected) = tidak terdeteksi, dw (dry weight)= berat kering
Dari tabel 1 dapat dilihat bahwa nilai total lipid ekstrak semai B. cylindrica pada jaringan daun berkisar antara 0 – 781.17 mg/g dengan total lipid terbesar pada perlakuan 0.5% - 0% dan terkecil pada perlakuan 2% dan 2% - 0%. Pada jaringan akar nilai total lipid berkisar antara 575.23 – 714.57 mg/g dengan total lipid terbesar pada perlakuan 0.5% dan terendah pada perlakuan 2% - 0%. Jumlah kandungan polyisoprenoid pada jaringan daun dan akar semai B. cylindrica adalah berkisar antara 0 – 182.35 mg/g dengan jumlah terbesar pada perlakuan 0.5% dan terkecil pada perlakuan 25, 2% - 0% di jaringan daun. Hal ini sesuai dengan Surmacs dan Swiezewska (2011) yang melaporkan bahwa kandungan polyisoprenoid alkohol sangat meningkat di jaringan selama penuan (umur),
apalagi akumulasi alkohol polyisoprenoid testimulasi pada serasah daun. Menariknya polyisoprenoid kandungannya meningkat secara eksklusif di jaringan yang tahan tapi tidak pada tanaman yang rentan.
Rantai panjang dolichol bervariasi dari jaringan ke jaringan bahkan untuk spesies yang sama, dan muncul untuk mendominasi keluarga yang berbeda dengan spesies molekul. Dolichol terjadi sebagai satu keluarga dengan dominasi panjang rantai karbon C70, C80 – C95 dan C100 – C110 tergantung pada jenis mangrove dan jaringan yang diamati (Basyuni dkk., 2016). Hasil ini mendukung temuan sebelumnya jawab untuk pembetukan rantai pendek polyprenol, rantai panjang polyprenol dan dolichol pada tanaman mangrove (Tateyama dkk., 1999). Tabel 2. Panjang rantai karbon pada semai B. cylindrica
0% 80 85 90 95 100
Pada Tabel 2, Gambar 5 dan Gambar 6 menjelaskan tentang distribusi senyawa dolichol pada jaringan daun dan akar semai B. cylindrica dengan panjang karbon C75 – C95, C80 – C100, dan C85 – C95, C80 – C105. Perbedaan panjang rantai polyisoprenoid dapat diakibatkan oleh beberapa faktor, diantaranya adalah faktor cekaman salinitas, perbedaan jaringan pengaruh cahaya dan peningkatan umur atau penuaan jaringan. Hal ini sesuai dengan pernyataan Basyuni dkk., (2011)
yang melaporkan bahwa Mekanisme fisiologi yang terjadi pada tumbuhan adalah untuk bertahan dalam cekaman garam. Selain metabolisme bergeser untuk mengatasi tantangan lingkungan, sel membran tanaman itu sendiri merupakan hambatan mendasar bagi faktor eksternal. Lipid pada membran sel memainkan peranan penting dalam adaptasi terhadap salinitas yang berbeda melalui perubahan komposisi sterol, lipid dan terpenoid.
Gambar 5. Analisis dua dimensi kromatografi dari jaringan daun semai B. cylindrica pada
salinitas 0% (A), 0.5% (B), 0.5% → 0% (C), 1.5% (D), 1.5% → 0% (E), dan pada
jaringan akar semai B. cylindrica pada salinitas 0% (F).
Gambar 6. Analisis dua dimensi kromatografi dari akar semai B. cylindrica pada salinitas 0.5% (G), 0.5% → 0% (H), 1.5% (I), 1.5% → 0% (J), 2% (K), 2% → 0% (L).
Dari hasil tersebut juga menunjukkan bahwa dolichol mendominasi pada setiap jaringan daun dan akar semai B. cylindrica. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Basyuni dkk., (2016) melaporkan bahwa dolichol mendominasi dalam enam belas dari dua puluh satu jaringan mangrove yang diteliti yaitu, daun dan akar. Keberadaan polyprenol yang tidak terdeteksi dapat disebabkan oleh umur pada tanaman tersebut yang tergolong muda. Hal ini sama dengan Tateyama (1999) yang menyatakan meningkatnya akumulasi polyprenol telah dilaporkan pada daun tua dan daun yang menua (Swiezewska dkk., 1994).
Pembahasan
Pada gambar 1A dan 1B dapat dilihat bahwa adaptasi air tawar terhadap pertumbuhan tinggi dan diameter semai B. cylindrica memberikan pengaruh nyata, dapat dilihat bahwa pada pertumbuhan tinggi dan diameter setelah 3 bulan diberi perlakuan adaptasi air tawar selalu mengalami peningkatan pertumbuhan tinggi dan diameter dibandingkan dengan konsentrasi garam. Hal ini disebabkan hilangnya stress kadar garam pada semai B. cylindrica sehingga perlakuan adaptasi air tawar seperti 0.5% - 0%, 1.5% - 0%, 3% - 0% akan menjadi seperti perlakuan 0% yang hanya diberi perlakuan air tawar selama 6 bulan.
