UJI AKTIVITAS PENGHAMBATAN ENZIM ALFA-GLUKOSIDASE EKSTRAK AIR DAUN SAMBILOTO Andrographis Paniculata (Burm.F.)
Nees SECARA IN VITRO
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Agatha Febriana Ati Maia NIM: 168114006
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria.
Karya ilmiah ini saya persembahkan untuk:
Kedua orang tua saya dan adik-adik saya yang senantiasa selalu memberikan saya
dukungan dan semangat serta doa yang tiada henti untuk saya.
Teman-teman dan sahabat seperjuangan yang selalu
memberikan semangat dan motivasi
Dosen pembimbing maupun dosen penguji yang telah membantu saya dalam
proses penelitian skripsi hingga saat saya bisa menyelesaikan skripsi saya.
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ...i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv
PERNYATAAN KEASLIAN NASKAH ...v
PERSETUJUAN PUBLIKASI ... vi PRAKATA... vii DAFTAR ISI ... ix DAFTAR TABEL ...x DAFTAR GAMBAR ... xi ABSTRAK ... xii ABSTRACT ... xiii PENDAHULUAN ...1 METODE PENELITIAN ...2
Alat dan Bahan ...2
Determinasi ...2
Penetapan Kadar Air Simplisia Daun Sambiloto ...3
Pembuatan Ekstrak Air Sambiloto ...3
Identifikasi Kualitatif Ekstrak Air Daun Sambiloto dengan KLT ...4
Uji Senyawa Terpenoid ...4
Uji Penghambatan Enzim Alfa-Glukosidase ...4
Analisis Data ...8
HASIL DAN PEMBAHASAN ...9
Determinasi Sampel Sambiloto...9
Penetapan Kadar Air ...9
Ekstraksi Daun Sambiloto dengan Pelarut Air ...10
Uji Senyawa Terpenoid ...10
Identifikasi Kualitatif Ekstrak Air Daun Sambiloto dengan KLT ...12
Uji Penghambatan Aktivitas Enzim Alfa-Glukosidase Ekstrak Air Daun Sambiloto...14 KESIMPULAN ...22 SARAN ...22 DAFTAR PUSTAKA ...23 LAMPIRAN ...27 BIOGRAFI PENULIS ...36
x
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Nilai IC50 Acarbose ...17
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Uji tabung senyawa terpenoid ekstrak air daun sambiloto ...11 Gambar 2. Profil KLT Ekstrak Air Daun sambiloto ...12 Gambar 3. Struktur Molekul Andrografolid ...13 Gambar 4. Pemanasan dengan gula pereduksi, gugus 3-nitro (NO2) dari DNSA direduksi menjadi gugus amino (NH2) ...16 Gambar 5. Hubungan persen (%) Inhibisi dengan Konsentrasi Pembanding Acarbose ...17 Gambar 6. Hubungan persen (%) Inhibisi dengan Konsentrasi Ekstrak Air Daun Sambiloto ...19 Gambar 7. Perbandingan % Inhibisi Ekstrak Air Daun Sambiloto dan Acarbose ...21
xii
ABSTRAK
Latar belakang: Diabetes melitus adalah penyakit yang ditandai dengan kadar gula darah tinggi yang disebabkan oleh gangguan pada sekresi insulin atau gangguan kerja insulin ataupun keduanya. Tubuh penderita diabetes melitus tidak dapat memproduksi atau merespon hormon insulin yang dihasilkan oleh organ pankreas. Enzim alfa-glukosidase merupakan enzim penting yang berperan pada hidrolisis karbohidrat menjadi glukosa. Salah satu obat tradisional yang telah diteliti memiliki efek antidiabetik adalah herba sambiloto (Andrographis paniculata Nees,). Penelitian bertujuan untuk mengetahui aktifitas penghambatan enzim alfa-glukosidase dengan ekstrak air daun sambiloto (Andrographis paniculata) sehingga hasil yang diperoleh dapat dimanfaatkan sebagai alternatif terapi diabetes melitus tipe 2.
Metode: Ekstrak air daun sambiloto menggunakan teknik dekok dengan pelarut air, pengujian aktivitas penghambatan enzim alfa-glukosidase menggunakan metode kolorimetri dengan reagen DNS dan menghitung IC50
Hasil: Ekstrak air daun sambiloto memiliki kemampuan dalam menghambat enzim alfa-glukosidase, persen penghambatan pada konsentrasi tertinggi sebesar 69,23%, dibandingkan dengan acarbose 82,99%. Nilai IC50 yang diperoleh ekstrak air daun
sambiloto ialah 2,29±0,513, dan acarbose 2,19±0,078. Secara statistik diketahui bahwa tidak ada perbedaan signifikan antara acarbose dengan ekstrak air daun sambiloto, nilai (P> 0,05)
Kesimpulan: Ekstrak air daun sambiloto dapat menghambat aktivitas enzim alfa- glukosidase.
Kata kunci: Enzim alfa-glukosidase, Ekstrak air daun sambiloto, Dekok, Colorimetri, IC50
xiii
ABSTRACT
Background: Diabetes mellitus is a disease characterized by high blood sugar levels caused by disturbances in insulin secretion or insulin work disorders or both. The body of people with diabetes mellitus cannot produce or respond to the insulin hormone produced by the pancreas. Traditional medicines that have been studied to have an anti diabetic effect is the herb (Andrographis paniculata Nees). This study aims to determine the inhibitory activity of alpha-glucosidase enzymes with water extract of sambiloto leaves so that the results obtained can be used as an alternative therapy for type 2 diabetes mellitus.
Method: The water extract of sambiloto leaves used the dekok technique with water solvent, the inhibition of alpha-glucosidase activity using the colorimetric method with the control reagent and calculated the IC50.
Result: The water extract of sambiloto can inhibit the alpha-glucosidase enzyme, percent inhibition at the highest concentration was 69.23%, compared to 82.99% of acarbose. The IC50 water extract were 2,29±0,513, and acarbose 2,19±0,078. It was
statistically no significant difference between acarbose and aqueous extract of sambiloto, value (P> 0.05)
Conclusion: Sambilotowater extract can inhibit alpha glucosidase enzyme activity.
Keyword: Enzim alfa-glukosidase, Ekstrak air daun sambiloto, Dekok, Colorimetri, IC50
1 PENDAHULUAN
Diabetes melitus tipe 2 menjadi masalah kesehatan dunia karena prevalensi dan insiden penyakit ini terus meningkat, baik di negara industri maupun negara berkembang, termasuk juga Indonesia (Decroli, 2019). Diabetes Melitus (DM) adalah gangguan metabolisme yang ditandai dengan hiperglikemia yang berhubungan dengan abnormalitas metabolisme karbohidrat, lemak dan protein yang disebabkan oleh penurunan sekresi insulin atau penurunan sensitivitas insulin atau keduanya. Kurangnya jumlah dan daya kerja insulin menyebabkan glukosa tidak dapat dimanfaatkan oleh sel sehingga hanya berakumulasi dalam darah (Paramitha dan Soraya, 2016). Diabetes tipe 2 adalah jenis diabetes yang paling umum, terhitung sekitar 90% di seluruh dunia (IIDF, 2019)
Enzim alfa-glukosidase merupakan enzim penting yang berperan pada hidrolisis karbohidrat menjadi glukosa. Penghambatan pada enzim ini akan memberikan dampak pada penundaan penyerapan glukosa dengan menghambat enzim karbohidrat, seperti alfa-amylase dan alfa-glukosidase (Yuniarto & Selifiana, 2018), Penghambatan enzim alfa-glukosidase dan alfa-amilase yang terlibat dalam pencernaan karbohidrat, secara signifikan dapat menurunkan peningkatan glukosa darah postprandial setelah diet karbohidrat dan bisa menjadi hal yang penting dalam pengelolaan postprandial kadar glukosa darah pada pasien diabetes tipe 2 dan pasien borderline (Subramanian etal., 2008).
