SECARA IN VITRO DAN IN VIVO
ASEP WAHYUDIN
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Gelugur sebagai Pelangsing secara In Vitro dan In Vivo. Dibimbing oleh DYAH
ISWANTINI PRADONO dan MIN RAHMINIWATI.
Asam gelugur (Kaempferia angustifolia) dan kunci pepet (Garcinia atroviridis)
merupakan contoh tanaman obat yang secara tradisional dan teruji secara in vitro sebagai
penurun bobot badan atau antiobesitas. Penelitian ini bertujuan mengetahui potensi
kombinasi kedua ekstrak dalam menghambat aktivitas lipase pankreas secara in vitro
pada pH 8.0, waktu inkubasi 45 menit, dan suhu 40 °C. Lipase pankreas yang digunakan
pada penelitian ini adalah lipase pankreas manusia dengan konsentrasi 1.4 х 10
-6µg/µL
dan substrat berupa minyak wijen dengan konsentrasi 0.243 µg/µL. Pengujian khasiat
ekstrak dilanjutkan secara in vivo terhadap tikus betina dengan mengamati bobot badan
dan konsumsi pakan. Hasil pengujian secara in vitro menunjukkan bahwa kombinasi 1:1
ekstrak etanol asam gelugur–kunci pepet memiliki aktivitas penghambatan tertinggi
(75.69%) terhadap lipase pankreas manusia pada konsentrasi 20 ppm. Uji in vivo
menunjukkan bahwa kelompok tikus yang telah diberi 564 mg kombinasi ekstrak etanol
asam gelugur–kunci pepet per 200 g bobot badan memiliki rerata bobot badan terendah
(171.38 g). Konsumsi pakan kelompok tersebut turun dari 30.13 g menjadi 19.87 g/hari.
Hasil-hasil tersebut memberikan kesimpulan bahwa kombinasi ekstrak etanol asam
gelugur dan kunci pepet berpotensi menurunkan berat badan dengan mekanisme kerja
menghambat aktivitas lipase pankreas dan menekan nafsu makan.
ABSTRACT
ASEP WAHYUDIN. In Vitro and In Vivo Analysis of Kaempferia angustifolia
Rhizomes and Garcinia atroviridis Fruit Extracts‟ Antiobesity Activity. Supervised by
DYAH ISWANTINI PRADONO and MIN RAHMINIWATI.
Garcinia atroviridis (gelugor) fruits and Kaempferia angustifolia (kunci pepet)
rhizomes have been traditionally used as herbal medicine to reduce body weight. The
extract of these plants has been shown (in vitro) to have antiobesity activity. The
objectives of this research is to evaluate the activity of the combination of these herbs‟
ethanol extracts towards human pancreatic lipase activity by in vitro analysis (pH = 8.0,
incubation time = 45 minutes, and temperature = 40 °C) and mouse pancreatic lipase by
in vivo analysis. The combined extracts activity towards human pancreatic lipase was
analyzed using lipase concentration of 1.4 х 10
-6µg/µL with sesame oil (0.243 µg/µL) as
the substrate. The in vivo test were conducted to female mice by investigating their body
weight and feed consumption changes before and after the combined extract
administration. The in vitro test results showed that the 1:1 gelugor–kunci pepet ethanol
extract combination had the highest inhibition activity towards human pancreatic lipase
(75.69%) at 20 ppm concentration. The lowest body weight average of (171.38 g) was
observed in the mice group that had been admistered with 564 mg combined extract per
200 g body weight. Their average feed consumption decreased from 30.13 g to 19.87 g
per day. These results gave conclusion that the combined gelugor–kunci pepet ethanol
extract is able to inhibit human pancreatic lipase activity, decrease mouse body weigth
and appetite.
SECARA IN VITRO DAN IN VIVO
ASEP WAHYUDIN
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
NIM
: G44053008
Menyetujui
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Dyah Iswantini Pradono, M.Agr
Dr. Min Rahminiwati
NIP 19670730 199103 2 001
NIP 19610528 198503 2 004
Mengetahui
Ketua Departemen,
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, M.S
NIP 19501227 197603 2 002
memberikan rahmat dan hidayah-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.
Shalawat dan salam disampaikan kepada Nabi Muhammad SAW beserta keluarga,
sahabat, dan pengikutnya yang tetap berada di jalan-Nya hingga akhir jaman. Karya
ilmiah yang berjudul Khasiat Ekstrak Rimpang Kunci Pepet dan Buah Asam Gelugur
sebagai Pelangsing secara In Vitro dan In Vivo ini merupakan salah satu syarat untuk
memperoleh gelar sarjana sains pada Departemen kimia FMIPA IPB.
Terima kasih penulis sampaikan terutama kepada Dr. Dyah Iswantini Pradono,
M.Agr dan Dr. Min Rahminiwati sebagai pembimbing yang telah memberikan
bimbingan, arahan, dan dorongan selama pelaksanaan penelitian dan penulisan karya
ilmiah ini. Penghargaan penulis sampaikan kepada DP
2M Dikti yang telah membiayai
penelitian melalui pendanaan hibah kompetensi atas nama Dr. Dyah Iswantini Pradono,
M.Agr serta Pusat Studi Biofarmaka atas bantuan dalam hal tempat penelitian dan
peralatan laboratorium yang digunakan selama penelitian.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada staf Laboratotium Kimia Fisik
dan Lingkungan, Pak Mail, Bu Ai, Pak Nano, Pak Eman dari Laboratorium Kimia
Analitik, Bu Nunuk, Bu Salina, Pak drh. Aulia, Pak Mul, serta seluruh staf dan pegawai
di Pusat Studi Biofarmaka, rekan-rekan kimia angkatan 42 terutama Luthfan Irfana,
Dhian Eka W, Dian Ifkarul I, Tris Leni, dan Andayani N, rekan-rekan Pondok Bujang
(Asep Mulyadiana, Fauzan Amin, Ka Hadi), atas bantuan yang diberikan selama
penelitian. Ucapan terima kasih yang tidak terhingga kepada Ayah, Ibu, adik-adikku
tercinta Hendri Irawan dan Annisa Rizca Utami, serta Lena Roslina atas nasihat,
semangat, bantuan materi, dan doa-doanya yang tiada henti.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Desember 2009
Uyo Sopyan dan ibu Euis Susilawati. Penulis merupakan anak pertama dari tiga
bersaudara, kakak dari Hendri Irawan dan Annisa Rizca Utami.
Tahun 2004 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Ciamis dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur undangan seleksi masuk
IPB (USMI). Penulis memilih mayor Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum Kimia
Lingkungan (2007/2008), dan asisten Sosiologi Umum (2007/2008 dan 2008/2009) di
Departemen Komunikasi dan Pengembangan Masyarakat, Fakultas Ekologi Manusia.
Penulis melakukan Praktik Lapangan di Laboratorium Teknologi Pakan, Balai Penelitian
Peternakan Ciawi, Bogor. Selain Itu penulis aktif di kegiatan kemahasiswaan dan menjadi
staf khusus Departemen Kajian Strategi dan Advokasi Badan Eksekutif Mahasiswa IPB
(2006/2007), koordinator PMGC (Paguyuban Mahasiswa Galuh Ciamis) IPB
(2007/2008), dan sebagai ketua angkatan mahasiswa kimia angkatan 2005 (2008/2009).
Halaman
DAFTAR GAMBAR ...
vii
DAFTAR TABEL ...
vii
DAFTAR LAMPIRAN ...
viii
PENDAHULUAN ...
1
TINJAUAN PUSTAKA
Kegemukan ...
2
Lemak ...
2
Enzim Lipase Pankreas ...
2
Kunci Pepet ...
3
Asam Gelugur ...
4
Pengujian In Vitro dan In Vivo ...
4
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ...
5
Metode Penelitian ...
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air ...
6
Ekstraksi ...
6
Uji In Vitro Berdasarkan Aktivitas Lipase
Pankreas ...
7
Uji In Vivo Berdasarkan Bobot Badan dan
Konsumsi Pakan ...
9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ...
14
Saran ...
14
DAFTAR PUSTAKA ...
14
Halaman
1
Reaksi hidrolisis lemak ...
2
2
Interaksi inhibitor kompetitif ...
3
3
Interaksi inhibitor unkompetitif ...
3
4
Interaksi inhibitor nonkompetitif ...
3
5
Kunci pepet ...
4
6
Asam gelugur ...
4
7
Daya inhibisi kombinasi ekstrak terhadap aktivitas
Lipase pankreas ...
8
8
Struktur orlistat ...
9
9
Bobot badan tikus sebelum dan selama perlakuan ...
10
10 Rerata bobot badan berbagai kelompok perlakuan ...
11
11 Rerata bobot badan pada berbagai waktu ...
12
12 Jumlah konsumsi pakan KN, KP, P1, P2, dan P3 ...
12
13 Rerata konsumsi pakan pada berbagai kelompok perlakuan ...
13
14 Rerata jumlah pakan yang dikonsumsi selama perlakuan ...
13
DAFTAR TABEL
Halaman
1
Dosis perlakuan ekstrak ...
6
Halaman
1
Bagan alir rancangan penelitian ...
18
2
Bagan alir ekstraksi menggunakan pelarut etanol ...