Pemberian konsentrasi garam dan adaptasi air tawar pada jumlah daun berpengaruh signifikan secara statistik dibanding salinitas 0% pada P < 0.05 dengan uji Dunnet pada perlakuan 1.5% dan 1.5% - 0%, sedangkan pada luas daun yang berpengaruh signifikan secara statistik disbanding 0% pada P < 0.05
dengan uji Dunnet pada perlakuan 0.5% saja. Hal ini sesuai dengan penelitian Basyuni dkk (2014) yang melaporkan bahwa tingkat salinitas akan mempengaruhi
jumlah daun dari semai R. stylosa dan A. marina dimana semakin tinggi salinitas maka semakin sedikit jumlah daun.
Berdasarkan hasil parameter pengukur, pertumbuhan semai B. cylindrica selama 6 bulan di rumah kaca yang diberi konsentrasi garam dan adaptasi air tawar hanya sebagian tumbuh dengan baik yaitu 0%, 0.5%, 0.5%, - 0%, 1.5%, 1,5% - 0% dan sebagian lagi tidak tumbuh dengan baik yaitu 2%, 2% - 0%, bahkan ada yang mati yaitu 3%, dan 3% - 0%. Perbedaan pertumbuhan tersebut terjadi disebabkan oleh tingkat salinitas dan kondisi lingkungan. Hal ini sesuai dengan Krauss dkk (2008) yang melaporkan bahwa pertumbuhan awal tanaman
mangrove juga sangat dipengaruhi oleh faktor global seperti temperature dan faktor spesifik lokal seperti salinitas. Kalesaran (2011) juga melaporkan bahwa pada dasarnya berbagai kondisi lingkungan ekstrim yang meliputi lingkungan salin, tanah jenuh air, kurangnya oksigen, dan radiasi sinar matahari serta suhu yang tinggi akan menyebabkan terganggunya metabolisme tumbuhan, sehingga pada akhirnya akan menyebabkan rendahnya produktivitas atau laju pertumbuhan mangrove.
Pada Tabel 1 menunjukkan bahwa distribusi dolichol diklasifikasikan pada tipe 1 dikarenakan penyebaran dolichol yang banyak di temukan dalam jaringan daun dan akar, sehingga keberadaan dolichol 100% pada semai B. cylindrica. Hal ini sesuai dengan pernyataan Basyuni dkk (2016) yang melaporkan pada tipe 1 adalah dolichol mendominasi dibandingkan polyprenol (lebih dari 90%) yang diamati. Oleh karena itu, kemunculan jumlah dolichol yang lebih besar bahkan dalam daun tanaman mangrove, menunjukkan bahwa polyprenol tidak memainkan peran penting dalam beberapa daun mangrove.
Analisis polyisoprenoid di daun tanaman mangrove menunjukkan bahwa komponen utama polyisoprenoid bukan senyawa polyprenol tetapi dolichol (Swiezewska dkk., 2005), hal ini dikarenakan oleh aktivitas dolichol sebagai lipid pembawa gula dalam biointesis N - glikoprotein dan protein GPI. Oleh karena, terjadinya jumlah dan konsentrasi dolichol yang lebih besar dari senyawa polyprenol ditanamn mangrove Okinawa menyarankan bahwa polyprenol
reduktase yang berfungsi mengkatalisis reduksi polyprenol menjadi dolichol, mungkin aktif di jaringan daun tanaman mangrove (Basyuni dkk., 2016).
Pada Tabel 2, Gambar 5 dan Gambar 6 menjelaskan tentang distribusi senyawa dolichol pada jaringan daun dan akar semai B. cylindrica dengan panjang karbon C75 – C95, C80 – C100, dan C85 – C95, C80 – C105. Tateyama dkk., (1999) yang melaporkan distribusi rantai panjang polyprenol belum tentu sama dengan
rantai panjang dolichol di jaringan yang sama, hal ini didukung pernyataan Suga dkk., (1999) yang melaporkan konsentrasi polyisoprenoid pada tanaman
mengalami perubahan yang disebabkan oleh perbedaan umur dan musim. Setiap organisme mempunyai tingkat toleransi yang berbeda terhadap faktor-faktor lingkungan. Tanaman yang mempunyai kisaran toleransi yang luas memiliki ketahanan terhadap kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan, yang dalam kondisi tertentu disebut sebagai cekaman (stress) lingkungan. Kondisi tersebut antara lain adalah cekaman kekeringan, kelembaban air, suhu tinggi, suhu rendah dan kadar garam tinggi.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Berdasarkan variasi konsentrasi garam, semai B. cylindrica menunjukkan respon pertumbuhan terbaik pada salinitas 0.5% dan berdasarkan re-adaptasi semai B. cylindrica menunjukkan respon terbaik pada re-adaptasi 0.5% → 0%. Semakin tinggi salinitas dapat menghambat pertumbuhan semai B. cylindrica. Komposisi senyawa polyisoprenoid yang ditemukan pada semai B. cylindrica yaitu senyawa dolichol dengan Tipe I, dengan panjang rantai karbon yang ditemukan pada jaringan daun dan akar bekisar antara C75 – C95, C80 – C100, C85 – C95, C80 – C105.
Saran
Sebaiknya pertumbuhan semai B. cylindrica yang di tanam di rumah kaca hanya dipengaruhi oleh faktor lingkungan yang homogen saja, agar dapat membantu pertumbuhan yang optimal sehingga mengurangi persen kematian pada semai B. cylindrica.
