PENGHAMBATAN PROTEASE OLEH ZAT ANTI NUTRISI
Oleh :
Nama : Dyna Ratnasari Plashintania
NIM : B1J013203
Rombongan: III Kelompok : 1
Asisten : Sutri Handayani
LAPORAN PRAKTIKUM FISIOLOGI NUTRISI
KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO
I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Pangan, baik nabati maupun hewani dibutuhkan oleh manusia untuk mempertahankan kehidupannya sebagai sumber karbohidrat (energi), protein, lemak, vitamin, mineral dan sebagainya. Sehubungan dengan itu, maka yang diharapkan adalah pangan yang aman untuk dikonsumsi yang berarti tidak menimbulkan efek negatif apapun bagi yang mengkonsumsinya. Untuk itu maka pemilihan sumber bahan pangan dan cara pengolahannya menjadi dua hal yang sangat penting untuk diperhatikan (Vries, 1997).
Bahan pangan, terutama bahan nabati, secara alami dapat mengandung senyawa antinutrisi yaitu senyawa-senyawa yang dapat menurunkan nilai gizi bahan pangan tersebut. Adapun berbagai senyawa antinutrisi yang telah banyak dipelajari dan diteliti antara lain adalah antitripsin-antikimotripsin, hemaglutinin, saponin, fitat, oligosakarida penyebab flatulensi dan tanin. Selain dikenal sebagai senyawa antinutrisi, senyawa yang terakhir ini juga dikenal sebagai senyawa antioksidan yang bermanfaat bagi tubuh. Peranannya sebagai antinutrisi atau antioksidan dipengaruhi keberadaannya dalam bahan pangan dan oleh kondisi fisiologis di dalam tubuh (Vries, 1997).
Proses- proses diatas dapat terhambat oleh adanya aktivitas zat-zat yang memberikan dampak negatif bagi tubuh, yaitu senyawa zat antigizi. Senyawa antigizi memang banyak macamnya, tetapi yang dapat menghambat aktivitas enzim pada proses pencernaan salah satunya yaitu antitripsin. Sebagai salah satu senyawa antigizi, antitripsin merupakan kelompok penghambat enzim, yang secara luas dapat didefinisikan sebagai substansi yang dapat mengurangi aktivitas enzim. Dapat mengurangi efisiensi kerja pencerna protein yang dilakukan enzim tripsin (Vries, 1997).
Komponen makanan yang bisa menyebabkan efek racun tanpa menjadi agen penyebab efek racun itu sendiri. Antinutrisi bisa mengganggu komponen makanan sebelum diserap selama proses pencernaan didalam saluran makanan, dan setelah diabsorpsi oleh tubuh. Antinutrisi juga menimbulkan efek toksik secara tidak langsung denganjalan menyebabkan kekurangan nutrisi atau mengganggu kegunaan dan penggunaan nutrisi oleh tubuh kita. Antinutrisi bisa mengganggu penyerapan nutrisi makanan serta menimbulkan efek toksik secara tidak langsung. Antinutrisi
adalah komponen makanan yang bisa menyebabkan efek racun tanpa menjadi agen penyebab efek racun itu sendiri (Pesti, 2003)
Biji legum merupakan sumber protein yang sangat baik untuk diet namun berisi beberapa kelas protein yang menolak proteolisis ke dalam derajat yang berbeda, mempertahankan aktivitas biologis selama pencernaan karena tingkat tinggi stabilitas dan / atau afinitas target enzim atau reseptor, atau sebaliknya negatif apabila terkait dengan kualitas. Penelitian in vivo telah mengidentifikasi beberapa dari kelas-kelas protein yang tahan terhadap pencernaan, termasuk lektin, protease inhibitor protein albumin dan, yang berbeda dalam jenis, kelimpahan dan relevansi antara spesies leguminosa. Di sini kita telah menargetkan protease inhibitor, luas di kalangan tanaman legum, dengan tujuan mengidentifikasi mutasi untuk studi dasar mekanisme aksi dan dengan potensi untuk meningkatkan kualitas benih protein (Clemente et al., 2015).
1.2 Tujuan
Tujuan praktikum acara Penghambatan Protease Oleh Zat Anti Nutrisi adalah untuk mengetahui efek menggunakan zat anti nutrisi yang berasal dari biji kedelai (crude anti trypsin) terhadap perubahan aktivitas protease ikan.
II. MATERI DAN METODE 2.1 Materi
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum acara Penghambatan Protease Oleh Zat Anti Nutrisi yaitu tabung reaksi kecil, sentrifugator 4 0C, spektrofotometer,
mikropipet, blue dan yellow tip, inkubator dan sarung tangan lateks.