19
3
Bagan alir ekstraksi menggunakan pelarut air ...
19
4
Bagan alir uji in vitro ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas ...
20
5
Perhitungan aktivitas enzim lipase pankreas dan daya inhibisi...
21
6
Bagan alir uji in vivo ...
22
7
Pembuatan bahan-bahan uji aktivitas enzim lipase pankreas ...
22
8
Penentuan kadar air ...
23
9
Penentuan rendemen ekstrak ...
23
10 Daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas
secara in vitro ...
24
11 Data bobot badan ...
27
12 Perhitungan statistik terhadap respon bobot badan selama
perlakuan ...
30
13 Data jumlah konsumsi pakan ...
33
14 Perhitungan statistik terhadap respon konsumsi pakan selama
perlakuan ...
37
PENDAHULUAN
Kegemukan atau yang lebih dikenal dengan istilah obesitas terjadi karena ketidakseimbangan jumlah makanan yang masuk dibandingkan dengan pengeluaran energi oleh tubuh. Obesitas dapat menjadi masalah penyakit seperti diabetes, jantung koroner, tekanan darah tinggi, dan penyempitan pembuluh darah. Penyakit yang ditimbulkan mengharuskan adanya pola-pola penanganan dan pencegahan. Terdapat dua cara yang dapat dilakukan untuk mengurangi bobot badan dan menjadikannya ideal kembali, yaitu secara alami dan menggunakan bantuan. Penanganan secara alami dapat dilakukan dengan mengatur kembali pola makan dan berolah raga. Mengingat penanganan ini membutuhkan waktu yang cukup lama, maka hanya sebagian kecil penderita obesitas yang melakukan metode ini. Adapun cara yang kedua di antaranya dengan menggunakan obat pelangsing.
Mekanisme obat pelangsing salah satunya adalah menghambat penyerapan asam lemak melalui penghambatan aktivitas enzim lipase pankreas. Enzim lipase pankreas adalah enzim yang berfungsi menghidrolisis lemak dari makanan dalam usus menjadi gliserol dan asam lemak (Lehninger 1982). Meningkatnya aktivitas enzim lipase pankreas akan meningkatkan penyerapan asam lemak yang dapat memicu obesitas. Terdapat dua kriteria obat pelangsing yang beredar di pasaran, yaitu yang dibuat secara sintetik (modern) dan tradisional. Obat pelangsing sintetik mempunyai efek yang kurang baik terhadap kesehatan, diantaranya gangguan emosi, sulit tidur, perut kembung atau perih, keletihan terus-menerus, dan depresi (Mursito 2007). Tetrahidrolipstatin (orlistat) merupakan salah satu obat pelangsing sintetik dengan mekanisme menghambat aktivitas enzim lipase pakreas (Tiss et al. 2009).
Penggunaan obat pelangsing yang dibuat secara tradisional dari tanaman herbal lebih banyak dipilih penderita obesitas karena lebih aman terhadap kesehatan. Berdasarkan hasil penelitian terhadap senyawa aktif saponin dari tanaman Kochia scoparia (Han et al. 2006), ekstrak herbal polifenol buah jenis berry yang mengandung banyak tanin (Gordon et al. 2009) secara in vitro mampu menghambat aktivitas enzim lipase pankreas. Hasil penelitian secara in vivo menyatakan kombinasi ekstrak OB-200G dari buah Garcinia cambogia, gum resin Commiphora mukul, rimpang Zingiber officinale, buah
Piper longum, daun Gymnema sylvestre (Kaur dan Kulkarni 2000), dan ekstrak kulit jeruk, teh hitam, kafein (Huang et al. 2009) dapat menurunkan bobot badan tikus secara signifikan dibandingkan kontrol negatif dengan menghambat aktivitas lipase pankreas.
Tanaman herbal yang pada saat ini diteliti potensinya sebagai obat pelangsing adalah kunci pepet dan asam gelugur. Hasil uji fitokimia terhadap rimpang kunci pepet menunjukkan bahwa ekstrak air dan etanolnya mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, dan saponin. Selain senyawa-senyawa tersebut, ekstrak air kunci pepet juga mengandung tanin dan pada ekstrak etanolnya terkandung triterpenoid (Susanti 2009). Adapun buah asam gelugur berdasarkan hasil uji fitokimia (Fitriani 2009) mengandung alkaloid pada ekstrak etanol dan saponin pada ekstrak air. Buah gelugur mempunyai kandungan asam seperti asam sitrat, asam askorbat, dan asam hidroksisitrat. Fungsi asam hidroksisitrat secara hayati adalah sebagai senyawa antiobesitas dengan cara mengurangi konversi karbohidrat menjadi lemak dengan menghambat beberapa proses enzim (Lowenstein 1971). Daging buah asam gelugur (Garcinia atroviridis) diketahui mengandung asam hidroksisitrat (Achmadi 2001). Berdasarkan hasil penelitian Susanti dan Fitriani (2009) secara in vitro menyatakan bahwa rimpang kunci pepet dapat menghambat aktivitas enzim lipase pankreas sebesar 65.25% (200 ppm) dan buah asam gelugur 86.30% (150 ppm).
Penelusuran melalui situs paten Amerika (www.uspto.gov) menunjukkan beberapa hasil penelitian mengenai penanganan obesitas yang telah dipatenkan antara lain ekstrak Gingko biloba (Stankov 2002; US Patent No. 6447818), Garcinia cambogia dan bioflavonoid lemon (Alviar et al. 2002; US Patent No. 6413545). Berdasarkan penelusuran situs paten tersebut tidak ditemukan informasi paten mengenai kombinasi ekstrak kunci pepet dan buah asam gelugur dalam potensinya sebagai anti-obesitas sehingga penelitian ini perlu dilakukan dan berpotensi menghasilkan formula yang dapat dipatenkan.
Pada penelitian ini dilakukan pengujian kombinasi ekstrak buah asam gelugur dan rimpang kunci pepet dalam menghambat aktivitas lipase pankreas secara in vitro. Khasiat kombinasi ekstrak rimpang kunci pepet dan buah asam gelugur sebagai pelangsing dilakukan pengujian lanjutan secara in vivo terhadap tikus yang salah
satunya diamati dari perubahan bobot badan dan jumlah konsumsi pakan.
TINJAUAN PUSTAKA
Kegemukan
Istilah kelebihan bobot badan identik dengan kata overweight dan obesitas. Kelebihan bobot badan tipe overweight berasal dari otot, tulang, dan organ-organ vital. Contoh kasusnya adalah para binaragawan. Adapun obesitas diartikan sebagai kelebihan lemak dalam tubuh (Lebenthal dan Damayanti 2007). Tingkat kegemukan dapat diketahui dengan menghitung indeks massa tubuh (IMT).
IMT =
Menurut WHO (1998), tingkat kegemukan diklasifikasikan ke dalam enam kategori, yaitu bobot badan kurang (IMT < 18,5), bobot badan normal (IMT 18,5-24,5), bobot badan lebih (IMT 25-29,9), obesitas I (IMT 30-34,9), obesitas II (IMT 35-39,9), dan sangat obesitas (IMT >39,9). Kegemukan tidak hanya diakibatkan dari konsumsi makanan tinggi lemak, tetapi konsumsi karbohidrat yang berlebih dapat dikonversi menjadi lemak melewati gugus asetil ko-A (Lehninger 1982).
Lemak
Lemak merupakan salah satu golongan dari lipid selain minyak dan steroid. Suatu lipid didefinisikan sebagai senyawa organik yang terdapat dalam alam serta tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organik nonpolar seperti suatu hidrokarbon atau dietil eter (Lehninger 1982). Lemak adalah sumber tenaga kalori yang padat. Lemak mempunyai struktur molekul yang kaya akan rantai karbon, sehingga lemak mempunyai sifat hidrofob yang berarti sulit untuk larut di dalam air. Secara umum fungsi adanya lemak dalam tubuh adalah sebagai penyimpan energi, transportasi metabolik sumber energi, sumber zat untuk sintesis hormon, dan struktur dasar atau komponen utama dari membran semua jenis sel.
Kegemukan merupakan salah satu akibat dari tingginya penyerapan asam lemak oleh tubuh. Asam lemak adalah asam organik berantai panjang yang mempunyai atom karbon 2 sampai 24. Asam lemak tidak terdapat secara bebas atau berbentuk tunggal
di dalam sel atau jaringan tetapi terdapat dalam bentuk terikat secara kovalen pada berbagai kelas lipida yang berbeda. Asam lemak mengandung energi tinggi (menghasilkan banyak ATP).
Enzim Lipase Pankreas
Enzim adalah protein yang mengkatalisis reaksi kimiawi spesifik. Enzim memiliki tenaga katalitik yang luar biasa dan jauh lebih besar dari katalisator sintetik. Enzim mengikat molekul substrat membentuk kompleks enzim-substrat yang bersifat sementara, kemudian terurai membentuk enzim bebas dan produknya. Substrat merupakan zat yang bereaksi dengan enzim dan diubah menjadi produk. Penelitian terhadap spesifisitas enzim menunjukkan bahwa molekul substrat harus memiliki dua ciri struktural, yaitu ikatan kimiawi spesifik yang dapat diserang oleh enzim dan biasanya beberapa gugus fungsional, yaitu gugus pengikat yang berikatan dengan enzim. Aktivitas katalitik enzim bergantung pada integritas strukturnya sebagai protein. Faktor-faktor yang memengaruhi aktivitas enzim di antaranya adalah konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu, dan inhibitor. Enzim yang banyak berperan dalam hidrolisis lemak adalah enzim lipase pankreas.
