Nama : Haris
Nama : Haris Nurhidayat
Nurhidayat
NPM
NPM :
: 1306404336
1306404336
Metode Sanger
Metode Sanger
Informasi latar belakang Informasi latar belakang
Sekuensing DNA memungkinkan kita untuk melakukan analisis mendalam mengenai Sekuensing DNA memungkinkan kita untuk melakukan analisis mendalam mengenai DNA karena memberikan informasi yang paling dasar dari semua: urutan nukleotida. Dengan DNA karena memberikan informasi yang paling dasar dari semua: urutan nukleotida. Dengan pengetahuan
pengetahuan ini, ini, misalnya, misalnya, kita kita dapat dapat menemukan menemukan lokasi lokasi pengaturan pengaturan dan dan urutan urutan gen, gen, membuatmembuat perbandingan
perbandingan antara rangkaian antara rangkaian gen hogen homolog spesies molog spesies dan mengidentifikasi dan mengidentifikasi mutasi. Para mutasi. Para ilmuwanilmuwan mengakui bahwa sekuensing berpotensi menjadi alat yang sangat kuat, dan oleh karena itu mengakui bahwa sekuensing berpotensi menjadi alat yang sangat kuat, dan oleh karena itu muncul persaingan untuk menciptakan sebuah metode yang bisa menjelaskan urutan DNA. muncul persaingan untuk menciptakan sebuah metode yang bisa menjelaskan urutan DNA. Kemudian pada tahun 1974, dua metode yang secara independen dikembangkan oleh tim Kemudian pada tahun 1974, dua metode yang secara independen dikembangkan oleh tim Amerika dan tim Inggris untuk melakukan hal ini. Tim Amerika, dipimpin oleh Maxam dan Amerika dan tim Inggris untuk melakukan hal ini. Tim Amerika, dipimpin oleh Maxam dan Gilbert, menggunakan "protokol belahan dada kimia", sedangkan Tim Inggris, dipimpin oleh Gilbert, menggunakan "protokol belahan dada kimia", sedangkan Tim Inggris, dipimpin oleh Sanger, merancang prosedur yang serupa dengan proses alami replikasi DNA. Meskipun kedua Sanger, merancang prosedur yang serupa dengan proses alami replikasi DNA. Meskipun kedua tim berbagi Hadiah Nobel 1980, metode Sanger menjadi standar karena kepraktisan (Speed, tim berbagi Hadiah Nobel 1980, metode Sanger menjadi standar karena kepraktisan (Speed, 1992.
1992.
Metode Sanger, yang juga disebut sebagai sequencing (pengurutan/peruntunan) dideoksi Metode Sanger, yang juga disebut sebagai sequencing (pengurutan/peruntunan) dideoksi atau pemutusan rantai, didasarkan pada penggunaan dideoksi (ddNTP ini) selain nukleotida atau pemutusan rantai, didasarkan pada penggunaan dideoksi (ddNTP ini) selain nukleotida normal (NTP) ditemukan dalam DNA. Dideoksinukleotida pada dasarnya sama dengan normal (NTP) ditemukan dalam DNA. Dideoksinukleotida pada dasarnya sama dengan nukleotida kecuali dideoksinukleotida mengandung gugus hidrogen pada karbon 3 'bukan gugus nukleotida kecuali dideoksinukleotida mengandung gugus hidrogen pada karbon 3 'bukan gugus hidroksil (OH). Nukleotida dimodifikasi, ketika diintegrasikan ke dalam urutan, mencegah hidroksil (OH). Nukleotida dimodifikasi, ketika diintegrasikan ke dalam urutan, mencegah penambahan
penambahan nukleotida nukleotida lebih lebih lanjut. lanjut. (Speed, (Speed, 1992) 1992) .Ini .Ini terjadi terjadi karena karena ikatan ikatan fosfodiester fosfodiester tidaktidak dapat membentuk ikatan antara dideoksinukleotida dan nukleotida yang baru masuk berikutnya, dapat membentuk ikatan antara dideoksinukleotida dan nukleotida yang baru masuk berikutnya, dan dengan demikian rantai DNA diakhiri.
dan dengan demikian rantai DNA diakhiri.