Bahan yang digunakan yaitu ekstrak enzim, ekstrak kasar anti nutrisi dari kedelai, reagen kimia.
2.2 Metode
Metode yang dilakukan dalam praktikum antara lain:
1. Pada tabung sampel dicampurkan buffer Tris HCl pH 8,1, crudeanti tripsin ( 100 mL), dan ekstak enzim (50 mL).
2. Diinkubasikan selama 10 menit pada 37 0C selama 10 menit setelah
inkubasi ditambahkan substrat kasein 1 % sebanyak 350 mL. Reaksi dicampurkan kemudian diinkubasi ulangpada 37 0C selama 30 menit.
3. Setelah inkubasi selesai, reaksi dihentikan dengan penambahan 750 mL dari 8 % (w/v) asam trichloroasetat (TCA).untu.
4. Untuk blanko, dilakukan prosedur yang sama kecuali ekstrak enzim ditambahan setelah pemberian TCA sebanyak750 mL
5. Untuk standard, 4 tabung standard diis masing-masing dengan 50 mL, 100 mL, 200 mL, 400 mL larutan tirosin standar (kons. 1000 mL/mL), lalu diencerkan dengan akuabidest hingga volume 400 mL. Pada ke semua tabung ditambahkan 350 mL substrat kasein, diinkubasikan pada suhu 37 0C selama 30 menit. Setelah inkubasi ditambahkan 750
mL reagent TCA 8%.
6. Setelah didiamkan minimal selama 60 menit di dalam refrigerator, reaksi dicampurkan lalu disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 10 menit.
7. Supernatannya diambil sebanyak 1000 mL dan dimasukan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi akuabides 1500 mL.
8. Campuran dihomogenkan dengan mengguakan vorteks.
9. Absorbansi campuran reaksi diukur pada panjang gelombang 280 nm 10. Aktivitas protease dihitung menggunakan kurva standar tirosin yang
III. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Hasil
Tabel 3.1 Data Rombongan III Metode Preparasi Jaringan Kel. Jenis Ikan No. Eppendorf sebelum sentrifugasi No. Eppendorf sesudah sentrifugasi Berat Usus (gram) Berat Tris-HCl Buffer (x 8 gram) 1 lele makan 53-54 33-34 1,30 gr 10,4 gr lele puasa 55-56 35-36 0,75 gr 6 gr 2 lele makan 57-58 37-38 1.13 gr 9,04 gr lele puasa 59-60 39-40 0,61 gr 4,88 gr 3 nilem makan 61-62 41-42 0,73 gr 5,84 gr nilem puasa 63-64 43-44 0,97 gr 7,76 gr 4 nilem makan 65-66 45-46 0,94 gr 7,52 gr nilem puasa 67-68 47-48 0,66 gr 5,28 gr
Tabel 3.1.2 Hasil pengukuran aktivitas protease ikan nilem (Osteochilus vittatus) N
o Standar Sampel Blanko
Aktivitas enzim dalam konsentrasi (X) Aktivitas enzim dalam konsentrasi (X) / menit 1 25,000 572,634 2 50,000 624,598 - 23,656 - 1,1828 3 100,000 622,272 4 200,000 70,873 5 400,000 70,408 - 6,4515 - 0,3225 77,092 = Ikan Makan
Data Ikan Lele (Clarias batrachus)
1. Ikan lele puasadengan bobot usus : 0,75 gram
Bobot usus ikan : Perbandingan Pengenceran Tris HCl buffer = 1 : 8 Kebutuhan Tris HCl buffer
Hasil Penghambatan Aktivitas Protease oleh Zat Antinutrisi dengan Spektrofotometer
1. Ikan makan : Tabung sampel 49: 572,634 Tabung sampel 50 : 624,598 Tabung blanko : 622,272 Tabung kontrol 52 : 70,873 Tabung kontrol 53 : 70,408 Tabung blanko : 77,092 Perhitungan
1. Aktivitas Penghambatan Enzim dinyatakan dalam Konsentrasi (x) 1. Lele makan yang dihambat : sampel 1 + sampel 2 – konsentrasi blanko
2
= 572,634 + 624,598 - 622,272 = - 23,656 2
2. Lele makan yang tidak dihambat : sampel 1 + sampel 2 – konsentrasi blanko 2
= 70,873+ 70,408 - 77,092 = - 6,4515 2
2. Aktivitas Pengahambat Enzim dinyatakan dalam Konsentrasi/ Menit 1. Lele makan yang dihambat : x
Waktu inkubasi (20 menit) = - 23,656 = - 1,1828 20
2. Lele makan yang tidak dihambat : x
Waktu inkubasi (20 menit) = - 6,4515 = - 0,3225 20
Penghambatan Protease (41-50) Penghambatan Protease (51-54)
3.2 Pembahasan
Berdasarkan hasil yang diperoleh menunjukan bahwa aktivitas protease permenit pada ikan lele makan yang dihambat adalah - 1,1828 U/menit sedangkan aktivitas protease permenit pada ikan lele makan yang tidak dihambat zat anti nutrisi adalah - 0,3225 U/menit. .Jika dibandingkan dengan hasil konsentrasi protease yang diperoleh dari percobaan pengukuran hasil aktivitas protease yang mana rata-rata konsentrasinya lebih tinggi dibandingkan dengan hasil spektofotometri larutan yang telah diberi zat antitripsin. Hasil tersebut dikarenakan adanya penghambatan aktivitas protease oleh zat antitripsin sehingga dengan absorbansi yang tinggi hasil akan relatif lebih rendah. Kecilnya hasil spektofotometri pada penghambatan akibat antitripsin, larutan yang tidak terlalu pekat.