Lipase pankreas adalah enzim yang diproduksi sel acinar dan disekresi sebagai fungsi eksokrin pankreas. Lipase dapat terkandung secara alami pada lemak dan minyak, tetapi dapat juga dihasilkan oleh mikroorganisme yang terdapat pada makanan berlemak. Enzim lipase pankreas berfungsi menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan asam lemak. Reaksi hidrolisis lemak diperlihatkan pada Gambar 1.
Gambar 1 Reaksi hidrolisis lemak. Aktivitas enzim dapat dikurangi bahkan dicegah dengan bantuan inhibitor (zat penghambat). Inhibitor enzim adalah zat atau
senyawa yang dapat menghambat kerja enzim (E) berikatan dengan substrat (S) untuk menghasilkan produk (P). Inhibitor enzim terbagi atas inhibitor kompetitif, unkompetitif, dan nonkompetitif (Lehninger 1982).
Inhibitor kompetitif
Penghambatan disebabkan oleh senyawa tertentu yang mempunyai struktur menyerupai substrat saat reaksi enzimatik akan terjadi. Suatu penghambat kompetitif berlomba dengan substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim. Ciri penghambat kompetitif adalah penghambatan ini dapat diatasi hanya dengan penambahan substrat. Daya penghambatan oleh inhibitor kompetitif dipengaruhi oleh kadar penghambat, kadar substrat, dan aktivitas relatif antara penghambat dan substrat. Inhibitor akan bereaksi dengan enzim dan membentuk kompleks enzim-inhibitor. Mekanisme kerja inhibitor kompetitif diperlihatkan pada Gambar 2.
Gambar 2 Interaksi inhibitor kompetitif.
Inhibitor unkompetitif
Inhibitor tipe unkompetitif tidak bekerja pada saat awal enzim bereaksi dengan substrat, tetapi bereaksi pada perantara kompleks enzim substrat. Daya penghambatan oleh inhibitor unkompetitif dipengaruhi oleh kadar penghambat, dan kadar substrat. Mekanisme penghambatan diperlihatkan pada Gambar 3.
.
Gambar 3 Interaksi inhibitor unkompetitif.
Inhibitor nonkompetitif
Inhibitor nonkompetitif berikatan pada sisi enzim selain sisi tempat substrat berikatan, mengubah konformasi molekul enzim sehingga mengakibatkan inaktifasi dapat balik sisi katalitik. Hal ini berarti bahwa inhibitor dan substrat dapat berikatan secara bersamaan terhadap molekul enzim untuk membentuk kompleks enzim-substrat, enzim-inhibitor, dan enzim-substrat-inhibitor. Tipe penghambatan ini tidak dapat dikurangi dengan penambahan jumlah substrat. Inhibitor nonkompetitif dipengaruhi oleh kadar penghambat dan afinitas penghambat terhadap enzim. Mekanisme penghambatan diperlihatkan pada Gambar 4.
Gambar 4 Interaksi inhibitor nonkompetitif. Tanaman obat yang berpotensi sebagai obat penurun bobot badan (pelangsing) di antaranya adalah bangle, jahe, jati belanda, teh, temu kunci, kemuning, kunci pepet, dan asam gelugur. Obat pelangsing dapat bekerja dengan beberapa cara, diantaranya menekan nafsu makan, mempercepat rasa kenyang, dan mencegah penyerapan lemak (inhibitor).
Kunci Pepet
Kunci pepet memiliki nama ilmiah Kaempferia angustifolia dengan sinonim Kaempferia undulata. Kunci pepet termasuk pada divisi Spermatophyta, sub divisi Angiospermae, kelas Monocotyledonae, bangsa Zingiberales, suku Zingiberaceae, marga Kaempferia, dan jenis Kaempferia angustifolia. Nama daerah kunci pepet yang terdapat di Indonesia adalah kunci pepet (Jawa Tengah), kunci kunit (Sunda), dan kunci pet (Madura). Kunci pepet mempunyai ciri-ciri daunnya bercorak indah dan tumbuhnya tidak tinggi. Bagian dari kunci pepet yang digunakan pemanfaatannya adalah rimpang (Hariana 2008). Tanaman kunci pepet diperlihatkan pada Gambar 5.
Gambar 5 Kunci pepet.
Bahan kimia yang terkandung dalam kunci pepet di antaranya adalah alkaloid, saponin, flavonoid, polifenol, dan minyak atsiri (Sugati dan Hutapea 1991). Hal tersebut dibuktikan juga berdasarkan penelitian Susanti (2009) dari hasil uji fitokimia yang menyatakan bahwa ekstrak air dan etanol kunci pepet mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, dan saponin. Selain senyawa-senyawa tersebut, ekstrak air kunci pepet juga mengandung tanin dan pada ekstrak etanolnya terkandung triterpenoid.
Asam Gelugur
Asam gelugur (Garcinia atroviridis) termasuk ke dalam bangsa Guttiferales dan suku Guttiferae (Jansen 1992). Asam gelugur atau asam gelugor adalah tumbuhan berkeping dua (dikotil) dengan ketinggian pohon mencapai 20 meter, kulit kayunya licin berwarna kelabu pucat, daun hijau tua, dan bunga berwarna merah tua. Buah asam gelugur bentuk buahnya bulat besar menggepeng pada kedua kutubnya, beralur teratur, kulit buah lembut tipis, berwarna kuning jingga, dan biji-bijinya diselaputi lapisan daging buah bening yang agak tipis. Berikut buah asam gelugur diperlihatkan pada Gambar 6.
Gambar 6 Asam Gelugur.
Marga Garcinia tersebar merata di daerah-daerah beriklim tropis di Asia, Afrika, dan polinesia. Tiga puluh dari 180 spesies yang ada dapat ditemukan di India. Tumbuhan Garcinia yang terdapat di Indonesia antara lain mundu (Garcinia dulcis), asam kandis (Garcinia parvifolia), dan asam gelugur (Garcinia atroviridis). Asam gelugur merupakan tumbuhan yang banyak terdapat di India, negara-negara semenanjung Malaya seperti Thailand, Malaysia, dan bagian utara Sumatra. Daging buah asam gelugur dapat dikonsumsi sebagai bumbu masak, minuman segar, dan selai. Rebusan daun dan akar dari asam gelugur digunakan untuk perawatan penyakit telinga (Heyne 1987). Kandungan kimia utama buah asam gelugur adalah asam-asam organik terutama asam-asam hidroksisitrat. Bagian yang digunakan pemanfaatannya adalah buahnya.
Lewis dan Neelakantan (1965) pertama kali mengisolasi asam organik yang dominan terdapat pada kulit buah Garcinia cambogia dan mengidentifikasinya sebagai asam hidroksisitrat berdasarkan kajian kimia dan spektroskopi. Asam hidroksisitrat merupakan salah satu asam hidroksikarboksilat dengan dua gugus hidroksi dan tiga gugus karboksilat. Asam hidroksisitrat (asam 1,2-dihidroksi-propana-1,2,3-trikarboksilat) yang terkandung dalam buah gelugur akan menghambat secara kompetitif kerja enzim ATP-sitrat liase yang berfungsi mengubah asam sitrat menjadi asetil koenzim A. Dalam siklus Krebs, asetil Ko-A akan diubah menjadi malonil Ko-A yang kemudian dikonversi menjadi asam lemak. Penghambatan aktivitas ATP-sitrat liase oleh asam hidroksisitrat (HCA) akan menyebabkan penurunan produksi asam lemak sebagai prekursor pembentukan lemak dalam tubuh. Chung (2006) menyatakan bahwa buah asam gelugur bersifat antioksidan dan mampu menurunkan bobot badan dan kolesterol.
Pengujian In Vitro dan In Vivo
Model pengujian in vitro merupakan pengujian potensi sampel yang dilakukan di luar tubuh mahluk hidup. Perlakuan dapat dilakukan salah satunya dalam tabung uji. Berdasarkan hasil penelitian Iswantini et al. (2003a) yang menyatakan bahwa ekstrak metanol daun jati belanda, bangle (Wirakusumah 2005), secara in vitro mampu menghambat aktivitas enzim lipase pankreas yang diisolasi dari kapang Rhizopus arrhizus.
Pengujian secara in vivo merupakan model pengujian potensi sampel dalam tubuh
makhluk hidup, seperti tikus, mencit, kelinci, dan kera. Pramono et al. (2000) melakukan pengujian secara in vivo terhadap Rattus norvegicus (tikus putih) dan menyatakan bahwa lendir daun jati belanda dapat menghambat aktivitas lipase pankreas. Selain itu Yamamoto et al. (2000) menyatakan bahwa ekstrak herba Nomame dapat menghambat enzim lipase CT II sehingga efektif untuk mengatasi kegemukan pada mencit.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah akuades, etanol 70%, buah asam gelugur dari daerah sekitar Aceh (Sumatra Utara), rimpang kunci pepet dari Pati (Jawa Tengah), albumin 10% b/v, minyak wijen, lipase pankreas murni 1.4 х 10-6 µg/µL, dan tikus putih jenis SD (Sprague-dawley) sebagai hewan coba.
Alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis double beam merk HITACHI model 122-0003.
Metode Penelitian Persiapan Sampel
Rimpang kunci pepet didapatkan dari daerah Pati, Jawa Tengah, sedangkan buah asam gelugur dari daerah Aceh. Sampel yang sudah dibersihkan kemudian dikeringkan dan digiling untuk menghasilkan serbuk simplisia kering.
Penentuan Kadar Air (AOAC 1984)
Perlakuan dimulai dengan mengeringkan cawan porselin di dalam oven bersuhu 105 °C selama 60 menit. Selanjutnya cawan didinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang bobot kosongnya. Sampel sebanyak 3 g dimasukkan ke dalam cawan dan dikeringkan di dalam oven selama 3 jam pada suhu 105 °C. Setelah itu, cawan didinginkan dalam eksikator sekitar 30 menit kemudian ditimbang. Penentuan kadar air dilakukan sebanyak tiga kali ulangan (triplo).
Ekstraksi Menggunakan Pelarut Etanol 70% (BPOM 2004)
Sampel hasil penggilingan ditimbang sebanyak ± 100 g. Sampel diberikan pelarut etanol dengan nisbah 1:10. Selanjutnya sampel diekstraksi secara maserasi selama 24 jam kemudian disaring, dan filtratnya dipekatkan menggunakan penguap putar
sampai diperoleh ekstrak etanol. Ekstrak yang diperoleh ditimbang dan dihitung nilai rendemennya (Lampiran 2).
Ekstraksi Menggunakan Pelarut Air (BPOM 2004)
Sampel hasil penggilingan ditimbang sebanyak ± 100 g. Sampel diberikan pelarut air dengan nisbah 1:10. Selanjutnya sampel diekstraksi secara maserasi selama 24 jam kemudian disaring, dan filtratnya dipekatkan menggunakan penguap putar sampai diperoleh ekstrak air. Ekstrak yang diperoleh ditimbang dan dihitung nilai rendemennya (Lampiran 3).
Pengujian Ekstrak Gabungan sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas secara
In Vitro (Xu et al. 2005)
Metode uji in vitro yang digunakan ini mengacu pada metode yang digunakan oleh Xu et al. (2005) dengan beberapa modifikasi. Ekstrak gabungan yang diuji adalah ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak etanol kunci pepet (1:1), ekstrak air asam gelugur dan ekstrak air kunci pepet (1:1), ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak air kunci pepet (1:1), dan ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak air kunci pepet (2:1). Selain itu diuji ekstrak tunggal kunci pepet. Substrat yang digunakan adalah minyak wijen. Perlakuan dilakukan dengan memasukkan sebanyak 15 μL substrat, kombinasi ekstrak sampel dengan variasi konsentrasi ke dalam tabung reaksi, lalu ditambah dengan 10 μL albumin 10% dan ditambahkan larutan buffer fosfat pH 8 sampai tepat 1 mL. Selanjutnya 100 μL enzim lipase pankreas dimasukkan ke dalam tabung tersebut, dihomogenkan menggunakan vorteks, dan diinkubasi pada suhu 40 °C selama 45 menit. Setelah proses inkubasi selesai, ditambahkan sebanyak 3 mL kloroform, dihomogenkan dan dipusingkan menggunakan sentrifus selama 5 menit.
Lapisan kloroform diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke tabung reaksi lain, kemudian ditambahkan 4 mL kloroform-heptana (1:1), dihomogenkan, ditambahkan 2.5 mL pereaksi tembaga, dihomogenkan selama tiga menit, dan dipusingkan kembali selama 10 menit. Lapisan kloroform diambil sebanyak 3 mL dan dimasukkan ke tabung reaksi lain. Selanjutnya ditambahkan 0.25 mL larutan Na-dietilditiokarbamat sehingga berwarna kuning. Larutan diukur serapannya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 435 nm (Lampiran 4). Nilai absorbans yang diperoleh, kemudian dikonversi dengan perhitungan,
sehingga diperoleh nilai aktivitas enzim dan daya inhibisi enzim terhadap lipase pankreas. Kontrol negatif dilakukan tanpa penambahan ekstrak (balngko), sedangkan untuk kontrol positif dilakukan dengan mengganti ekstrak menggunakan Xenical® (Lampiran 5).
Pengujian Ekstrak Gabungan sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas secara
In Vivo (Kaur dan Kulkarni 2000)
Pengujian dilakukan setelah mengetahui dan membandingkan persentase tertinggi dari uji in vitro setiap kombinasi. Daya inhibisi tertinggi secara in vitro terjadi pada kombinasi ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak etanol kunci pepet (1:1) yang dapat menghambat aktivitas enzim lipase pankreas sebesar 75.69% pada konsentrasi 20 ppm. Pengujian in vivo dilakukan berdasarkan metode Kaur dan Kulkarni (2000) dengan beberapa modifikasi. Ekstrak sampel terpilih diuji pada 60 ekor tikus putih dengan berat badan pada kisaran yang seragam antara 160-220 gram yang dibagi pada lima kelompok perlakuan, yaitu perlakuan 1 (P1, perlakuan 2 (P2), perlakuan 3 (P3), kontrrol positif (KP), dan kontrol negatif (KN).
Tabel 1 Dosis perlakuan ekstrak ∑ Tikus (ekor) P Dosis (mg/200 BB) 12 P1 32 12 P2 128 12 P3 512 12 KP 2.16 12 KN akuades
Masing-masing perlakuan memiliki 6 kandang (ulangan), dan satu kandang terdapat 2 ekor tikus (Lampiran 6). Bahan pakan tikus sama untuk semua kelompok berupa pelet. Pengujian dilakukan selama 30 hari dengan mengamati bobot badan per 6 hari dan jumlah konsumsi pakan setiap harinya. Data hasil penelitian diuji dengan rancangan acak lengkap (RAL) in time.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air
Penentuan kadar air berguna untuk mengetahui cara penanganan terbaik dalam hal penyimpanan sampel. Kadar air serbuk simplisia kering yang didapatkan untuk
rimpang kunci pepet sebesar 4.72% dan buah asam gelugur 6.4057% (Lampiran 8). Nilai yang diperoleh berada di bawah batas ambang 10% yang berarti sampel bisa disimpan dalam jangka waktu lama dan terhindar dari pengaruh aktivitas mikrob. Selain itu, dengan mengetahui kadar air sampel, jumlah awal bahan untuk proses ekstraksi sampel basah dapat diperhitungkan.
Nilai kadar air yang didapatkan dari kedua sampel berbeda dengan yang didapatkan Fitriani dan Susanti (2009), yaitu 5.51% untuk kunci pepet dan 18.72% untuk asam gelugur. Jumlah air yang terkandung dalam sampel tidak selalu sama. Hal ini dikarenakan beberapa faktor, di antaranya kelembapan udara, perlakuan terhadap sampel, waktu pengambilan sampel, dan besarnya penguapan (evaporasi) (Harjadi 1987).
Ekstraksi
Ekstraksi bertujuan mengetahui persentase ekstrak yang terdapat pada sampel (rendemen). Data rendemen ekstrak dapat juga digunakan untuk menghitung banyaknya sampel yang dibutuhkan untuk menghasilkan ekstrak dalam ekstraksi skala besar. Data rendemen kedua sampel ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2 Data rendemen ekstrak sampel Sampel ekstrak Rendemen (%) Asam gelugur etanol 21.30
air 19.23
Kunci pepet etanol 15.75
air 18.13
Proses ekstraksi yang dilakukan menggunakan metode maserasi. Metode ini memiliki kelebihan dan kekurangan dalam pelaksanaannya. Kelebihannya adalah dapat menjaga kandungan senyawa dalam sampel yang tidak tahan panas sehingga tidak rusak, dan sampel yang diekstraksi bisa langsung dalam jumlah yang banyak. Adapun kekurangan metode ini adalah membutuhkan banyak pelarut dan waktu yang lama dalam prosesnya.
Nilai rendemen yang didapatkan erat kaitannya dengan pelarut yang digunakan. Air merupakan pelarut yang bersifat polar sehingga dapat mengekstraksi senyawa-senyawa yang bersifat polar dari sampel. Adapun etanol bersifat polar pada gugus
hidroksil dan nonpolar pada gugus alkil, sehingga mempunyai kemampuan mengekstraksi senyawa-senyawa yang mempunyai perbedaan tingkat kepolaran. Harborne (1987) menyatakan bahwa alkohol merupakan pelarut serba guna yang sangat baik untuk ekstraksi pendahuluan karena dapat mengekstraksi senyawa polar dan nonpolar.