Metode Metode
Sebelum DNA dapat diurutkan, DNA harus didenaturasi menjadi untai tunggal dengan Sebelum DNA dapat diurutkan, DNA harus didenaturasi menjadi untai tunggal dengan menggunakan panas. Berikutnya sebuah primer ditambahkan ke salah satu helai Template. menggunakan panas. Berikutnya sebuah primer ditambahkan ke salah satu helai Template. Primer ini secara khusus dibangun sehingga dimana ujung 3 nya terletak di sebelah urutan DNA. Primer ini secara khusus dibangun sehingga dimana ujung 3 nya terletak di sebelah urutan DNA. Baik primer atau salah satu nukleotida harus diber label radioaktif atau fluresen (berpendar) Baik primer atau salah satu nukleotida harus diber label radioaktif atau fluresen (berpendar) sehingga produk akhir dapat dideteksi pada gel (Russell, 2002). Setelah primer melekat DNA, sehingga produk akhir dapat dideteksi pada gel (Russell, 2002). Setelah primer melekat DNA, larutan ini dibagi menjadi empat tabung berlabel "G", "A", "T" dan "C". Kemudian reagen larutan ini dibagi menjadi empat tabung berlabel "G", "A", "T" dan "C". Kemudian reagen ditambahkan ke sampel ini sebagai berikut:
ditambahkan ke sampel ini sebagai berikut:
"G" tube:
"G" tube:all four dNTP's,all four dNTP's, ddGTPddGTP dan DNA polymerase dan DNA polymerase "A" tube:
"T" tube:
"T" tube:all four dNTP's,all four dNTP's, ddTTPddTTP dan DNA polymerase dan DNA polymerase "C" tube:
"C" tube:all four dNTP's,all four dNTP's, ddCTPddCTP dan DNA polymerase dan DNA polymerase
Seperti ditunjukkan di atas, semua tabung berisi ddNTP yang berbeda, dan masing-masing Seperti ditunjukkan di atas, semua tabung berisi ddNTP yang berbeda, dan masing-masing konsentrasi sekitar pada
konsentrasi sekitar pada ““one-hundrethone-hundreth”” dari prekursor normal (Russell, 2002). Selama DNA dari prekursor normal (Russell, 2002). Selama DNA
disintesis, nukleotida ditambahkan ke
disintesis, nukleotida ditambahkan ke ““rantai bertumbuh/the growing chainrantai bertumbuh/the growing chain”” dengan DNA dengan DNA
polimerase.
polimerase. Namun, Namun, pada pada saat saat sebuah sebuah dideoksinukleotida dideoksinukleotida disatukan disatukan ke ke rantai rantai di di tempattempat nukleotida normal, yang hasilnya pada peristiwa pengakhiran rantai. Sebagai contoh jika kita nukleotida normal, yang hasilnya pada peristiwa pengakhiran rantai. Sebagai contoh jika kita melihat hanya "G" tabung, kita mungkin menemukan campuran produk berikut:
melihat hanya "G" tabung, kita mungkin menemukan campuran produk berikut:
Gambar 1: Contoh kemungkinan fragmen yang bisa dihasilkan di tabung "G". Panjang semua Gambar 1: Contoh kemungkinan fragmen yang bisa dihasilkan di tabung "G". Panjang semua fragmen berbeda karena integrasi acak dari ddGTP ini (Metzenberg).
fragmen berbeda karena integrasi acak dari ddGTP ini (Metzenberg).
Kunci untuk metode ini, adalah semua reaksi dimulai dari nukleotida yang sama dan berakhir Kunci untuk metode ini, adalah semua reaksi dimulai dari nukleotida yang sama dan berakhir dengan basa tertentu. Jadi dalam larutan di mana rantai yang sama dari DNA akan disintesis lagi dengan basa tertentu. Jadi dalam larutan di mana rantai yang sama dari DNA akan disintesis lagi dan lagi, rantai baru akan berakhir pada semua posisi di mana nukleotida memiliki kemungkinan dan lagi, rantai baru akan berakhir pada semua posisi di mana nukleotida memiliki kemungkinan ditambahkan karena integrasi dideoksinukleotida (Russell, 2002). Dengan cara ini, pita - pita dari ditambahkan karena integrasi dideoksinukleotida (Russell, 2002). Dengan cara ini, pita - pita dari seluruh panjang yang berbeda dihasilkan. Setelah reaksi ini selesai, DNA sekali lagi didenaturasi seluruh panjang yang berbeda dihasilkan. Setelah reaksi ini selesai, DNA sekali lagi didenaturasi dalam persiapan untuk elektroforesis. Masing-masing isi empat tabung bergerak di jalur yang dalam persiapan untuk elektroforesis. Masing-masing isi empat tabung bergerak di jalur yang terpisah pada sebuah gel polyacrilmida untuk memisahkan pita yang berbeda ukuran satu sama terpisah pada sebuah gel polyacrilmida untuk memisahkan pita yang berbeda ukuran satu sama lain. Setelah isi sudah bergerak di gel, gel ini kemudian disinari baik sinar UVatau X-Ray, lain. Setelah isi sudah bergerak di gel, gel ini kemudian disinari baik sinar UVatau X-Ray, tergantung pada metode yang digunakan untuk pelabelan DNA.