Antinutrisi merupakan senyawa yang mengakibatkan inaktivasi senyawa lain. Antinutrisi juga mengacu pada penghambatan kemampuan dalam metabolisme nutrisi yang ada dalam saluran pencernaan. Faktor antinutrisi termasuk didalamnya adalah inhibitor enzim, flektin, tannin, asam fitik dan saponin (Bora, 2014). Senyawa yang digunakan dalam praktikum penghambatan protease oleh zat anti nutrisi adalah crude anti tripsin yang bekerja dalam menghambat kerja enzim protease yang terdapat di intestin ikan. Zat antitripsin dapat diperoleh secara sintetis atau dari tumbuhan. Zat antitripsin secara alami banyak terdapat di kacang-kacangan, salah satu contohnya adalah kedelai. Pengolahan yang tidak benar atau masih terdapat getah pada biji dapat menyebabkan gangguan pencernaan jika dikonsumsi. Gangguan tersebut dikarenakan adanya penghambatan aktivitas protease, yang sesungguhnya diperlukan dalam proses digesti khususnya hewan-hewan dengan diet protein. Hewan karnivora yang mengkonsumsi makanan dengan kadar zat antitripsin yang tinggi akan menggangu proses digesti, pemecahan tirosin menjadi asam amino yang lebih sederhana. Inhibitor tripsin ada 2 macam yaitu inhibitor yang larut dalam aseton, alkohol dan asam trikloroasetat, dan amonium sulfat serta inhibitor tripsin yang tidak larut dalam aseton, alkohol dan asam trikloroasetat, dan amonium sulfat (Vikraman et al., 2011).
Penghambat enzim protease yang terdapat di dalam kacang kedelai, kacang merah dan kentang ternyata juga mampu menghambat enzim elastase yaitu enzim yang dihasilkan oleh kelenjar pankreas. Enzim elastase merupakan enzim yang bekerja pada elastin, suatu protein yang tidak larut yang terdapat di dalam daging.
Oleh karena penghambat protein adalah juga protein, maka penghambat protein juga tidak tahan terdapat panas, umumnya sensitif pada panas lembab sedangkan pada panas kering biasanya kurang efektif. Pemanasan kacang kedelai menggunakan autoclave selama 20 menit pada suhu 115oC atau 40 menit pada suhu 107 sampai
108oC merupakan titik yang tepat untuk menghancurkan penghambat ini secara
maksimal. Perendaman awal di dalam air selama 12 sampai 24 jam membuat perlakuan pemanasan ini menjadi lebih efektif. Mendidihkan pada suhu 100oC
selama 15 sampai 30 menit sudah cukup untuk meningkatkan nilai nutrisi kacang kedelai yang direndam. Walaupun demikian, ada beberapa penghambat enzim protease yang relatif tahan terhadap panas. Sebagai contoh adalah penghambat tripsin pada susu. Pada susu murni yang belum mendapat perlakuan apapun, aktivitas tripsin dapat diturunkan 75 sampai 99%. Penghambatnya tidak terpengaruh jika dipanaskan pada suhu sampai 70oC. Proses pasteurisasi selama 40 detik pada suhu 72oC hanya
mampu menghancurkan penghambatnya 3 sampai 4%, pemanasan pada suhu 85oC
selama 3 detik menghancurkan 44 sampai 45% dan pemanasan pada suhu 95oC
selama 1 jam mampu menghancurkan sampai 73%. Penghambat enzim protease lainnya yang juga relatif tahan terhadap panas adalah penghambat trypsin pada alfafa dan kacang serendeng dan penghambat chymotrypsin pada kentang.