Uji In Vitro Berdasarkan Aktivitas Lipase Pankreas
Pengujian ekstrak sampel secara in vitro menggunakan enzim lipase murni dengan konsentrasi 1.4 х 10-6
μg/μL dan asam oleat sebagai standar. Substrat yang lazim digunakan dalam pengukuran aktivitas lipase pankreas secara in vitro adalah substrat murni seperti triolein dan trilinolein. Menurut Desnuelle dan Savary (1963), pengujian in vitro terbaik terhadap aktivitas lipase pankreas dengan menggunakan substrat trigliserida rantai panjang yang tidak larut dalam air dalam bentuk emulsi. Substrat yang digunakan dalam penelitian ini adalah minyak wijen dengan konsentrasi 0.243 μg/μL. Pemilihan minyak wijen sebagai substrat dikarenakan kaya akan asam lemak tak jenuh khususnya asam oleat dan dan asam linoleat. Pemilihan ini juga diperkuat berdasarkan hasil penelitian Martatilofa (2008) yang menguji aktivitas dua jenis substrat, yaitu minyak merk „X” dan minyak wijen terhadap lipase pankreas. Hasil analisis menunjukkan bahwa aktivitas minyak wijen lebih tinggi sebesar 4105.2728 μmol/L menit dibandingkan dengan minyak “X” sebesar 1031.6836 μmol/L menit. Hal ini mengartikan bahwa enzim lipase pankreas cocok berinteraksi dengan substrat minyak wijen.
Aktivitas enzim salah satunya dipengaruhi suhu dan pH. Pengukuran aktivitas enzim lipase pankreas dilakukan pada saat kondisi optimum, yaitu pada pH 8, waktu inkubasi 45 menit, dan suhu 40 °C. Hal ini berdasarkan hasil optimasi enzim lipase pankreas yang dilakukan oleh Martatilofa dan Silitonga (2008). Pengujian kombinasi ekstrak kunci pepet dan asam gelugur sebagai inhibitor lipase pankreas dilakukan dengan melarutkan ekstrak dalam buffer pH 8. Penggunaan buffer dimaksudkan menjaga kondisi enzim dan substrat sehingga tetap berada pada kondisi optimum.
Enzim lipase bekerja dengan cara mempercepat hidrolisis lemak menjadi asam
lemak dan gliserol. Dalam uji in vitro, reaksi antara enzim lipase terhadap substrat minyak wijen dihentikan dengan penambahan kloroform. Penambahan kloroform-heptana (1:1) bertujuan mengekstraksi asam lemak (asam oleat) yang dihasilkan dari hidrolisis minyak wijen. Asam lemak bebas (asam oleat) hasil hidrolisis diikat dengan menambahkan pereaksi tembaga yang kemudian akan dikompleks dengan penambahan natrium dietilditiokarbamat.
Aktivitas enzim lipase pankreas dihitung dengan pengukuran nilai serapan menggunakan spektrofotometer UV-Vis baik terhadap blangko maupun perlakuan sehingga diperoleh nilai daya inhibisi. Konsentrasi ekstrak yang digunakan dari 10-30 ppm dan berada di bawah batas ambang hasil uji toksisitas terhadap larva udang (LC50)..
Berdasarkan hasil penelitian Fitriani dan Susanti (2009), nilai LC50 ekstrak air asam
gelugur sebesar 117.62 ppm dan ekstrak etanolnya sebesar 103.63 ppm. Adapun ekstrak air kunci pepet sebesar 1140.89 ppm dan ekstrak etanolnya sebesar 504.43 ppm. Uji toksisitas larva udang dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk mengamati potensi bioaktivitas dan toksisitas dari setiap sampel sehingga dapat ditentukan konsentrasi ekstrak yang aman untuk pengujian. Suatu ekstrak sampel akan bersifat bioaktif apabila mempunyai nilai LC50 kurang dari 1000 ppm
(Meyer et al. 1982). Persentase daya inhibisi berbagai kombinasi ekstrak diperlihatkan pada Gambar 7 (Lampiran 10).
Gambar 7 memperlihatkan pada umumnya aktivitas lipase pankreas dapat dihambat dengan penambahan berbagai variasi kombinasi ekstrak. Kontrol positif yang digunakan adalah Xenical®. Daya inhibisi tertinggi pada kontrol positif terjadi pada konsentrasi 30 ppm sebesar 41.81%. Kandungan utama kontrol positif adalah adanya orlistat (tetrahidrolipstatin) yang merupakan antiobesitas pertama yang tidak bekerja sebagai penekan nafsu makan, tetapi bekerja dengan cara menghambat aktivitas enzim lipase pankreas. Orlistat bekerja pada lumen lambung dan usus halus yang berikatan secara kovalen pada sisi aktif enzim dan membentuk kompleks yang stabil (Al- Suwailem et al. 2006).
Kombinasi pertama yang diuji adalah gabungan ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak etanol kunci pepet (1:1). Pada konsentrasi 10-20 ppm memperlihatkan terjadinya peningkatan daya inhibisi sejalan dengan ditingkatkannya konsentrasi
Gambar 7 Daya inhibisi kombinasi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas.
KP: kontrol positif Xenical®; K1: kombinasi ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak etanol kunci pepet (1:1); K2: kombinasi ekstrak air asam gelugur dan ekstrak air kunci pepet (1:1); K3: kombinasi ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak air kunci pepet (1:1); K4: kombinasi ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak air kunci pepet (2:1); S1: ekstrak
air kunci pepet. ekstrak, kemudian hampir konstan pada konsentrasi selanjutnya. Daya inhibisi tertinggi terjadi pada konsentrasi 20 ppm sebesar 75.69%. Tingginya persentase penghambatan terhadap aktivitas enzim, menunjukkan kecocokan perpaduan ekstrak bersaing dengan substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim. Daya inhibisi terendah terjadi pada konsentrasi 10 ppm sebesar 40.63%.
Kombinasi kedua adalah gabungan ekstrak air asam gelugur dan ekstrak air kunci pepet (1:1). Hasil penelitian menunjukkan daya inhibisi yang terjadi semakin menurun ketika konsentrasi ekstrak ditingkatkan. Hal ini dimungkinkan enzim lebih tertarik berikatan dengan substrat sehingga terjadi peningkatan aktivitas enzim. Daya inhibisi tertinggi terjadi pada konsentrasi 10 ppm sebesar 34.56%. Nilai yang didapatkan pada kombinasi kedua tidak melebihi kemampuan kombinasi pertama. Kandungan senyawa metabolit sekunder seperti flavonid dan tanin yang berfungsi sebagai inhibitor aktivitas lipase pada ekstrak air yang tidak terlalu melimpah menjadi salah satu alasan tidak mampunya ekstrak menyerang sisi katalitik enzim.
Kombinasi ketiga adalah gabungan ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak air kunci pepet (1:1). Data memperlihatkan aktivitas lipase pankreas dapat dihambat pada semua variasi konsentrasi dengan nilai yang tinggi dan relatif seragam. Persentase inhibisi tertinggi terjadi pada konsentrasi 20 ppm sebesar 72.91% dan terendah pada konsentrasi 25 ppm sebesar 53.58%. Kombinasi keempat yang merupakan gabungan ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak air kunci pepet (2:1) menunjukkan bahwa dengan peningkatan komposisi asam gelugur dalam perbandingan tidak menjadikan persentase penghambatan aktivitas lipase pankreas lebih tinggi dari kombinasi sebelumya. Hal ini mengartikan bahwa ekstrak air kunci pepet lebih optimal bekerja dengan ekstrak etanol kunci pepet pada perbandingan yang setara dalam menghambat lipase pankreas. Pada kombinasi keempat, persentase inhibisi tertinggi sebesar 53.98% (25 ppm) dan terendah 38.04% (20 ppm).
Substansi variasi kombinasi ekstrak yang dilakukan adalah untuk mengetahui pengaruh penggabungan senyawa metabolit sekunder seperti flavonoid, saponin, dan tanin pada ekstrak kunci pepet dan asam hidroksisitrat -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 10 15 20 25 30 Da y a inh ibi si ( %)
Konsentrasi kombinasi ekstrak (ppm)
KP K1 K2 K3 K4 S1
(HCA) yang merupakan kandungan terbanyak dari buah asam gelugur selain saponin sebagai inhibitor lipase pankreas. Informasi data yang didapatkan sejalan berdasarkaan hasil penelitian Iswantini et al. (2003b) yang menyatakan bahwa ekstrak flavonoid, tanin, gabungan ekstrak steroid dengan tanin, dan tanin dengan flavonoid pada bangle dapat menghambat aktivitas lipase. Senyawa aktif saponin yang terdapat pada tanaman Thea sinensis (Han et al. 2001), Platycodi radix (Xu et al. 2005), Panax japonicus (Han et al. 2005), tanaman Kochia scoparia (Han et al. 2006), dan senyawa aktif tanin pada buah jenis berry (Gordon et al. 2009) dinyatakan juga berpotensi sebagai antiobesitas dengan menghambat aktivitas lipase pankreas.
Kandungan HCA pada tumbuhan marga Garcinia dapat mencapai 20-30% berdasarkan bobot kering (Lewis 1969) dan pada Garcinia atroviridis mencapai 45,17% (Muzakki 2006). HCA bersifat mudah larut dalam air dan alkohol. Sebagaimana pernyataan Lowenstein (1971) bahwa HCA mengurangi konversi karbohidrat menjadi lemak, maka HCA yang terkandung dalam buah gelugur akan menghambat secara kompetitif kerja enzim ATP-sitrat liase yang berfungsi mengubah asam sitrat menjadi asetil koenzim A. Dalam siklus Krebs, asetil Ko-A akan diubah menjadi malonil Ko-A yang kemudian dikonversi menjadi asam lemak. Hal ini memberikan arti bahwa HCA dapat berfungsi sebagai inhibitor aktivitas lipase dan ATP-sitrat liase.