Gambar 2: Ini
Gambar 2: Ini adalah gel polyacrilmida pada adalah gel polyacrilmida pada reaksi di tabung "G" reaksi di tabung "G" (urutan yang sama (urutan yang sama terlihatterlihat pada
pada gambar gambar 1). 1). Fragmen Fragmen DNA DNA yang yang lebih lebih panjang panjang bergerak bergerak pada pada jarak jarak pendek pendek dari dari fragmenfragmen yang lebih kecil karena massa molekulnya lebih besar. Bagian birumenunjukkan primer, bagian yang lebih kecil karena massa molekulnya lebih besar. Bagian birumenunjukkan primer, bagian hitam menunjukkan untai yang baru disintesis dan merah yang menandakan ddGTP, yang hitam menunjukkan untai yang baru disintesis dan merah yang menandakan ddGTP, yang mengahiri rantai (Metzenberg).
mengahiri rantai (Metzenberg).
Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2, fragmen lebih kecil dihasilkan ketika ddNTP ditambahkan Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2, fragmen lebih kecil dihasilkan ketika ddNTP ditambahkan lebih dekat dengan primer karena rantainya yang lebih kecil dan karena itu bermigrasi lebih lebih dekat dengan primer karena rantainya yang lebih kecil dan karena itu bermigrasi lebih cepat di seluruh gel. Jika semua reaksi dari empat tabung digabungkan pada satu gel, urutan cepat di seluruh gel. Jika semua reaksi dari empat tabung digabungkan pada satu gel, urutan DNA yang sebenarnya di arah 5 'ke 3' dapat ditentukan dengan membaca pola pita dari bagian DNA yang sebenarnya di arah 5 'ke 3' dapat ditentukan dengan membaca pola pita dari bagian bawah
bawah gel gel ke ke atas. atas. Hal Hal ini ini penting penting untuk untuk diingat diingat lebih lebih dulu dulu bahwa bahwa urutan urutan ini ini melengkapi melengkapi untaiuntai template dari awal.
template dari awal.
Gambar 3: Ini merupakan autoradiogram dari sequencing gel dideoxy. Huruf
Gambar 3: Ini merupakan autoradiogram dari sequencing gel dideoxy. Huruf – – huruf diatas jalur huruf diatas jalur
mengusulkan bahwa nukleotida dideoxy yang digunakan dalam sampel yang diwakili oleh jalur mengusulkan bahwa nukleotida dideoxy yang digunakan dalam sampel yang diwakili oleh jalur itu. Ketika Anda membaca dari bawah ke atas, Anda membaca urutan komplementer dari untai itu. Ketika Anda membaca dari bawah ke atas, Anda membaca urutan komplementer dari untai cetakan (Metzenberg).
cetakan (Metzenberg).
Automated Sequencing Automated Sequencing
Dengan banyak kemajuan dalam teknologi yang telah dicapai sejak tahun 1974, tidak Dengan banyak kemajuan dalam teknologi yang telah dicapai sejak tahun 1974, tidak mengherankan bahwa metode Sanger telah menjadi usang. Namun, teknologi baru yang telah mengherankan bahwa metode Sanger telah menjadi usang. Namun, teknologi baru yang telah muncul untuk menggantikan metode ini didasarkan pada prinsip-prinsip yang sama dengan muncul untuk menggantikan metode ini didasarkan pada prinsip-prinsip yang sama dengan
metode Sanger. Sekuensing otomatis telah dikembangkan sehingga lebih banyak DNA dapat metode Sanger. Sekuensing otomatis telah dikembangkan sehingga lebih banyak DNA dapat diurutkan dalam waktu yang lebih singkat. Dengan prosedur otomatis reaksi dilakukan dalam diurutkan dalam waktu yang lebih singkat. Dengan prosedur otomatis reaksi dilakukan dalam tabung yang berisi semua empat ddNTP, masing-masing diberi label dengan warna dye yang tabung yang berisi semua empat ddNTP, masing-masing diberi label dengan warna dye yang berbeda (Russell, 2002).
berbeda (Russell, 2002).