Masyarakat di Indonesia telah lama mengenal dan menggunakan tanaman obat tradisional sebagai obat penanggulangan masalah kesehatan. Pengetahuan tentang tanaman berkhasiat obat berdasarkan pada pengalaman dan keterampilan yang diwariskan secara turun temurun dari generasi satu ke generasi berikutnya Salah satu obat tradisional yang telah diteliti memiliki efek antidiabetik adalah herba sambiloto (Andrographis paniculata Nees). Senyawa aktif utama
Andrographis paniculata adalah andrografolid yang memberikan rasa pahit dan banyak terdapat pada batang dan daun (Paramitha & Rahamanisa, 2016). Andrografolid berlimpah dalam daun dan dapat dengan mudah diisolasi dari ekstrak tanaman mentah sebagai padatan kristal (Chao and Lin, 2010). Berbagai penelitian menunjukan efek farmakologis dari ekstrak sambiloto. Diantaranya sebagai
2
penurun panas, antiracun analgesik, bakteriostatik, hepatoprotektor, pencegah infeksi, anti inflamasi, menurunkan kadar glukosa darah, antioksidan dan antidiare, antikanker, antimalarial dan mengobati infeksi saluran pernapasan atas (Sasmito, 2017).
Penelitian ini akan menggunakan metode dekokta karena merupakan salah satu metode ekstraksi yang dapat dilakukan oleh masyarakat tanpa menggunakan alat khusus, seperti metode ekstraksi lainnya. Menggunakan pelarut air, sambiloto dapat diseduh dan aman dikonsumsi seperti yang sudah dilakukan oleh masyarakat. Pada penelitian ini digunakan metode in vitro untuk mengetahui kemampuan sambiloto dalam menghambat enzim alfa-glukosidase. Pengujian in vitro juga bermanfaat dalam menentukan aktivitas farmakologi tanaman yang mengandung banyakkomponen kimia mana yang berkhasiat dan mana yang tidak dalam skala yang lebih sedehanadibanding pengujian in vivo (Rais dkk, 2013).
METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu panci dekok, termometer suhu, kain flanel, gelas beaker, penangas air, cawan porselen, waterbath, batang pengaduk, labu ukur, pipet ukur, tabung reaksi, Ph meter, mikropipet, mikro tube,
glassfirm, timbangan analitik, vortex, inkubator, gelas ukur, pipet tetes, spektrofotometri Uv-Vis (UVmini-1240 Shimadsu).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu serbuk daun sambiloto dari PT HRL, Gresik, Jawa Timur, Indonesia. Enzim alfa-glukosidase (Sigma Aldrich), Acarbose, Maltosa, DMSO, buffer fosfat Ph 7, aquadest, DNS, reagen
Liebermann burchad.
Determinasi Tanaman
Bahan uji berupa serbuk daun sambiloto diperoleh dari PT HRL, Gresik, Jawa Timur, Indonesia kemudian determinasi dilakukan di Departemen Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gadja Mada.
3
Penetapan Kadar Air Simplisia Daun Sambiloto
Penetapan kadar air dilakukan dengan menggunakan metode destilasi toluen. Prosedur yang dilakukan adalah masukkan lebih kurang 200 mL toluen jenuh air ke dalam labu, pasang rangkaian alat. Masukkan toluen jenuh air ke dalam tabung penerima melalui pendingin sampai leher alat penampung. Panaskan labu dengan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mulai mendidih, atur penyulingan dengan kecepatan Jebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian besar air tersuling, kemudian naikkan kecepatan penyulingan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dicuci dengan toluen jenuh air, sambil dibersihkan dengan sikat tabung yang disambungkan pada sebuah kawat tembaga dan telah dibasahi dengan toluen jenuh air. Lanjutkan penyulingan selama 5 menit. Dinginkan tabung penerima hingga suhu ruang. Jika ada tetes air yang melekat, gosok tabung pendingin dan tabung penerima dengan karet yang diikatkan pada sebuah kawat tembaga dan dibasahi dengan toluen jenuh air hingga tetesan air turun. Baca volume air setelah air dan toluen memisah sempuma. Kadar air dihitung dalam % v/b (Departemen Kesehatan RI, 2008). Kadar air dihitung dengan rumus
Kadar air = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑎𝑖𝑟 (𝑚𝐿)
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 (𝑚𝑔) 𝑥 100%
Pembuatan ekstrak air sambiloto
Ekstrak sambiloto dibuat dengan metode ekstraksi dekok, dengan mencampurkan 10 g simplisia dan 100 ml aquadest kedalam panci, lalu dipanaskan diatas penangas air selama 30 menit terhitung mulai suhu 90°C sambil sekali-sekali diaduk. Serkai selagi panas dengan kain flanel, tambahkan air panas secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume dekok yang dikehendaki (BPOM, 2012). Filtrat hasil dekokta kemudian diuapkan menggunakan cawan porselen di atas
waterbath dengan suhu 60oC sehingga diperoleh ekstrak kental daun sambiloto
(Rahmani dan Tuti, 2016). Kemudian rendemen dihitung menggunakan rumus: Rendemen = 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 (𝑔)
4
Identifikasi Kualitatif Ekstrak Daun Sambiloto dengan Kromatografi Lapis Tipis
Kandungan andrografolid dalam ekstrak air sambiloto di tetapkan dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis. Fase diam yang digunakan adalah
silica gel 60 F254, dengan fase gerak yang digunakan yaitu n-heksan dan etil asetat
dengan perbandingan (2:8). Larutan uji (Sampel) 5% dibuat dengan mencampurkan ekstrak air sambiloto dan dilarutkan didalam etanol. Larutan pembanding yang digunakan adalah andrografolid yang dibuat 0,1% dengan melarutkan kedalam etanol p.a. Penotolan Larutan pembanding sebanyak 2µ dan penotolan sampel ekstrak sebanyak 20µ pada silica gel 60 F254 yang telah dikering anginkan.
Kemudian lempeng KLT dimasukan kedalam chamber yang berisi fase gerak yang sudah jenuhkan. Dilihat elusi dari totolan hingga batas 10 cm pada lempeng plat KLT, kemudian lempeng KlT dikering anginkan lalu dibaca bercaknya dibawah sinar UV 254 nm kemudian dilakukan perhitungan nilai Rf (Retardation factor) dengan rumus:
Rf = 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑧𝑎𝑡 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡
(Departemen Kesehatan Republik Indonesia,2008). Uji Senyawa Terpenoid
Uji senyawa terpenoid dilakukan dengan pengujian warna. Prosedur yang dilakukan adalah memasukan 2 ml ekstrak dicampur dengan kloroform 2ml dan 3 ml H2SO4 pekat. Pereaksi Liebermann-Burchard terdiri dari anhidrida asam asetat
(p.a), dan asam sulfat (p.a) dengan perbandingan 3:1 ditambahkan dengan hati-hati dan dikocok dengan baik. Hasil positif untuk terpenoid dicatat oleh penampilan warna coklat kemerahan dari interfase (Sheel and Kumari, 2014).