Kunci pepet yang berpotensi sebagai antiobesitas dilakukan pengujian lanjutan dalam konsentrasi yang lebih rendah. Gambar 7 memberikan informasi daya inhibisi dari ekstrak kunci pepet tunggal hanya sebesar 25.29% (10 ppm). Pada konsentrasi 25 dan 30 ppm persentase inhibisi bernilai sangat rendah bahkan bernilai negatif. Keadaan yang bertolak belakang ini kemungkinan disebabkan adanya faktor antagonis dalam mekanisme kerja yang berakibat enzim teraktifkan.
Hasil pengujian in vitro terhadap beberapa variasi kombinasi, dihasilkan persentase inhibisi tertinggi pada kombinasi pertama sebesar 75.69% (20 ppm). Grafik membentuk pola polynomial dengan persamaan y = 2.539x2 + 6.767x – 2.608 dengan nilai koefisien determinasi 0.951. Konsentrasi kombinasi ekstrak yang dapat menginhibisi 50% aktivitas enzim lipase pankreas (IC50)
didapatkan pada konsentrasi 11.23 ppm. Mekanisme kerja inhibitor enzim yang terjadi belum diketahui secara pasti apakah
kompetitif, unkompetitif, atau nonkompetitif. Tipe inhibitor kompetitif memiliki kemungkinan cukup besar karena ekstrak harus bersaing dengan substrat untuk berikatan dengan enzim sebelum enzim merubah substrat menjadi produk yang dalam hal ini adalah asam lemak. Orlistat (tetrahidrolipstatin) termasuk tipe inhibitor kompetitif. Sisi aktif katalitik enzim lipase pankreas akan menyerang gugus ester yang sama-sama dimiliki substrat (lemak) maupun orlistat (Tiss et al. 2009). Struktur orlistat ditunjukkan pada Gambar 8.
Gambar 8 Struktur orlistat.
Asam hidroksisitrat pada buah gelugur mempunyai tiga gugus karboksilat yang sama dimiliki asam sitrat diketahui sebagai inhibitor kompetitif terhadap aktivitas ATP-sitrat liase (Loon et al. 2000). Berdasarkan penelitian Watson et al. (1969), HCA memiliki afinitas yang lebih besar untuk bereaksi dengan ATP-sitrat liase bila dibandingkan dengan substrat alaminya, yaitu asam sitrat.
Konsentrasi reaktan memainkan peran yang penting pada reaksi inhibisi, karena ketika konsentrasi ekstrak berlebih, kemungkinan terbesar sisi aktif enzim lebih memilih sisi aktif reaktan. Hasil uji in vitro yang menunjukkan nilai tertinggi terhadap penghambatan aktivitas enzim lipase pankreas dijadikan acuan tingkatan dosis untuk pengujian lanjutan (in vivo) terhadap hewan coba tikus putih.
Uji In Vivo Berdasarkan Bobot Badan dan Konsumsi Pakan
Khasiat kombinasi ekstrak kunci pepet dan asam gelugur sebagai pelangsing diuji secara in vivo terhadap tikus putih betina jenis SD (Sprague-dawley). Sebelum perlakuan, dilakukan terlebih dahulu adaptasi kandang selama dua minggu dengan tujuan mengkondisikan tikus terhadap lingkungan tempat tinggal. Bobot badan (BB) pada saat adaptasi cenderung terus naik setiap minggunya (Gambar 9/Lampiran 11). Kenaikan ini menunjukkan keadaan yang
positif dari sisi kesehatan tikus, sehingga pengujian ekstrak dapat dilakukan.
Pakan yang digunakan adalah pelet dengan komposisi protein 18%, lemak 4%, fiber 4%, abu 11%, dan metabolisme energi 2000 kkal. Adaptasi pakan dilakukan selama 9 hari sebelum perlakuan dengan tujuan mengetahui jumlah pakan yang dibutuhkan tikus dalam satu harinya. Berdasarkan pengamatan tiga variasi jumlah pakan, yaitu 40, 50, dan 60 gram, didapatkan jumlah ideal yang diperlukan sebanyak 40 gram/hari, sehingga jumlah pakan yang diberikan selama perlakuan 30 hari sebanyak 40 gram untuk konsumsi dua ekor tikus.
Dosis ekstrak yang diberikan pada perlakuan 1 berdasarkan konsentrasi ekstrak yang menghasilkan inhibisi tertinggi pada uji in vitro, adapun pada perlakuan 2 merupakan kelipatan 4 dari dosis 1, dan pada perlakuan 3 merupakan kelipatan 4 dari dosis 2. Dosis yang diberikan untuk kontrol positif sebanyak
2.16 mg/200 mg BB/hari mengacu pada Rahardjo et al. (2005). Pemberian ekstrak pada tikus dilakukan dengan cara dicekok.
Data hasil pengamatan dihitung menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) in time, Hal ini karena adanya pengamatan berlanjut dan erat kaitannya dengan waktu. Pengamatan pada saat perlakuan difokuskan pada perkembangan berat badan dan jumlah pakan yang dikonsumsi. Penghitungan dilakukan secara parsial (satu per satu) setiap enam hari sekali dan simultan (keseluruhan) terhadap setiap perlakuan.
Respon pertama dimulai dari pengaruh interaksi perlakuan dan waktu terhadap respon bobot badan per enam harinya (Lampiran 11). Data statistik menunjukkan interaksi ini mempunyai nilai p < α (0.05). Data lengkap perhitungan statistik disajikan pada Lampiran 12. Grafik bobot badan sebelum dan selama perlakuan di perlihatkan pada Gambar 9.
Gambar 9 Bobot badan tikus sebelum dan selama perlakuan. P1: perlakuan 1; P2: perlakuan 2; P3: perlakuan 3; KP: kontrol positif; KN: kontrol negatif.
Hari ke-12 sama dengan hari ke-0 awal perlakuan. Kelompok kontrol negatif merupakan
kelompok tikus yang tidak diberikan ekstrak ataupun obat pelangsing yang sudah dikomersialkan. Setiap harinya kelompok perlakuan mendapat tambahan 2 mL akuades. Bobot badan pada kontrol negatif cenderung selalu naik dalam setiap minggunya dan grafik terlihat membentuk pola yang linear. Persentase kenaikan tertinggi terjadi pada enam hari pertama perlakuan sebesar 9.19% dan dalam waktu 30 hari bobot badan dapat naik sampai 25.78% sebesar 238.25 g dari
bobot badan awal hari ke-0 perlakuan sebesar 189.42 g. Aktivitas lipase pankreas pada tikus kelompok kontrol negatif dimungkinkan berjalan normal sehingga berdampak pada tingginya penyerapan asam lemak dalam usus yang dapat memicu kegemukan.
Pola pertambahan bobot badan kontrol positif hampir sama dengan kontrol negatif membentuk pola linear, tetapi sedikit lebih rendah. Hal ini terjadi juga pada perlakuan 1 dan 2. Persentase kenaikan tertinggi kelompok kontrol positif terjadi pada enam hari pertama 150 165 180 195 210 225 240 0 6 12 18 24 30 36 42 Respo n bo bo t ba da n ( g ) Waktu (hari) P1 P2 P3 KP KN Sebelum Perlakuan Selama Perlakuan
perlakuan sebesar 7.38% dan naik 22.67% dari 185.25 g menjadi 227.25 g dalam waktu 30 hari perlakuan.
Perlakuan 1 merupakan kelompok tikus yang mendapat sediaan kombinasi ekstrak dengan dosis terendah, yaitu sebesar 36 mg/200 BB. Gambar 9 menunjukkan rerata bobot badan pada hari ke-30 sebesar 220.33 g atau 18.62% lebih tinggi dari bobot badan pada hari ke-12 atau awal perlakuan. Pemberian kombinasi ekstrak sebagai penghambat aktivitas lipase pankreas pada perlakuan 1 lebih dapat terlihat pengaruhnya dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif. Meskipun pola perkembangan bobot badan pada grafik memperlihatkan pergerakan yang sama membentuk pola linear, akan tetapi lebih rendah, sehingga dosis ekstrak pada perlakuan 1 cenderung menjaga bobot badan dari kenaikan yang berlebih dan tidak memberikan efek untuk menurunkan bobot badan.
Tingkatan dosis ekstrak yang kedua adalah sebesar 141 mg/200 BB dan diberikan pada kelompok tikus perlakuan 2. Pemberian ekstrak pada perlakuan 2 memberikan pengaruh nyata jika dibandingkan dengan kontrol negatif atau kontrol positif, tetapi tidak berbeda secara signifikan dibandingkan dengan perlakuan 1. Persentase kenaikan tertinggi terjadi pada enam hari pertama perlakuan sebesar 6.88% dan naik 16.64% selama 30 hari perlakuan. Dosis ekstrak perlakuan 2 mampu menjaga perkembangan bobot badan dari kenaikan yang berlebihan.