Gambar 4:
Gambar 4: Dalam sequensing Dalam sequensing otomatis, oligonukleotida otomatis, oligonukleotida primer primer dapat "end -labeldapat "end -labeled" denganed" dengan pewarna
pewarna yang yang berbeda, berbeda, satu satu untuk untuk setiap setiap ddNTP. ddNTP. Pewarna Pewarna ini ini berpendar berpendar pada pada panjangpanjang gelombang yang berbeda, yang dibaca melalui mesin (Metzenberg).
gelombang yang berbeda, yang dibaca melalui mesin (Metzenberg).
Seperti dalam metode Sanger, DNA dipisahkan pada gel, tapi mereka semua berjalan di jalur Seperti dalam metode Sanger, DNA dipisahkan pada gel, tapi mereka semua berjalan di jalur yang sama.
yang sama.
Gambar 5: Hasil elektroforesis gel untuk pewarna
Gambar 5: Hasil elektroforesis gel untuk pewarna berlabel DNA di sekuensing otomatis. Gambaberlabel DNA di sekuensing otomatis. Gambarr di sebelah kiri menunjukkangel tampak seperti apa jika empat reaksi dijalankan di jalur yang di sebelah kiri menunjukkangel tampak seperti apa jika empat reaksi dijalankan di jalur yang berbeda,
berbeda, yang yang bertentangan bertentangan dengan dengan gambar gambar di di sebelah sebelah kanan kanan yang yang menunjukkan menunjukkan gel gel di di manamana semua DNA yang dijalankan di satu jalur (Metzenberg).
Sejak empat pewarna berpendar pada panjang gelombang yang berbeda, laser kemudian Sejak empat pewarna berpendar pada panjang gelombang yang berbeda, laser kemudian membaca gel untuk menentukan identitas setiap pita sesuai dengan panjang gelombang di mana membaca gel untuk menentukan identitas setiap pita sesuai dengan panjang gelombang di mana berfluoresensi.
berfluoresensi. Hasilnya Hasilnya kemudian kemudian digambarkan digambarkan dalam dalam bentuk bentuk kromatogram, kromatogram, yang yang merupakanmerupakan diagram puncak berwarna yang sesuai dengan nukleotida di lokasi yang dalam urutan (Russell, diagram puncak berwarna yang sesuai dengan nukleotida di lokasi yang dalam urutan (Russell, 2002).
2002).
Gambar 6: Hasil dari urutan otomatis ditampilkan dalam bentuk kromatogram. Warna-warna Gambar 6: Hasil dari urutan otomatis ditampilkan dalam bentuk kromatogram. Warna-warna mewakili empat basa: biru C, hijau adalah A, hitam G dan merah adalah T (Metzenberg).
mewakili empat basa: biru C, hijau adalah A, hitam G dan merah adalah T (Metzenberg).
Daftar Pustaka Daftar Pustaka
Metzenberg, Stan. Sanger Method- Dideoxynucleotide Chain Termination. Metzenberg, Stan. Sanger Method- Dideoxynucleotide Chain Termination.
http://www.csun.edu/~hcbio027/biotechnology/lec3/sanger.html (4 Desember, 2015). http://www.csun.edu/~hcbio027/biotechnology/lec3/sanger.html (4 Desember, 2015). Russell, Peter. 2002. iGenetics. Pearson Education, Inc., San Francisco, pp 187-189
Russell, Peter. 2002. iGenetics. Pearson Education, Inc., San Francisco, pp 187-189 Speed, Terrence. Sanger's Method.
Speed, Terrence. Sanger's Method.
http://statwww.berkeley.edu/users/terry
http://statwww.berkeley.edu/users/terry/Classes/s260.1998/Week8b/week8b/node9.html /Classes/s260.1998/Week8b/week8b/node9.html (4(4 Desember 2015).