Uji Penghambatan Enzim Alfa-Glukosidase Penyiapan larutan uji
Larutan buffer Ph 7, larutan DMSO 1%, larutan enzim 1 mg dalam 100 ml, larutan maltosa 2 %, pembuatan larutan seri konsentrasi sampel, pembuatan larutan seri pembanding acarbose, larutan DNS.
5 Pembuatan Larutan Buffer Ph 7
Ditimbang 3,4 mg Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4) kemudian di larutkan dalam aquadest lalu dicampurkan dengan larutan NaOH 2M perlahan-lahan lalu ukur Ph larutan menggunakan Ph meter.
Pembuatan larutan Stok
Ditimbang 1000 mg ekstrak kental daun sambiloto, kemudian dilarutkan 10 ml
buffer fosfat Ph 7. Preparasi Enzim
Ditimbang 1 mg enzim alfa-glukosidase kemudian dilarutkan dalam 100 ml buffer
fosfat Ph 7.
Preparasi Acarbose
Sepuluh tablet acarbose @100 mg diproduksi oleh PT. Dexa Medica, Indonesia digerus kemudian ditimbang sebanyak 1 g lalu dilarutkan dalam 100 ml buffer.
Preparasi Maltosa 2%
Ditimbang 2 g maltosa kemudian dilarutkan dalam 100 ml buffer fosfat Ph 7. Pembuatan larutan DNS
Ditimbang 300 mg DNS dicampur dengan 10 ml NaoH 2M yang dibuat dengan menimbang NaoH sebanyak 0,8 g kemudian dilarutkan dalam 10 ml aquadest, lalu diaduk kemudian tambahkan 15 g Na K tartrat sedikit demi sedikit sampai terlarut lalu di add aquadest sebanyak 50 ml.
Optimasi Panjang gelombang
Larutan dapar fosfat Ph 7 dipipet sebanyak 0,5 ml, larutan ekstrak dipipet dengan konsentrasi terkecil 0,52 mg/ml (dengan pengenceran 0,52;1,04;2,08;3,13;4,16 mg/ml) sebanyak 0,3 ml kemudian dimasukan dalam tabung reaksi. Pipet larutan enzim sebanyak 0,3 ml lalu campuran tersebut di vortex. Dilakukan preinkubasi didalam inkubator dengan suhu 37Oc selama 5 menit. Setelah itu tambahkan larutan
maltosa sebanyak 0,3 ml kemudian diinkubasi didalam inkubator dengan suhu 37oc
selama 15 menit. Setelah diinkubasi ditambahkan 1 mL DNS, tabung reaksi berisi campuran tersebut di vortex lalu direndam kedalam air mendidih selama 10 menit
6
untuk menghentikan reaksi, kemudian diukur panjang gelombang dengan mengukur pada spektrofotometer Uv-Vis dengan panjang gelombang 400-800 nm.
Penentuan Optimization Time (OT)
Larutan enzim alfa-glukosidase dalam 100 mL dapar fosfat pH 7 sejumlah 0,3 mL, larutan dapar fosfat sejumlah 0,5 mL, dan larutan ekstrak konsentrasi terkecil (0,52 mg/mL) sebanyak 0,3 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dilakukan pre-inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian ditambahkan substrat maltosa
sejumlah 0,3 mL dan diinkubasi selama 5; 10; 15; 20; dan 30 menit pada suhu 37oC.
Dilakukan penambahan reagen DNS sejumlah 1 mL dan dipanaskan selama 10 menit untuk menghentikan reaksi enzimatik. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum.
Pengujian larutan blanko
Larutan enzim alfa-glukosidase dalam 100 mL dapar fosfat pH 7 sejumlah 0,3 mL, larutan DMSO sejumlah 0,3 mL dan larutan dapar fosfat sejumlah 0,5 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dilakukan pre-inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian ditambahkan substrat maltosa sejumlah 0,3 mL dan
diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC. Dilakukan penambahan reagen DNS
sejumlah 1 mL dan dipanaskan selama 10 menit untuk menghentikan reaksi enzimatik. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan 3 kali replikasi.
Pengujian larutan kontrol blanko
Larutan dapar fosfat sejumlah 0,8 mL dan larutan DMSO sejumlah 0.3 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dilakukan pre-inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian ditambahkan substrat maltosa sejumlah 0,3 mL dan
diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC. Dilakukan penambahan reagen DNS
sejumlah 1 mL dan dipanaskan selama 10 menit untuk menghentikan reaksi enzimatik. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan 3 kali replikasi.
7 Pengujian larutan uji sampel
Larutan enzim alfa-glukosidase dalam 100 mL dapar fosfat pH 7 sejumlah 0,3 mL, larutan dapar fosfat sejumlah 0,5 mL, dan larutan ekstrak seri 0,52;1,04;2,08;3,13;4,16 mg/mL masing-masing sebanyak 0,3 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dilakukan pre-inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC.
Kemudian ditambahkan substrat maltosa sejumlah 0,3 mL dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC. Dilakukan penambahan reagen DNS sejumlah 1 mL dan
dipanaskan selama 10 menit untuk menghentikan reaksi enzimatik. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan 3 kali replikasi.
Pengujian larutan kontrol uji
Larutan dapar fosfat pH 7 sejumlah 0,8 mL, larutan ekstrak seri konsentrasi 0,52;1,04;2,08;3,13;4,16 mg/mL masing-masing sebanyak 0,3 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dilakukan pre-inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC.
Kemudian ditambahkan substrat maltosa sejumlah 0,3 mL dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC. Dilakukan penambahan reagen DNS sejumlah 1 mL dan
dipanaskan selama 10 menit untuk menghentikan reaksi enzimatik. Serapan diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan 3 kali replikasi.
Pengujian larutan Acarbose
Larutan enzim alfa-glukosidase dalam 100 mL dapar fosfat pH 7 sejumlah 0,3 mL, larutan dapar fosfat sejumlah 0,5 mL, dan larutan pembanding acarbose dengan seri konsentrasi 0,52;1,04;2,08;3,13;4,16 mg/mL masing-masing sebanyak 0,3 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dilakukan pre-inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian ditambahkan substrat maltose sejumlah 0,3 mL dan
diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC. Dilakukan penambahan reagen DNS
sejumlah 1 mL dan dipanaskan selama 10 menit untuk menghentikan reaksi enzimatik. Serapan diukur dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan 3 kali replikasi.
8 Pengujian larutan kontrol Acarbose
Larutan dapar fosfat pH 7 sejumlah 0,8 mL, larutan pembanding acarbose dengan seri konsentrasi 0,52;1,04;2,08;3,13;4,16 mg/mL masing-masing sebanyak 0,3 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dilakukan pre-inkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC. Kemudian ditambahkan substrat maltosa sejumlah 0,3 mL dan
diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC. Dilakukan penambahan reagen DNS
sejumlah 1 mL dan dipanaskan selama 10 menit untuk menghentikan reaksi enzimatik. Serapan diukur dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan 3 kali replikasi.
Analisis data
Data dianalisis secara statistik pertama dilakukan uji distribusi normalitas dengan Shapiro-Wilk, apabila data terdistribusi normal (P>0,05), dilanjutkan dengan uji sampel tidak berpasangan (idendependent sample t-test) dengan taraf kepercayaan 95% dan jika P<0,05 maka dipertimbangkan signifikan secara statistik.