Dosis ekstrak tertinggi diberikan pada kelompok tikus perlakuan 3 sebesar 564 mg/200 BB. Pemberian dosis ekatrak pada perlakuan 3 memberikan pengaruh yang sangat signifikan dibandingkan dengan perlakuan yang lainnya. Penurunan bobot badan terjadi pada 12 hari pertama perlakuan sebesar 11.22%. Bobot badan setelah 12 hari pertama perlakuan mulai mengalami kenaikan kembali dan puncaknya terjadi pada enam hari terakhir sampai 180.33 g, tetapi belum melebihi bobot badan awal perlakuan sebesar 185.75 g. Hal ini dimungkinkan terjadinya penyesuaian lambung dalam menerima kehadiran ekstrak sehingga ekstrak efektif diberikan selama 12 hari pertama. Dosis ekstrak pada perlakuan 3 memberikan efek yang cukup kuat dan signifikan sehingga berpotensi menurunkan bobot badan.
Kombinasi kedua ekstrak pada perlakuan 3 dapat menurunkan bobot badan tikus sampai 11.22% dalam jangka waktu 12 hari. Pergerakan grafik pada perlakuan 3 mengikuti
pola polynomial dengan persamaan y = 2.599x2 – 13.30x + 183.2 dengan koefisien determinasi R2 sebesar 0.840. Hal ini sama dengan pola pergerakan grafik persen inhibisi tertinggi secara in vitro.
Perhitungan data bobot badan selain dihitung secara parsial, juga secara simultan (menyeluruh) dari semua data. Hasil analisis rancangan acak lengkap menunjukkan nilai- p > α (0.05). Nilai ini menunjukkan terdapat pengaruh nyata dari perlakuan. Pengaruh perlakuan terhadap rerata bobot badan untuk kelima perlakuan diperlihatkan pada Gambar 10. Rerata bobot badan pada perlakuan 1 dan 2 menunjukkan nilai yang hampir sama sebesar 208.57 g dan 208.05 g. Hal ini menunjukkan tingkatan dosis sampai perlakuan 2 tidak memberikan pengaruh yang signifikan. Akan tetapi, nilai yang diperlihatkan pada Perlakuan 1 dan 2 masih menunjukkan adanya pengaruh pada pencegahan perkembangan bobot badan karena masih di bawah rerata bobot badan kontrol negatif yang mempunyai rerata tertinggi sebesar 222.92 g. Kontrol positif memiliki pengaruh yang paling kecil dibandingkan dengan kontrol negatif dan dihasilkan rerata bobot badan sebesar 213.58 g. Pengaruh terbesar ekstrak terhadap penurunan bobot badan ditunjukkan pada perlakuan 3 yang menghasilkan rerata sebesar 171.38 g.
Gambar 10 Rerata bobot badan berbagai kelompok perlakuan.
Hal yang berpengaruh terhadap respon bobot badan selain perlakuan adalah waktu. Data statistik menunjukkan nilai- p >α (0.05). Grafik pengaruh waktu terhadap bobot badan secara simultan ditunjukkan pada Gambar 11. Berdasarkan Gambar, bobot badan secara keseluruhan cenderung meningkat per enam harinya. Kenaikan tertinggi sangat terlihat pada enam hari terakhir perlakuan sebesar 4.89% dari 203.06 g menjadi 213 g. Kenaikan
208.57 208.05 171.38 213.58 222.92 0 50 100 150 200 250 P1 P2 P3 KP KN Respo n bo bo t ba da n ( g ) Perlakuan
yang terjadi dapat disebabkan keadaan tikus yang sedang cenderung berkembang.
Gambar 11 Rerata bobot badan pada berbagai waktu.
Penelitian obat untuk menurunkan bobot badan melalui mekanisme penghambatan aktivitas lipase pankreas salah satunya berdasarkan hasil penelitian Kaur dan Kulkarni (2000) yang menyatakan, kombinasi ekstrak 5 tanaman herbal OB-200G, ekstrak teasaponin (Han et al. 2001), dan ekstrak kulit
jeruk, teh hitam, kafein (Huang et al. 2009) secara signifikan menurunkan bobot badan tikus dibandingkan dengan kontrol yang mendapatkan pakan dengan asupan lemak tinggi.
Respon kedua selain bobot badan adalah pakan. Hasil analisis menunjukkan terdapat pengaruh nyata dari perlakuan, waktu, serta interaksi perlakuan dan waktu terhadap konsumsi pakan. Grafik bobot badan sebelum dan selama perlakuan di perlihatkan pada Gambar 12.
Konsumsi pakan pada kontrol negatif terjadi peningkatan yang signifikan pada enam hari pertama perlakuan, yaitu dari 27.94 g menjadi 32.83 g atau 17.51%. Secara umum jumlah pakan yang dikonsumsi cenderung naik setiap minggunya. Hal ini karena tikus yang berusia sekitar 9 minggu sedang mengalami perkembangan dan membutuhkan banyak energi. Jumlah pakan yang dikonsumsi sebelum perlakuan memilki respon yang berbeda dengan masa perlakuan.
Gambar 12 Jumlah konsumsi pakan KN, KP, P1, P2, dan P3. Hari ke-0 diartikan sebagai Sembilan hari masa adaptasi. Adapun selama 30 hari perlakuan tidak
berbeda secara nyata. Konsumsi tertinggi terjadi pada enam hari terakhir sebanyak 32.94 g.
Pengaruh terhadap kontrol positif secara umum menunjukkan jumlah pakan yang dikonsumsi cenderung naik. Kenaikan tertinggi terjadi pada enam hari pertama perlakuan sebesar 9.19% atau 0.52x dari kontrol negatif. Rerata jumlah pakan yang dikonsumsi dalam setiap minggunya pada kontrol positif sedikit lebih rendah dibandingkan dengan jumlah pakan yang dikonsumsi pada kelompok kontrol negatif,
tetapi secara statistik hasil tersebut tidak berbeda secara nyata.
Jumlah pakan yang dikonsumsi pada kelompok perlakuan 1 menunjukkan terjadinya penurunan sampai hari ke-24 perlakuan. Konsumsi pakan tertinggi terjadi pada waktu sebelum perlakuan sebanyak 29.81 g disusul enam hari terakhir 29.58 g. Berdasarkan uji lanjut Duncan (Lampiran 14), konsumsi pakan pada perlakuan 1 tidak memperlihatkan respon yang berbeda antara waktu yang satu dengan yang lain. Akan tetapi rerata pakan yang dikonsumsi memiliki nilai yang lebih rendah dan memberikan
190.80 197.89 201.78 203.06 213.00 170 180 190 200 210 220 6 12 18 24 30 Respo n bo bo t ba da n ( g ) Waktu (hari)
pengaruh yang berbeda dalam setiap waktunya dibandingkan dengan kontrol negatif. Pemberian ekstrak pada perlakuan 1 dapat sedikit menurunkan nafsu makan.
Pemberian dosis ekstrak pada perlakuan 2 memberikan pengaruh terhadap jumlah pakan yang dikonsumsi. Berdasarkan data statistik jumlah konsumsi pakan tidak memberikan respon yang berbeda pada setiap minggunya. Respon pakan menunjukkan perbedaan dibandingkan kontrol negatif dengan nilai yang lebih rendah. Konsumsi pakan tertinggi pada perlakuan 2 terjadi pada waktu sebelum perlakuan sebesar 29.81 g per hari.
Dosis pada perlakuan 3 memberikan pengaruh yang cukup kuat pada penurunan konsumsi pakan. Pada enam hari pertama perlakuan, jumlah pakan yang dikonsumsi turun sebesar 48.65% dari 30.13 g menjadi 15.47 g. Peningkatan konsumsi pakan pada minggu berikutnya tidak melebihi jumlah pakan tikus sebelum perlakuan sebesar 30.13g. Jumlah pakan yang dikonsumsi bardasarkan analisis statistik menunjukkan perbedaan yang signifikan dibandingkan perlakuan yang lainnya. Pola grafik pada perlakuan 3 terhadap respon pakan mengikuti pola polynomial. Pemberian ekstrak pada perlakuan 3 berpotensi menurunkan bobot badan dengan mekanisme menekan nafsu makan.
Berdasarkan data hasil uji simultan, pengaruh perlakuan terhadap rerata pakan yang dikonsumsi ditunjukkan pada Gambar 13.
Gambar 13 Rerata konsumsi pakan pada berbagai kelompok perlakuan. Hasil yang diperlihatkan pada Gambar 13 terlihat satu tipe dengan grafik pengaruh perlakuan terhadap bobot badan. Konsumsi pakan pada kontrol negatif merupakan yang terbanyak dibandingkan dengan kelompok lain, yaitu sebanyak 31.91 g lebih tinggi pada
saat sebelum perlakuan, yaitu sebanyak 27.94 g (Lampiran 14). Konsumsi pakan kedua terbanyak dimiliki kontrol positif. Rerata pakan yang dikonsumsi pada kontrol positif yaitu sebesar 30.26 gram per harinya. Nilai ini lebih tinggi jika dibandingkan pada saat sebelum perlakuan, yaitu sebanyak 27.83 g.
