GONADAL SEX DETERMINATION OF Chelonia mydas EMBRYO: EXPRESSION PATTERN OF Rspo1 AND Calbindin-D28K
Student: Syamsul Bahri
Doctor’s Program in Biology, School of Life Sciences and Technology, ITB email: syamsulsalihu@yahoo.com
Advisors: Dr. Sony H Sumarsono1, Dr. Anggraini Barlian2, dan Dr. Marselina I Tan3
1
School of Life Sciences and Technology ITB, email: sonyheru@sith.itb.ac.id
2
School of Life Sciences and Technology ITB, email: aang@sith.itb.ac.id
3
School of Life Sciences and Technology ITB, email: marsel@sith.itb.ac.id Degree: Doctor (Dr.), Conferred October 2010
ABSTRACT
Sex determination is a very important and fundamental process of individual’s development and influences sex ratio. Sex determination can be categorized as a primary sex determination and secondary sex determination. Primary sex determination is a determination process of gonadal sex, whereas secondary sex determination is a determination process of secondary sex characteristic. On GSD, (Genotypic Sex Determination) sex is determined by sex chromosome, and environmental factors is not involved in this process, whereas sex determination gonad on TSD (Temperature-dependent Sex Determination) animal sex is determined by temperature .
In exploring these decisive factors for sexual determination in TSD, many studies were conducted especially during the thermosensitive period. However these factors or genes have been probably active before this TSP period or in preTSP and worked in orchestra with other genes for gonadal sex determination and differentiation. Therefore, this research was designed to identify genes which might functioned in gonadal sex determination and differentiation of Chelonia mydas during preTSP. Until now, these crucial genes have not been elucidated yet.
According to the previous research, incubation temperature at 31±1°C promoted gonad of Chelonia mydas embryo to differenciate to become female gonad (FPT, Female Producing Temperature) while 26±1°C promoted the offspring to be male (MPT, Male Producing Temperature). Based on that result, in this research we incubated Chelonia mydas eggs in FPT and MPT. Embryonic stage was determined morphologically, and histological preparation of embryonic gonad from each stage was performed as well. Differential gene expression from adrenal-gonad-kidney (AGK) complex of embryonic stage 12, 14, 16 (pre TSP), 17, 19 dan 22 (TSP), incubated in FPT (31±1°C) or MPT (26±1°C) were performed using ddRT-PCR method. Furthermore cDNA fragments correlated with specific gene which have been isolated from ddRT-PCR and were analyzed further using Real Time PCR method.
Several genes which were expressed differently were found in the AGK complex during pre TSP stage. Sequences of cDNA fragments isolated from ddRT-PCR were further analyzed. Part of these cDNAs fragments have the homology with Calbindin-D28K (AF545849.1), Sox9 (EU233431.1), estrogen receptor beta (Esr2) (DQ848988.1), R-spondin1 (Rspo1) (EU914821.1), Wnt4 (EF591055.1), aromatase (AF178949.1), Sf1 (FTZ-F1) (AF033833.1), and vasa-like protein (FJ665613.1). In this research, futher verification were focused especially on the level expression of R-spondin1 (Rspo1) (EU914821.1) and Calbindin-D28K (AF545849.1).
Real-Time PCR result showed that the incubation temperature influenced mRNA level expression of both Rspo1 and Calbindin-D28K since the begining of preTSP till the end of
TSP. Differential expression of Rspo1 of adrenal-gonad-kidney complex incubated in different incubation temperature seemed to be influenced by yolk estrogen content. The higher metabolic rate of embryo incubated in FPT might also increase the estrogen yolk transportation rate. Therefore, estrogen concentration threshold could be achieved faster in gonad embryo incubated in FPT than in MPT. This condition might induce differentiation of gonad to become ovarium which might be influenced by the high expression of Rspo1.
Differential expression of Calbindin-D28K on adrenal-gonad-kidney complex that were incubated at different temperature also seemed to be influenced by estrogen as well as Rspo1, since other research showed that estrogen decreased mRNA Calbindin-D28K level. Therefore higher estrogen level of gonad from embryo incubated at FPT might decrease mRNA Calbindin-D28K level. This low Calbindin-D28K expression level seems to be influenced not only by estrogen content, but also by other gene/genes that involved during the developmental stage and could play a role in the pattern of this gene expression which is expressed differentially in this stage.