Presentase penghambatan dihitung sebagai:
%𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛 = [𝐴𝑏𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐴𝑏𝑠 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑠
𝐴𝑏𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 ] × 100
Konsentrasi larutan uji yang menghambat 50% enzim alfa-glukosidase dihitung dengan Regresi Linear dimana sumbu x adalah konsentrasi dan sumbu y adalah % penghambatan, setelah mendapatkan persamaan y= bx + a kemudian dimasukan ke dalam rumus:
IC50 =
50−a b
9 HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi sampel sambiloto
Tujuan dilakukannya determinasi sampel adalah untuk mengetahui kebenaran dari sampel sambiloto yang diteliti agar tidak terjadi kesalahan bahan utama yang digunakan dalam proses penelitian. Determinasi dilakukan di Departemen Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada dengan mengidentifikasi serbuk simplisia daun sambiloto. Morfologi tanaman sambiloto yaitu termasuk tumbuhan berhabitus terna semusim, tumbuh tegak, tingginya dapat mencapai 90 cm. Batang sambiloto berbentuk segi empat dengan rusuk yang jelas, menebal di bagian buku-buku batang. Helaian daun merupakan daun tunggal, terletak bersilang berhadapan, helaian daun bentuk lanset, ukuran 3-12 x 1-3 cm, panjang tangkai daun 0,2-0,5 cm, pangkal dan ujung helaian daun runcing, tepi daun rata, permukaan atas hijau tua, bagian bawah hijau muda (Sasmito, 2017).
Hasil yang diperoleh dari identifikasi serbuk simplisia daun sambiloto adalah benar merupakan tanaman Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees, dari suku Acanthaceae dengan mengacu pada hasil penelitian dari Chang (2020), karena menggunakan sampel sambiloto dari sumber yang sama.
Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan mengacu pada Farmakope Herbal Indonesia (2017), dengan menggunakan destilasi toluen. Tujuan dilakukan penetapan kadar air pada simplisia adalah untuk menjamin keamanan dan kualitas simplisia yang akan digunakan memiliki kadar air yang telah ditetapkan, kadar air yang tinggi akan mengakibatkan pertumbuhan mikroba atau jamur. Serbuk simplisia daun sambiloto ditimbang sebanyak 10,000 gram, volume yang didapat 0,6 ml. Maka kadar air serbuk daun sambiloto yang diperoleh adalah 6% menunjukan bahwa serbuk simplisia yang digunakan sesuai dengan syarat yang sudah ditetapkan yaitu ≤ 10%.
10
Ekstraksi Daun Sambiloto dengan Pelarut Air
Pada penelitian ini ekstraksi dilakukan dengan metode dekok. Ditimbang 10g serbuk simplisia daun sambiloto kemudian dilarutkan dalam 100 ml aquadest
lalu dimasukan kedalam panci dekok. Dekok adalah ekstraksi dengan menggunakan pelarut air dengan temperatur penangas air yaitu 900C selama 30
menit, waktu terhitung setelah suhu sudah mencapai 900C. Setelah itu larutan hasil
dekok di saring dengan menggunakan kain flannel kemudian larutan tersebut dipanaskan kembali menggunakan waterbath dengan temperatur 600C untuk
memperoleh ekstrak kental daun sambiloto dan dihitung rendemennya. Adapun hasil rendemen ekstrak air daun sambiloto untuk ketiga replikasi yaitu 13,93%; 11,39% dan 14,22% sehingga hasil rendemen yang diperoleh sesuai dengan syarat yang ditetapkan yaitu lebih dari 9,6%.
Metode konvensional yang telah diterapkan dalam ekstraksi andrografolid adalah ekstraksi menggunakan alkohol, diantaranya maserasi menggunakan pelarut etanol 85%. Metode konvensional tersebut meskipun efektif, ternyata berakibat negatif terhadap perolehan andrografolid seperti mengakibatkan terjadinya degradasi thermal karena senyawa andrografolid merupakan senyawa yang sensistif terhadap panas, terjadinya degradasi andrografolid akibat reaksi esterifikasi dengan alkohol dan meninggalkan residu pelarut yang bersifat toksik (Ratnani dkk, 2012).
Uji Senyawa Terpenoid
Percobaan ini berdasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Sheel and Kumari, 2014. Sambiloto mengandung diterpen, lakton, dan flavanoid. Kandungan lakton diterpen yang diisolasi dari daun sambiloto berkisar antara 0,1 -2% (Royani dkk, 2014). Terbentuk cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan menunjukkan adanya terpenoid, Hasil identifikasi kandungan kimia menunjukan bahwa ekstrak air daun sambiloto mengandung senyawa golongan terpenoid.
11
Gambar 1.Uji tabung senyawa terpenoid ekstrak air daun sambiloto. Prinsip reaksi dalam mekanisme reaksi uji terpenoid kondensasi atau pelepasan H2O dan penggabungan dengan karbokation. Reaksi ini diawali dengan
proses asetilasi gugus hidroksil menggunakan asam asetat anhidrida gugus asetil yang merupakan gugus pergi yang baik akan lepas, sehingga terbentuk ikatan rangkap. Selanjutnya terjadi pelepasan gugus hidrogen beserta elektronnya, mengakibatkan ikatan rangkap berpindah. Senyawa ini mengalami resonansi yang bertindak sebagai elektrofil atau karbokation. Serangan karbokation menyebabkan adisi elektrofilik, diikuti pelepasan hidrogen. Kemudian gugus hidrogen beserta elektronnya dilepas, akibatnya senyawa mengalami perpanjangan konjugasi yang memperlihatkan munculnya warna merah-ungu (Siadi, 2012).
Pereaksi Liebermann-Burchard merupakan campuran antara asam setat anhidrat dan asam sulfat pekat. Alasan digunakannya asam asetat anhidrat adalah untuk membentuk turunan asetil dari steroid yang akan membentuk turunan asetil didalam kloroform. Apabila mengandung terpenoid, maka akan memberikan warna merah. Metanol dan etanol dapat digunakan untuk melarutkan sampel yang akan diidentifikasi. Sebagian besar komponen bioaktif yang terkandung dalam matriks tumbuhan merupakan molekul berukuran sedang. Karena adanya elektron yang terdelokalisasi aromatik, molekul-molekulnya sangat terpolarisasi. Polarisabilitasnya yang tinggi membuat molekul rentan terhadap berbagai interaksi spesifik dengan pelarut polar, misalnya protonasi, ikatan hidrogen, dan solvasi spesifik (Kumoro et al, 2009). Struktur senyawa terpenoid biasanya mengandung
12
atom oksigen, seperti alkohol, aldehida, keton, dan asam karboksilat. Karena banyaknya struktur yang berbeda, gugus terpenoid mencakup senyawa dengan banyak sifat fisik dan kimia yang berbeda (Rivas et al., 2013).
Identifikasi Kualitatif Ekstrak Air Daun Sambiloto dengan Kromatografi Lapis Tipis
Uji kualitatif bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa kimia yang terdapat dalam ekstrak. Pemisahan yang terjadi pada kromatografi lapis tipis (KLT) berdasarkan pada adsorbsi, partisi atau kombinasi kedua efek, tergantung pada jenis lempeng, fase diam dan gerak yang digunakan. Pada umumnya KLT lebih banyak digunakan untuk identifikasi karena cara ini sederhana dan mudah, serta memberikan pilihan fase gerak yang lebih beragam.