Rerata pakan yang dikonsumsi pada perlakuan 1 dan 2 hampir sama. Pakan yang dikonsumsi pada perlakuan 1 lebih rendah dari kontrol yaitu sebanyak 28.48 g per harinya turun dibanding sebelum perlakuan sebanyak 29.81 g. Adapun pada perlakuan 2 menghabiskan 28.08 g per harinya dan mengalami penurunan dibanding sebelum perlakuan 29.85 g. Pemberian dosis tertinggi pada perlakuan 3 mengakibatkan penurunan nafsu makan yang nyata, sehingga rerata pakan yang dikonsumsi menunjukkan nilai yang paling rendah sebesar 19.87 g jauh lebih rendah dibandingkan sebelum perlakuan yang menghabiskan 30.13 g per hari untuk dua ekor tikus.
Pengaruh nyata terhadap pakan dipengaruhi juga oleh waktu. Data terhadap respon pakan secara simultan diperlihatkan pada Gambar 14.
Gambar 14 Rerata jumlah pakan yang dikonsumsi selama perlakuan. Berdasarkan Gambar 14, pertambahan waktu tidak menunjukkan konsumsi pakan yang semakin meningkat. Konsumsi pakan pada enam hari kedua mempunyai nilai yang paling rendah sebesar 26.55 g, dan rerata pada enam hari pertama, ketiga, dan keempat menunjukkan nilai yang tidak berbeda nyata sekitar 27 g dan 28 g. Konsumsi pakan tertinggi terjadi pada enam hari terakhir sebanyak 29.29 g. Hal ini berbanding lurus dengan rerata bobot badan yang diperoleh pada enam hari terakhir secara simultan yang menunjukkan nilai bobot badan yang paling tinggi. 28.48 28.08 19.87 30.26 31.91 0 10 20 30 40 P1 P2 P3 KP KN K o ns um si pa k a n (g ) Perlakuan 27.46 26.55 28.01 27.29 29.29 25 26 27 28 29 30 6 12 18 24 30 Res p o n pa k a n ( g ) Waktu (hari)
Asam hidroksisitrat diketahui tidak berpengaruh terhadap nafsu makan (Mattes dan Bormann (2000). Pengaruh yang terjadi dimungkinkan dari senyawa metabolit sekunder baik dari asam gelugur maupun kunci pepet. Kombinasi ekstrak yang diberikan terutama pada perlakuan 3 berdasarkan respon terhadap bobot badan dan jumlah pakan yang dikonsumsi setiap harinya, maka kombinasi ekstrak dapat menghambat aktivitas lipase pankreas dan menekan nafsu makan sehingga dapat menurunkan bobot badan.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Data hasil uji in vitro menunjukkan kombinasi ekstrak asam gelugur dan rimpang kunci pepet berpotensi menurunkan bobot badan dengan jalan menghambat aktivitas lipase pankreas. Persentasi penghambatan tertinggi terjadi pada kombinasi ekstrak etanol asam gelugur dan ekstrak etanol kunci pepet (1:1) pada konsentrasi 20 ppm sebesar 75.69%.
Hasil uji in vivo menunjukkan dosis ekstrak pada perlakuan 3 mempunyai efek menurunkan bobot badan sebesar 11.22% selama 12 hari dengan mekanisme kerja menghambat aktivitas lipase pankreas dan menurunkan nafsu makan.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui mekanisme kinetika reaksi, sehingga didapatkan tipe inhibitor (kompetitif, unkompetitif, atau nonkompetitif) yang tepat dalam menghambat aktivitas enzim lipase pankreas.
DAFTAR PUSTAKA
Achmadi SS. 2001. The potency of potassium hydroxycitrate derived from gelugur fruit (Garcinia atroviridis) in reducing body weight and cholesterol levels in rats. Hayati 8(1):23-26.
Al-Suwailem AK, Al-Tamimi AS, Al-Omar MA, Al-Suhibani MS. 2006. Safety and mechanism of action of orlistat (tetrahydrolipstatin) as the first local antiobesity drug. J Appl Sci Res2(4): 205-208.
Alviar B et al. 2002. Diet composition and method of weight management. United States Patents No. 6413545. [terhubung berkala]. www.uspto.gov. [18 Mar 2009]. [AOAC] Association of Official Analytical
Chemist. 1984. Official Methods of Analysis. Ed ke-14. Arlington: Association of Official Analytical Chemist.
[BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2004. Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia. Volume 1. Jakarta: Badan POM RI.
Chung CS. 2006. Sweet and sour, the lovely gelugor. Gardenwis 26:18-19.
Desnuelle P, Savary P. 1963. Specifities of lipases. J Lipid Res 4:369-384.
Fitriani A. 2009. Uji in vitro ekstrak air dan etanol dari buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur sebagai inhibitor aktivitas lipase pankreas [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Gaman PM, Sherrington KB. 1992 . Ilmu Pangn, Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi, dan Mikrobiologi, Edisi Kedua. Murdijati Gardjito dkk, penerjemah. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada Press. Terjemahan dari: The Science Of Food, An Introduction to Food Science, Nutrition and Microbiology, Second edition.
Gordon J, McDougall, Nimish N, Kulkarni, Derek Stewart. 2009. Berry polyphenols inhibit pancreatic lipase activity in vitro. Food Chem 115:193–199.
Han LK et al. 2001. Anti-obesity effects in rodents of dietary teasaponin, a lipase inhibitor. Int J of Obesity 25:1459-1464. Han LK et al. 2005. Anti-obesity effects of
chikusetsusaponins isolated from Panax japonicus rhizomes. [artikel]. BioMed Central 5(9):1-10.
Han LK et al. 2006. Reduction of fat storage in mice fed a high-fat diet long term by treatment with saponins prepared from Kochia scoparia fruit. [artikel]. Phytother Res.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Terjemahan K. Padamawinata & I. Soediro. Bandung: ITB.
Hariana R. 2008. Tumbuhan Obat dan Khasiatnya Seri 2. Jakarta: Penebar Swadaya.
Harjadi W. 1987. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Erlangga.
Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid ke-3. Jakarta: Yayasan Sarana Warna Jaya.
Huang YW, Liu Y, Dushenkov S, Tang HC, Huang MT. 2009. Anti-obesity effects of epigallocatechin-3-gallate, orange peel extract, black tea extract, caffeine and their combinations in a mouse model. J Func Food 1: 304-310.
Iswantini D, Darusman LK, Gunawan E, Nurulita Y. 2003a. Identifikasi senyawa bioaktif daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) sebagai pelangsing dengan menggunakan metode enzimatis. Gakuryoku 9(2):138-142.
Iswantini D, Darusman K, Febriany S. 2003b. Pengaruh ekstrak tunggal dan gabungan dari bangle terhadap aktivitas enzim lipase dalam kajian sebagai pelangsing. Di dalam: Prosiding Seminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XXIV; Bogor, 19-20 September 2003. Pusat Studi Biofarmaka LP-Institut Pertanian Bogor; 2003. hlm 276-282.
Jansen PCM. 1992. Plant Resourches Sout-East Asia No 2: Edible fruits and nuts. EWM Verheij dan PE Coronel, editor. Bogor: Prosea. Hal 175-177.
Kaur G, Kulkarni SK. 2000. Antiobesity effect of a polyherbal formulation, ob-200g in femalerats fed on cafeteria and atherogenic diets. Ind J of Pharm 32:294-299.
Lebenthal E, Damayanti S. 2007. Obesity as a poverty-related emerging nutrition problem in indonesia. http://ugm.ac.id/ second.php?action=viewartikel&id=5. html [10 Mar 2009].
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid I. Maggy Thenawijaya, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.
Lewis YS. 1969. Isolation and properties of hydroxycitric acid. Methods in Enzymology, vol ke-13. New York: Academic Pr. Hlm 613-619.
Lewis YS, Neelakantan S. 1965. (-)-Hydroxycitric acid the principle acid in the fruits of Garcinia cambogia Desr. Phytochem 4:619-625.
Loon LJC et al. 2000. Effects of acute (_)-hydroxycitrate supplementation on substrate metabolism at rest and during exercise in humans1,2. Am J Clin Nutr 72: 1445-1450.
Lowenstein JM. 1971. Effect of (-)-hydroxycitrate on fatty acid synthesis by rat liver in vivo. J Biol Chem 246:629-632. Martatilofa E. 2008. Daya inhibisi ekstrak bangle, jati belanda, kemuning, dan formula biolangsing terhadap lipase pankreas [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Mattes RD, Bormann L. 2000. Effects of (-)-hydroxycitric acid on appetitive variables. Physiol&Behaviour 71: 87-94.
Meyer et al. 1982. Brine shrimp: A convient general bioassay for active plant constituents. Planta Medica 45:31-34. Mursito B. 2007. Ramuan Tradisional untuk
Pelangsing Tubuh. Depok: Penebar Swadaya.
Muzakki MH. 2006. Pencirian produk pemisahan asam hidroksisitrat dari buah gelugur (Garcinia atroviridis) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Pramono S, Nurwati S, Sugiyanto. 2000. Pengaruh lendir daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.). Warta Tumbuhan Obat Indonesia 6(2): 14-5. Rahardjo SS, Ngatijan, Pramono S. 2005.