Penghambatan enzim proteolitik (tripsin dan kimotripsin) oleh senyawa antitripsin terjadi karena pembentukan ikatan kompleks antara enzim proteolitik dan senyawa antitripsin, jadi karena adanya interaksi proteion-protein. Pertama, akan terjadi pemutusan ikatan disulfide antara arginin-isoleusin pada senyawa inhibitor oleh enzim tripsin untuk membentuk senyawa inhibitor modifikasi. Selanjutnya terjadi ikatan antara gugus hidroksil serin yang terdapat pada sisi aktif enzim tripsin dan gugus karbonil arginin yang terdapat pada senyawa inhibitor modifikasi yang baru dibebaskan.
Pada umumnya faktor-faktor antinutrisi dalam bahan pangan dapat diinaktifkan melalui proses pengolahan. Namun terkadang proses pengolahan tidak dilakukan dengan cara yang benar sehingga ada kemungkinan senyawa. tersebut belum hilang, terutama untuk senyawa-senyawa yang tahan terhadap proses pemanasan. Keberadaan senyawa antinutrisi dalam bahan pangan dapat mengakibatkan penurunan nilai gizinya secara biologis. Seringkali nilai gizi protein secara biologis tidak selalu berkorelasi positif dengan skor kimia protein yang dihitung berdasarkan kandungan asam-asam amino esensialnya. Hal ini disebabkan
karena adanya faktor antinutrisi yang dapat berikatan dengan protein sehingga menyebabkan daya cerna protein tersebut berkurang. Bahan pangan yang banyak mengandung senyawa antinutrisi adalah kacang-kacangan dan serealia, sehingga pengolahannya harus mendapatkan perhatian yang serius terutama apabila akan digunakan untuk balita yang sedang dalam masa pertumbuhan dan memerlukan keberadaan protein dengan kualitas yang baik (Pesti, 2003). Mekanisme penghambatan secara lebih jelas dapat dilihat pada Gambar:
Seperti telah dijelaskan sebelumnya bahwa antitripsin kedelai berperan penting dalam penentuan nilai gizi protein bahan pangan melalui pengujian menggunakan hewan percobaan, namun demikian pengaruhnya terhadap manusia belum tampak jelas. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim tripsin manusia hanya sedikit dihambat oleh antitripsin kedelai dibandingkan dengan enzim tripsin yang berasal dari sapi. Pada umumnya penelitian antitripsin secara in vitro dilakukan menggunakan enzim tripsin yang berasal dari sapi, karena mudah diperoleh secara komersial. Selain itu terdapat hubungan yang erat antara terjadinya hipertrofi pankreas dan berat pankreas relatif terhadap persentasi berat tubuh. Pada spesies yang mempunyai berat pankreas > 0.3% berat tubuhnya, antitripsin akan menyebabkan pembesaran pankreas. Sedangkan apabila berat pankreas < 0.3%, tidak akan menyebabkan pembesaran pankreas. Berkaitan dengan hal tersebut, berat pankreas manusia < 0.3% barat tubuhnya, sehingga meskipun tepung kedelai mentah menyebabkan hipertrofi pankreas pada tikus, namun tidak demikian pada manusia (Clemente, 2014).
IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat disimpulkan bahwa efek dalam menggunakan zat anti nutrisi yang berasal dari biji kedelai (crude anti trypsin) terhadap perubahan aktivitas protease ikan dapat diperleh dari protein inhibitor yang merupakan senyawa penghambat kerja enzim protease yaitu enzim yang bertugas dalam penguraian protein melalui pengikatan bagian aktif dari enzim tersebut.
DAFTAR REFERENSI
Almatsier, Sunita. 2003. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: Gramedia.
Berdanier,Carolyn D. 2002. Handbook of Nutrition and Food. USA: CRC Press. Boniran, S. 1999. Quality Control Untuk Bahan Baku Dan Produk Akhir Pakan
Ternak. Kumpulan Makalah Feed Quality Management Workshop American Soybean Associationdan Balai Penelitian Ternak.
Bora, Paul. 2014. Anti-Nutritional Factor in Foods and Their Effect. Journal of Academica and Industrial Research 3(6) : 1-6.
Clemente A, Maria C. A, Marion D, Christine L S, Catherine C, Raquel O, Tracey R, Peter G. Isaac, David M. L, Abdelhafid B, Claire D. 2015. Eliminating Anti-Nutritional Plant Food Proteins: The Case of Seed Protease Inhibitors in Pea. PLOS ONE. 10: 1-24
Pesti, G.M. 2003. Comparison Of Peanut Meal And Soynean Meal As Protein Suplements For Laying Hens. Poultry Science 82: 1274-1280
Vikraman, R. J., Rafee, T, Sanjev, D. S., dan Sarveti, P. The Fuction of Antitrypsin on the Activity of Protease. Journal of Fisheries 6(7) : 148-152.