Identifikasi dilakukan dengan ekstrak air sambiloto. Senyawa pembanding andrografolid digunakan untuk melihat ada tidaknya senyawa tersebut dalam ekstrak yang diuji. Fase diam yang digunakan yaitu plat silica gel GF254 dengan fase
gerak yang digunakan adalah n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan (2:8). Berdasarkan Farmakope Herbal Indonesia 2017, pembanding yang digunakan yaitu andrografolid murni 0,1%.
Gambar 2. Profil KLT Ekstrak Air Daun sambiloto
Keterangan gambar: Pemeriksaan dilakukan dibawah sinar UV 254 nm. A: Baku Andrografolid, B: Ekstrak air daun sambiloto.
13
Hasil kromatogram pada pengamatan di bawah UV 254 nm terdapat bercak pada hasil yang diperoleh dari pengujian nilai Rf dari senyawa pembanding adalah 0,33 dan nilai Rf dari senyawa uji adalah 0,47. Hasil yang didapat berbeda dari nilai Rf yang didapat tetapi warna bercak yang dihasilkan sama, sehingga belum dapat dipastikan apakah senyawa yang diuji mengandung senyawa andrografolid atau tidak. Hal ini bisa terjadi kemungkinan karena polaritas air terhadap andrografolid rendah sehingga kuantitas andrografolid pada ekstrak air rendah.
Bahan alam yang terdiri dari bagian tanaman seperti daun memiliki struktur sel yang terdiri dari lipoprotein yang memiliki struktur lemak non polar dan struktur protein yang memiliki sifat polar. Struktur ini sulit dilalui oleh pelarut yang sangat non polar dan pelarut air yang bersifat sangat polar sehingga kedua pelarut tidak dapat mengekstraksi senyawa aktif andrografolid dari dalam sel daun dengan baik. Pelarut dengan indeks polaritas pertengahan atau semi polar seperti kloroform dan etanol dapat menembus dinding sel daun dengan baik sehingga proses penyarian senyawa andrografolid dari dalam sel dengan kedua pelarut semi polar ini lebih rekomendasikan. Meskipun sedikit larut dalam air, hasil analisis kualitatif ekstrak air tidak menunjukkan adanya noda andrografolid. Sehingga, faktor yang mempengaruhi penyarian senyawa target ekstraksi andrografolid dari sambiloto tidak hanya pada daya larut senyawa andrografolid ke dalam pelarut yang digunakan tetapi juga daya tembus pelarut tersebut melewati dinding sel bagian tanaman yang digunakan.
14
Selain andrografolid ekstrak air juga banyak mengandung flavonoid dan glikosida hal ini dibuktikan dengan adanya penelitian dari Polash et. al (2017) dan pada penelitian dari Pandey et. al (2011) menyatakan bahwa ekstrak air sambiloto mengandung alkaloid, asam amino, flavonoid, glikosida, saponin dan tanin. Dengan adanya kandungan glikosida dalam ekstrak air daun sambiloto kemungkinan memberikan penghambatan pada enzim, glikosida ini adalah turunan quercetin
yang sangat larut dalam air, di mana satu D-glukosa terikat pada rutin (quercetin -3- O-glukosil-rhamnose), (Matsumoto et. al, 2004), Banyak glikosida yang larut dalam air atau larutan hidro alkoholik karena sifat kelarutan residu gula memberikan efek yang cukup besar, yaitu bagian gula meningkatkan kelarutan air. Glikosida biasanya larut dalam air, karena glikosida di dalam tanaman disertai dengan enzim spesifik yang mampu mempengaruhi hidrolisisnya, enzim ini pertama-tama harus dinonaktifkan. Jaringan tanaman dapat diekstraksi dengan air panas atau alkohol panas, sehingga walaupun pada uji kualitatif senyawa andrografolid tidak muncul tetapi senyawa-senyawa yang mampu larut dalam air, memberikan aktivitas penghambatan, ini di dukung juga oleh penelitian Aba and Asuzu, (2018), yang menyatakan bahwa produk alami tumbuhan memiliki kemampuan untuk menurunkan nilai glukosa darah dan memperbaiki diabetes dengan mengurangi efek samping yang merugikan, karena adanya fitokimia seperti flavonoid, saponin, alkaloid, tanin, glikosida, terpen.
Uji Penghambatan Aktivitas Enzim Alfa-glukosidase Ekstrak Air Daun Sambiloto
Sebelum melakukan pengujian penghambatan aktivitas enzim, dilakukan pengujian panjang gelombang maksimum pada ekstrak air daun sambiloto dan pengujian waktu inkubasi agar mendapatkan hasil penghambatan enzim yang optimal. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan konsentrasi terkecil dari seri konsentrasi yaitu 1,25 mg/ml kemudian dilakukan pengukuran spektrum pada spektrofotometer UV-Vis dengan rentang panjang gelombang 400-800 nm. Optimasi panjang gelombang dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan serapan yang maksimum. Selain itu juga untuk mendapatkan hasil yang akurat dan konsisten agar ketika dilakukan replikasi pada pengukuran. Hasil panjang
15
gelombang yang diperoleh adalah 536 nm perbedaan hasil panjang gelombang yang didapat tidak jauh berbeda dengan penelitian menurut Manikandan et al., tahun 2013, maltosa diukur dengan reduksi 3, 5 asam salisilat dinitro menjadi 3 -amino-asam nitro salisilat. Reaksi ini terdeteksi pada 540 nm. Panjang gelombang diatur ke 540 nm karena itu adalah wilayah di mana warna oranye-merah menyerap.
Penentuan waktu inkubasi dilakukan sama seperti melakukan pengujian pada panjang gelombang dengan variasi waktunya yaitu 5,10,15,20,30. Tujuan dilakukan pengukuran waktu inkubasi yaitu untuk memperoleh waktu inkubasi yang optimal pada saat reaksi berlangsung Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang telah diperoleh yaitu 536 nm. Dari pengukuran diambil hasil absorbansi yang stabil, hasil yang diperoleh yaitu 15 menit.
Uji penghambatan enzim alfa-glukosidase menggunakan metode DNS. Metode ini mengukur konsentrasi reduksi glukosa yang ada dari substrat maltosa setelah diberi perlakuan dengan enzim alfa-glukosidase. Kemudian diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 536 nm.
Alfa-glukosidase merupakan enzim yang terdapat di usus yang mengkatalisis pemecahan kelompok polisakarida untuk dapat diabsorpsi dalam bentuk monosakarida (Riyanti dkk, 2018). Salah satu pendekatan terapeutik untuk mengobati diabetes adalah dengan memperlambat penyerapan glukosa melalui penghambatan enzim, seperti alfa-glukosidase yang terdapat di dalam organ pencernaan. Enzim ini terikat membran yang ada di epitel usus halus yang berfungsi untuk memudahkan penyerapan glukosa oleh usus halus dengan mengkatalisis pembelahan hidrolitik oligosakarida menjadi monosakarida (Permata Yuda et al., 2019).