The new scientific outcome has emerged from this research, however it needs further investigation. The effect of incubation temperature on the expression of Rspo1 and Calbindin-D28K in both the mRNA and protein level and also factors or genes which regulate Rspo1 and Calbindin-D28K should be further observed.
Key words: sex determination, FPT, MPT, expression level, Rspo1, Calbindin-D28K, Chelonia mydas
DETERMINASI SEKS GONAD EMBRIO Chelonia mydas: POLA EKSPRESI GEN Rspo1 dan Calbindin-D28K
Mahasiswa: Syamsul Bahri
Program Studi Doktor Biologi SITH, email: syamsulsalihu@yahoo.com
Pembimbimg: Dr. Sony H Sumarsono1, Dr. Anggraini Barlian2, dan Dr. Marselina I Tan3
1
SITH-ITB, email: sonyheru@sith.itb.ac.id
2
SITH-ITB, email: aang@sith.itb.ac.id
3
SITH-ITB, email: marsel@sith.itb.ac.id Gelar: Doktor (Dr.), Wisuda Oktober 2010
ABSTRAK
Determinasi seks merupakan proses fundamental yang sangat penting dalam perkembangan individu karena proses ini berdampak pada pembentukan rasio seks populasi. Determinasi seks dapat dibagi menjadi determinasi seks primer untuk menentukan seks gonad, dan determinasi seks sekunder untuk menentukan ciri-ciri seks sekunder. Determinasi seks primer hewan GSD (Genotypic Sex Determination) ditentukan oleh kromosom seks dan tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan, sedangkan pada hewan TSD (Temperature-dependent Sex Determination) determinasi seks ditentukan oleh suhu inkubasi.
Gen-gen yang berperan dalam proses determinasi dan diferensiasi seks hewan GSD sebagian besar telah ditemukan homolognya pada hewan TSD. Berbeda dengan hewan GSD, pada hewan
TSD tidak ditemukan gen Sry penentu utama seks, akan tetapi nampaknya terdapat suatu faktor tertentu yang menentukan seks gonad Chelonia mydas. Meskipun gen Sry yang menjadi penentu utama seks gonad mammalia GSD tidak ditemukan pada reptil TSD tetapi rasio seks 1 jantan : 1 betina diperoleh bila telur reptil TSD diinkubasi pada suhu tertentu. Hal ini menunjukkan bahwa determinasi seks gonad hewan TSD diduga juga ditentukan oleh gen yang kemungkinan berperan seperti Sry tetapi ekspresi gen tersebut dapat dipengaruhi oleh suhu.
Penelitian–penelitian untuk mencari faktor penentu utama arah perkembangan gonad hewan TSD telah banyak dilakukan terutama pada periode termosensitif (TSP, thermosensitive period), sedangkan faktor-faktor penentu dan/ atau gen-gen tertentu pada periode TSP ini nampaknya sudah berperan sebelum periode TSP yaitu pada periode praTSP. Perbedaan faktor-faktor penentu dan atau ekspresi gen-gen pada periode pra TSP ini diduga berperan menginisiasi perbedaan ekspresi gen-gen lain yang mempengaruhi determinasi dan diferensiasi seks gonad Chelonia mydas pada tahap perkembangan gonad selanjutnya. Oleh karena itu dalam penelitian ini dilakukan identifikasi gen-gen yang diduga dapat berperan dalam determinasi dan diferensiasi seks gonad embrio Chelonia mydas pada periode pra TSP.
Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, suhu inkubasi 31±1°C dapat memicu gonad embrio Chelonia mydas menjadi gonad betina (Suhu Feminisasi, SF), sedangkan suhu inkubasi 26±1°C dapat memicu embrio Chelonia mydas menjadi individu jantan (Suhu Maskulinisasi, SM). Oleh karena itu dalam penelitian ini digunakan suhu SF dan SM untuk memastikan arah determinasi seks gonad. Tahap perkembangan embrio ditentukan secara morfologis, dan pada masing-masing tahap perkembangan embrio dibuat sayatan histologis gonad. Penelitian ini dirancang untuk mengidentifikasi determinan genetik yang berperan dalam tahap awal determinasi seks gonad hewan TSD dengan menggunakan Chelonia mydas sebagai hewan percobaan. Sebagian telur diinkubasi pada suhu 31±1°C untuk menghasilkan 100% individu betina (Suhu Feminisasi, SF), sedangkan telur lainnya diinkubasi pada suhu 26±1°C untuk menghasilkan 100% individu jantan (Suhu Maskulinisasi, SM). Pengamatan dilakukan pada level mRNA yang terekspresi sejak periode pra TSP hingga TSP akhir. Ekspresi gen spesifik kompleks adrenal-gonad-ginjal dari embrio tahap perkembangan 12, 14, 16 (pra TSP), 17, 19 dan 22 (TSP) yang diinkubasi pada suhu feminisasi (31±1°C) atau suhu maskulinisasi (26±1°C) dideteksi dengan menggunakan
metode ddRT-PCR yang dilanjutkan dengan metode RealTime PCR untuk mengkuantifikasi level ekspresi gen terpilih.
Ekspresi sejumlah gen dari kompleks adrenal-gonad-ginjal yang diinkubasi pada suhu yang berbeda ditemukan telah berbeda sejak periode pra TSP. Berdasarkan hasil analisis terhadap fragmen cDNA hasil ddRT-PCR, diperoleh beberapa gen yang diduga berperan dalam determinasi dan diferensiasi seks gonad, yaitu gen Calbindin-D28K (AF545849.1), gen Sox9 (EU233431.1), gen estrogen receptor beta (Esr2) (DQ848988.1), gen R-spondin1 (Rspo1) (EU914821.1), gen Wnt4 (EF591055.1), gen aromatase (AF178949.1), gen Sf1 (FTZ-F1) (AF033833.1), dan gen vasa-like protein (FJ665613.1). Dalam penelitian ini, verifikasi ekspresi gen lebih difokuskan untuk gen R-spondin1 (Rspo1) (EU914821.1) dan gen Calbindin-D28K (AF545849.1).
Dari hasil Real-Time PCR terlihat bahwa suhu inkubasi mempengaruhi level ekspresi mRNA Rspo1 dan Calbindin-D28K sejak periode pra TSP hingga TSP akhir. Perbedaan level ekspresi Rspo1 pada kompleks adrenal-gonad-ginjal embrio yang diinkubasi pada suhu yang berbeda diduga dipengaruhi oleh estrogen yolk. Lebih tingginya kecepatan metabolisme embrio yang diinkubasi pada SF meningkatkan kecepatan pengangkutan estrogen yolk ke dalam gonad sehingga batas ambang estrogen yang diperlukan untuk mengaktivasi jalur perkembangan ovarium lebih cepat tercapai. Kondisi ini diduga meningkatkan ekspresi gen-gen spesifik ovarium seperti Rspo1 dan menekan ekspresi gen-gen yang bekerja pada jalur perkembangan testis seperti Sf1 dan Sox9.
Perbedaan level ekspresi Calbindin-D28K pada kompleks adrenal-gonad-ginjal embrio yang diinkubasi pada suhu yang berbeda diduga terkait dengan estrogen juga, karena pada organ lain estrogen terbukti menurunkan ekspresi mRNA Calbindin-D28K secara siginifikan. Lebih tingginya kadar estrogen intragonad embrio yang diinkubasi pada SF akan lebih menekan ekspresi mRNA Calbindin-D28K. Penurunan ekspresi Calbindin-D28K tampaknya tidak hanya ditentukan oleh kadar estrogen, tetapi ekpresi gen-gen lain yang menyertai perubahan tahapan perkembangan embrio diduga ikut berperan mengatur pola ekspresi gen ini.
Hasil penelitian ini memunculkan beberapa alur baru yang membutuhkan penelitian lebih lanjut, yaitu penelitian yang berkaitan dengan pengaruh suhu inkubasi terhadap pola ekspresi Rspo1 dan Calbindin-D28K pada level mRNA dan level protein, serta mempelajari faktor-faktor lain yang mengatur ekspresi kedua gen tersebut terutama pada tahap awal perkembangan gonad hewan TSD.