Pada penelitian ini digunakan maltosa sebagai substrat, maltosa adalah disakarida yang terdiri dari dua subunit monomer glukosa. Ini juga disebut gula malt. Maltosa merupakan gula pereduksi karbohidrat yang memiliki aldehida atau keto sedangkan Asam salisilat 3, 5-Dinitro (DNS) sebagai reagen. Maltosa mereduksi asam salisilat 3,5-Dinitro basa berwarna kuning pucat menjadi asam salisilat berwarna oranye-merah, 3 amino, 5 nitro salisilat. Acarbose digunakan sebagai pembanding karena merupakan penghambat enzim alfa-glukosidase yang
16
bekerja menghambat penyerapan karbohidrat dengan menghambat enzim disakarida di usus. Obat ini terutama menurunkan glukosa darah setelah makan. Hal tersebut berdasarkan hasil kajian mekanisme kerja acarbose dan daun sambiloto yaitu memiliki mekanisme kerja yang sama dalam menghambat enzim alfa-glukosidase sehingga efek sinergis dalam menurunkan kadar glukosa dapat diperoleh (Sukmawati, 2016).
Serangkaian larutan yang mengandung berbagai konsentrasi maltosa disiapkan dalam tabung reaksi dan sejumlah DNS yang diketahui ditambahkan ke masing-masing. Tabung reaksi ini kemudian dipanaskan di atas penangas air selama 10 menit.
Gambar 4. Pemanasan dengan gula pereduksi, gugus 3-nitro (NO2) dari
DNSA direduksi menjadi gugus amino (NH2).
Warna reagen berubah dari kuning menjadi oranye atau merah, tergantung pada konsentrasi gula reduksi yang ada. Reaksi DNS adalah reduksi asam 3,5- dinitrosalisilat (DNS) menjadi asam 3-amino-5-nitro-salisilat (ANS) dan, selama proses ini, gugus gula aldehida dioksidasi menjadi masing-masing asam karboksilat, DNS secara konsisten memberikan warna yang lebih besar dengan disakarida dibandingkan dengan monosakarida (Saqib and Whitney,2011). Konsentrasi larutan sampel dan larutan pembanding dibuat bervariasi untuk memperoleh persen (%) penghambatan yang kemudian digunakan untuk menghitung nilai IC50.
17
Gambar 5. Hubungan persen (%) Inhibisi dengan Konsentrasi Pembanding Acarbose
Dari kurva diatas di dapatkan persamaan yang kemudian digunakan untuk mencari nilai IC50. Persamaan yang didapatkan dari hubungan konsentrasi dan
persen (%) inhibisi acarbose pada replikasi 1 yaitu y= 12,49x + 23,286 dengan nilai koefisien korelasi (r) adalah 0,8935. Persamaan yang didapatkan dari hubungan konsentrasi dan % inhibisi acarbose pada replikasi 2 yaitu y= 21,285x + 4,3237 dengan nilai koefisien korelasi (r) adalah 0,9928 kemudian persamaan yang didapatkan dari hubungan konsentrasi dan % iinhibisi acarbose pada replikasi 3 yaitu y= 21,228x + 1,6671, nilai koefisien korelasi (r) adalah 0,9793. Dari persamaan yang diperoleh dihasilkan nilai IC50 yang ditunjukan pada Tabel 1.
Tabel 1. Nilai IC50 Acarbose
Sampel r IC50 (mg/ml) Rata-rata IC50 (mg/ml) Replikasi 1 0.894 2,139 Replikasi 2 0,993 2,146 Replikasi 3 0,979 2,277 Rata-rata 0,955 2,187 2,19±0,078 y = 12,49x + 23,286 R² = 0,8935 0 20 40 60 80 0 2 4 6 % I n h ib is i Konsentrasi
1
y = 21,285x + 4,3237 R² = 0,9928 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 % I n h ib is i Konsentrasi2
y = 21,228x + 1,6671 R² = 0,9793 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 % I n h ib is i Konsentrasi3
18
Tabel diatas menunjukan nilai koefisien korelasi dan nilai IC50, nilai
koefisien korelasi yang diperoleh dengan rata-rata nilai r = 0,955, menunjukan linieritas yang baik dimana semakin mendekati 1 maka akan semakin linier. Kemudian untuk rata-rata hasil nilai 1C50 yang diperoleh yaitu 2,19±0,078 mg/ml,
hasil yang diperoleh berbeda dengan penelitian Subramanian et al., 2008, IC50
acarbose yang didapatkan adalah 6.2±0.33. Rais dkk, 2013 IC50 acarbose yang
didapatkan adalah 1,47mg/ml, dimana hasil yang diperoleh berbeda dengan hasil penelitian ini, hal ini bisa diakibatkan karena acarbose yang digunakan berasal dari sumber yang berbeda, pada penelitian ini digunakan tablet acarbose @100 mg yang diproduksi oleh PT. Dexa Medica Indonesia, sedangkan penelitian Subramanian et al., 2008, menggunakan acarbose yang diproduksi oleh Bayer Pharmaceuticals, Leverkusen, Germany, pada penelitian Rais dkk, 2013, sumber acarbose yang digunakan tidak diberitahukan pada penelitian tersebut.
Pada pengujian dilakukan variasi konsentrasi dengan tujuan untuk mengetahui adanya pengaruh penambahan konsentrasi pada peningkatan persen (%) inhibisi. Pada penelitian ini juga dilakukan pengujian blanko, untuk mengetahui aktivitas enzim tanpa adanya penghambatan kemudian kontrol blanko dilakukan untuk mengetahui apakah ada aktivitas tanpa adanya penambahan ekstrak dan enzim. Kontrol sampel dilakukan untuk mengetahui aktivitas dari ekstrak. Adapun pengujian sampel dilakukan untuk mengetahui aktivitas penghambatan yang terjadi. Pada pengukuran serapan digunakan DMSO sebagai blanko,
19
Ganbar 6. Hubungan persen (%) Inhibisi dengan Konsentrasi Ekstrak Air Daun Sambiloto
Dari kurva diatas di dapatkan persamaan regresi linear dari acarbose yang kemudian digunakan untuk mencari nilai IC50. Persamaan yang didapatkan dari
hubungan konsentrasi dan % inhibisi acarbose pada replikasi 1 yaitu y= 12,822x + 13,127, dengan nilai koefisien korelasi (r) adalah 0,9182. Persamaan yang didapatkan dari hubungan konsentrasi dan % inhibisi acarbose pada replikasi 2 yaitu y= 12,069x + 27,162 dengan nilai koefisien korelasi (r) adalah 0,9754 kemudian. Persamaan yang didapatkan dari hubungan konsentrasi dan % inhibisi acarbose pada replikasi 3 yaitu y= 7,7619x + 33,467, nilai koefisien korelasi (r) adalah 0,9938. Dari persamaan yang diperoleh dihasilkan nilai IC50 yang ditunjukan
pada Tabel 2. y = 12,822x + 13,127 R² = 0,9182 0 20 40 60 80 0 2 4 6 % I n h ib is i Konsentrasi
1
y = 12,069x + 27,162 R² = 0,9754 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 % In h ib is i Konsentrasi2
y = 7,7619x + 33,467 R² = 0,9938 0 10 20 30 40 50 60 70 0 2 4 6 % I n h ib is i Konsentrasi3
20
Tabel 2. Nilai IC50 Ekstrak Air Daun Sambiloto
Sampel r IC50 (mg/ml) Rata-rata IC50 (mg/ml) Replikasi 1 0.918 2,876 Replikasi 2 0,975 1,892 Replikasi 3 0,994 2,130 Rata-rata 0,962 2,299 2,29±0,513
Tabel diatas menunjukan nilai koefisien korelasi dan nilai IC50, nilai
koefisien korelasi yang diperoleh dengan rata-rata nilai r = 0,962, menunjukan linieritas yang baik dimana semakin mendekati 1 maka akan semakin linier. Kemudian untuk rata-rata hasil nilai 1C50 yang diperoleh yaitu 2,29±0,513 mg/ml.
hasil yang diperoleh berbeda dari penelitian Subramanian etal., 2008 dimana hasil yang didapatkan yaitu IC50 andrografolid 11.0±0.28 mg/ml. Selain itu juga pada
penelitian Rais dkk, 2013 IC50 yang didapatkan andrografolid yaitu 38,86 mg/ml.
Pada penelitian Dandu dan Inamdar, 2009 menyatakan bahwa ekstrak larut air herba sambiloto menunjukkan aktivitas antioksidan dengan menaikkan aktivitas Superoksida Dismutase (SOD) dan Katalase pada tikus menunjukkan penurunan yang signifikan dalam kadar glukosa darah puasa mungkin karena sifat antioksidannya. Dilaporkan juga rebusan herba sambiloto menurunkan kadar glukosa darah pada tikus DM tipe 1 yang diinduksi aloksan (Reyes et al., 2006).
Ekstrak sambiloto juga dapat merangsang pelepasan insulin dan menghambat absorbsi glukosa melalui penghambatan enzim alfa-glukosidase. Enzim glukosidase (maltase, isomerase, glukomerase dan sukrase) berfungsi untuk menghidrolisis oligosakarida pada dinding usus halus sehingga inhibisi pada enzim ini dapat mengurangi pencernaan karbohidrat kompleks dan absorpsinya (Subramanian etal., 2008).
Enzim alfa-glukosidase merupakan enzim yang bekerja menghidrolisis ikatan 1,4-glikosik dan melepaskan D-glukosa dari hasil akhir substrat. Disakarida seperti maltosa dengan ikatan ɑ--1,4-glikosida akan dipecah menjadi monosakarida oleh alfa-glukosidase di membran usus kecil, monosakarida seperti glukosa yang telah terbentuk akan diabsorbsi oleh epitelium intestinal dan masuk ke peredaran
21
darah sehingga gula darah akan meningkat di dalam tubuh (Margono dan Sumiati, 2019).
Acarbose sebagai pembanding pada penelitian ini karena acarbose merupakan obat yang paling umum digunakan di Indonesia. Mekanisme penghambatan oleh acarbose yang menghambat secara kompetitif enzim alfa-glukosidase di dalam lumen usus halus. Penghambatan secara kompetitif terjadi karena inhibitor mampu berikatan dengan pusat aktif enzim kemudian berkompetisi dengan substrat sehingga tidak terbentuk produk (Margono dan Sumiati, 2019). Belum diketahui apakah ekstrak air daun sambiloto merupakan inhibitor kompetitif, pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Pekthong etal., 2008, menunjukan bahwa herba sambiloto merupakan inhibitor kompetitif enzim CYP3A4 pada manusia, dimana glibenklamid dimetabolisme oleh enzim tersebut, dari pernyataan diatas kemungkinan bahwa andrografolid yang merupakan kandungan utama dari sambiloto adalah inhibitor kompetitif.
Gambar 6. Perbandingan % Inhibisi Ekstrak Air Daun Sambiloto dan Acarbose. Berdasarkan gambar diatas, rerata aktivitas penghambatan enzim alfa-glukosidase dari acarbose menggambarkan peningkatan yang sama dengan ekstrak air daun sambiloto tetapi dengan persen penghambatan yang lebih rendah. Kedua uji acarbose dan ekstrak air daun sambiloto menunjukkan aktivitas penghambatan
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0,52 1,04 2,08 3,13 4,16 % P e n g h a m b a ta n Konsentrasi
Rerata % Inhibisi Ekstrak Air Daun Sambiloto dan Acarbose
22
yang meningkat seiring kenaikan konsentrasi. Konsentrasi paling rendah, rerata daya hambat acarbose terhadap enzim alfa-glukosidase menunjukkan aktivitas 16,45% dan rerata daya hambat ekstrak air daun sambiloto terhadap enzim alfa- glukosidase 26,95%; sedangkan aktivitas tertinggi rerata daya hambat acarbose terhadap enzim alfa-glukosidase ditunjukkan pada konsentrasi 4,16 mg/ml dengan 82,99% dan rerata daya hambat ekstrak air daun sambiloto terhadap enzim alfa- glukosidase pada konsentrasi 4,16 mg/ml adalah 69,23%.
Pengujian statistik dari IC50 pembanding acarbose dan ekstrak air daun
sambiloto diawali dengan uji Shapiro-Wilk untuk melihat Normalitas dari data yang didapatkan. Hasil yang diperoleh dari pengujian tersebut ialah data terdistribusi normal (P>0,05), sehingga bisa dilanjutkan dengan uji t tidak perpasangan (independent-sampel t test). Dari hasil yang diperoleh diketahui bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara acarbose dengan ekstrak air daun sambiloto, nilai 0,727 (P> 0,05). Dari hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa tidak ada perbedaan penghambatan aktivitas enzim alfa-glukosidase antara acarbose dengan ekstrak air daun sambiloto. Hasil statistika ini mengindikasikan bahwa kenaikan kadar ekstrak air daun sambiloto yang diberikan berpengaruh terhadap daya penghambatan enzim alfa-glukosidase, namun pengaruh penghambatan aktivitas enzim alfa-glukosidase ekstrak air daun sambiloto tidak sebanding dengan acarbose.
Kesimpulan
Kesimpulan dari hasil penelitian, ekstrak air daun sambiloto memiliki aktivitas penghambatan pada enzim alfa-glukosidase dengan nilai IC50 2,29±0,513 mg/ml.
Hasil yang diperoleh ialah tidak ada perbedaan yang signifikan antara acarbose sebagai pembanding dan ekstrak air daun sambiloto (p > 0,05).
Saran
Penulis menyarankan untuk melakukan pengujian untuk mengetahui lebih jelas kandungan andrografolid yang terdapat dalam ekstrak air daun sambiloto serta melanjutkan pengujian aktifitas penghambatan enzim alfa-glukosidase dengan ekstrak air daun sambiloto.
23
DAFTAR PUSTAKA
Aba, P.E. and Asuzu, I.U., 2018. Mechanisms of actions of some bioactive anti-diabetic principles from phytochemicals of medicinal plants: A review. Indian Journal of Natural Products and Resources, 9 (2), 85–96.
BPOM RI, 2012., Acuan Sediaan Herbal, Edisi 1, Direktorat Obat Asli Indonesia. Chang, M.J.V, 2020., Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa Amilase oleh
Ekstrak Air Daun Sambiloto (Andrographis paniculata Nees.) secara In Vitro, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Chao, W.W. and Lin, B.F., 2010. Isolation and identification of bioactive compounds in Andrographis paniculata (Chuanxinlian). Chinese Medicine, 5, 1–15.
Dandu, A.M. and Inamdar, N.M., 2009. Evaluation of beneficial effects of antioxidant properties of aqueous leaf extract of Andrographis paniculata in STZ-induced diabetes. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 22 (1), 49–52.
Decroli E, 2019., Diabetes Melitus Tipe 2, Edisi pertama, Bagian Ilmu Penyakit Dalam, Universitas Andalas, Padang.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2008., Pedoman Pengendalian Diabetes Mellitus dan penyakit Metabolik. Jakarta: Departemen Kesehatan Indonesia.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2017., Farmakope Herbal Indonesia Edisi II. Departemen Kesehatan RI
IIDF, 2019. IDF Diabetes Atlas 2019. International Diabetes Federation.
Kumoro, A.C., Hasan, M., and Singh, H., 2009. Effects of solvent properties on the Soxhlet extraction of diterpenoid lactones from Andrographis paniculata leaves. ScienceAsia, 35 (3), 306–309.
Manikandan, R., Anand, A.V., Kumar, S., and Pushpa, 2013. Phytochemical and In Vitro Antidiabetic Activity of Psidium guajava leaves. Pharmacognosy Journal, 8 (4), 392–394.
Margono, R.S. and Sumiati, T., 2019. Potensi Tanaman Indonesia sebagai Antidiabetes melalui Mekanisme Penghambatan Enzim α-glukosidase. Jurnal
24
Farmamedika (Pharmamedica Journal), 4 (2), 86–92.
Matsumoto, M., Matsukawa, N., Mineo, H., Chiji, H., and Hara, H., 2004. A soluble flavonoid-glycoside, αG-rutin, is absorbed as glycosides in the isolated gastric and intestinal mucosa. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 68 (9), 1929–1934.
Pandey MK, Singh GN, Sharma RK & Lata S. 2011. Physicochemical standardization of Andrographis paniculata (Nees): an Ayuverdic drug.
International Journal of Pharmaceutical Research and development 3(6): 81-89
Paramitha, M.D. and Rahamanisa, S., 2016. Ekstrak etanol herba sambiloto (Andrographis paniculata) sebagai antidiabetik terhadap mencit wistar terinduksi aloksan. Majority, 5 (5), 75–79.
Pekthong, D., Martin, H., Abadie, C., Bonet, A., Heyd, B., Mantion, G., and Richert, L., 2007. Differential inhibition of rat and human hepatic cytochrome P450 by Andrographis paniculata extract and andrographolide. Journal of Ethnopharmacology, 115 (3), 432–440.
Permata Yuda, I., Aryenti, A., and Juniarti, J., 2019. Aktivitas Inhibitor α-Glukosidase Ekstrak Daun Toona sureni (Bl. ) Merr. sebagai Antihiperglikemik. Majalah Kesehatan Pharmamedika, 10 (2), 063.
Polash, S.A., Saha, T., Hossain, M.S., and Sarker, S.R., 2017. Investigation of the Phytochemicals, Antioxidant, and Antimicrobial Activity of the Andrographis paniculata Leaf and Stem Extracts. Advances in Bioscience and Biotechnology, 08 (05), 149–162.
Rachmani E. P. Nur dan Tuti Sri Suhesti, 2016., Aktivitas Antioksidan Ekstrak dan Fraksi Herba Sambiloto (Andrographis paniculata), Media Pharmaceutica Indonesiana.Vol. 1 No. 2
Rais I. Ridwan, Agung Giri Samudra, Sitarina Widyarini, dan Agung Endro Nugroho, 2013., Determination of Andrographolide Isolate Activity to Α-Amylase and Α-Glucosidase Using Apostolidis and Mayur Method, Traditional Medicine Journal, 18(3)
25
Andrographolide dari Sambiloto (Andrographis paniculata Nees) melalui proses ekstraksi hidrotropi.Momentum, 8 (1), 6–10.
Reyes, B.A.S., Bautista, N.D., Tanquilut, N.C., Anunciado, R. V., Leung, A.B., Sanchez, G.C., Magtoto, R.L., Castronuevo, P., Tsukamura, H., and Maeda, K.I., 2006. Anti-diabetic potentials of Momordica charantia and Andrographis paniculata and their effects on estrous cyclicity of alloxan-induced diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology, 105 (1–2), 196–200. Riyanti, S., Ratnawati, J., and Aprilianti, S., 2019. Potensi buah okra (Abelmoschus
esculentus (L.) Moench) sebagai inhibitor alfa-glukosidase. Kartika : Jurnal Ilmiah Farmasi, 6 (1), 6.
Rivas, F., Parra, A., Martinez, A., and Garcia-Granados, A., 2013. Enzymatic glycosylation of terpenoids. Phytochemistry Reviews, 12 (2), 327–339. Royani, J.I., Hardianto, D., and Wahyuni, S., 2014. Analisa Kandungan
Andrographolide Pada Tanaman Sambiloto (Andrographis Paniculata) Dari 12 Lokasi Di Pulau Jawa. Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia (JBBI), 1 (1), 15.
Saqib, A.A.N. and Whitney, P.J., 2011. Differential behaviour of the dinitrosalicylic acid (DNS) reagent towards mono- and di-saccharide sugars.
Biomass and Bioenergy, 35 (11), 4748–4750.
Sasmito, E., 2017., Imunomodulator Bahan Alami, Ed.1, Rapha Publishing, penerbit ANDI, Yogyakarta, Hal. 67-69.
Sheel Dr. Rimjhim and Kumari Nisha, 2014, Qualitative phytochemical analysis for isolation of terpens from Clerodendron infortunatum leaves, Journal of Applied Chemistry, Vol. 7, (7)
Siadi K, 2012, Ekstrak Bungkil Biji Jarak Pagar (Jatropha Curcas) Sebagai
Biopestisida Yang Efektif Dengan Penambahan Larutan Nacl,Jurnal MIPA
Universitas Negeri Semarang
Subramanian, R., Asmawi, M.Z., and Sadikun, A., 2008. In vitro α-glucosidase and α-amylase enzyme inhibitory effects of Andrographis paniculata extract and
26
Sukmawati, Muhammad Akbar Harsita dan Rachmat Kosman, 2016., Uji Efek Hipoglikemik Kombinasi Ekstrak Etanol Daun Sambiloto (Andrographis Paniculata Nees) Dengan Acarbose Pada Tikus Putih (Rattus Norvegicus) Terinduksi Aloksan. As-Syifaa. 8
Yuniarto, A. and Selifiana, N., 2018. Aktivitas Inhibisi Enzim Alfa-glukosidase dari Ekstrak Rimpang Bangle (Zingiber cassumunar Roxb.) secara In vitro.
36
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi berjudul “Uji Aktivitas Penghambatan Enzim Alfa-glukosidase Dengan Ekstrak Air Daun Sambiloto
Andrographis Paniculata (Burm.F.) Nees Secara In Vitro”
bernama lengkap Agatha Febriana Ati Maia, lahir di Dili, Timor Leste, pada tanggal 27 Februari 1997. Merupakan anak pertama dari empat bersaudara dari pasangan Miguel Ati Bau dan Sulis Karnanik. Penulis menempuh pendidikan TK Kemala Bhayangkari Kefamenanu (2000-2002), SD Katholik Santo Agustinus Leob Kefamenanu (2003-2009), SMP Negeri 1 Kefamenanu (2009-2012), SMA Negeri 1 Kefamenanu (2012-2015) dan pada tahun 2016 penulis mengenyam Pendidikan di Program Study Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama berkuliah penulis aktif dalam beberapa kegiatan kepanitiaan dan organisasi, penulis berpartisipasi dalam kepanitiaan Seminar Nasional Interperssional Health Care (2016), Latihan Kepemimpinan 1 Pribadi Proaktif Proyeksi Masa Depan (2016), Volunteer Future Pharmacist in Action (2016), Week-End-Moral (2017), Volunteer Mental Health Issues Campaign (2018), kepanitiaan TITRASI Urunan Sewu Dadi (2018). Penulis pernah mengikuti lomba Kreativitas Mahasiswa Didanai (2017).
