EKSTRAKSI DAN UJI AKTIVITAS OPTIMUM ENZIM KITINASE PADA ACTINOMYCETES 19B19A1 MENGGUNAKAN MEDIA LIMBAH
KULIT UDANG
(Skripsi)
Oleh
Irma Fitria Ananda 1817011091
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG 2022
ABSTRAK
EKSTRAKSI DAN UJI AKTIVITAS OPTIMUM ENZIM KITINASE PADA ACTINOMYCETES 19B19A1 MENGGUNAKAN MEDIA LIMBAH
KULIT UDANG OLEH
IRMA FITRIA ANANDA
Enzim kitinase merupakan suatu enzim yang dapat mendegradasi kitin dengan cara memutus ikatan β-1,4-glikosidik pada kitin untuk menghasilkan monomer dan oligomer N-Asetilglukosamin. Actinomycetes menjadi salah satu mikroorganisme yang memiliki kemampuan kitinolitik. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh pH dan waktu optimum enzim kitinase pada Actinomycetes 19B19A1 dalam menggunakan media limbah kulit udang. Isolat Actinomycetes yang digunakan diperoleh dari deposit UPT LTSIT, Universitas Lampung, yang diisolasi dari biota laut perairan Gorontalo, Indonesia. Isolat 19B19A1 memiliki nilai indeks kitinolitik sebesar 1,26 cm. Kemudian dilakukan identifikasi morfologi isolat secara mikroskopis. Berdasarkan hasil mikroskop tersebut dapat diindikasikan bahwa isolat 19B19A1 merupakan spesies Streptomyces. Pada penelitian ini dilakukan fermentasi padat dengan menggunakan serbuk kulit udang sebagai media. Fermentasi dilakukan selama 14 hari dengan pengamatan setiap 2 hari. Aktivitas kitinase diuji menggunakan spektofotometer UV-Vis dengan metode DNS. Berdasarkan hasil analisis menggunakan spektofotometer UV-Vis diperoleh aktivitas spesifik enzim kitinase tertinggi pada waktu inkubasi hari ke- 10 sebesar 2.6426 U/mg. Kemudian ekstrak kasar enzim kitinase tersebut dilakukan pemurnian dengam menggunakan ammonium sulfat dan dialisis diperoleh hasil aktivitas spesifik sebesar 7.5080 U/mg.
Kata kunci: Actinomycetes, Enzim kitinase, Kulit udang.
ABSTRACT
EXTRACTION AND TESTING OF OPTIMUM ACTIVITY OF CHITINASE ENZYME IN ACTINOMYCETES 19B19A1 USING SHRIMP
SHELL WASTE MEDIA BY
IRMA FITRIA ANANDA
Chitinase is an enzyme that can degrade chitin by breaking the -1,4-glycosidic enzyme in chitin to produce N-Acetylglucosamine monomers and oligomers.
Actinomycetes are one of the microorganisms that have chitinolytic abilities. This study aims to obtain the optimum pH and time of chitinase in Actinomycetes 19B19A1 using shrimp shell waste media. Actinomycetes isolates used were from the UPT LTSIT deposit, University of Lampung, which were isolated from marine biota in the waters of Gorontalo, Indonesia. The 19B19A1 isolate had a chitinolytic index value of 1.26 cm. Then the morphology of the isolates was carried out microscopically. Based on the results of the microscope, it can be indicated that Isolate 19B19A1 is a Streptomyces species. In this study, solid fermentation was carried out using shrimp shell powder as a medium.
Fermentation was carried out for 14 days with observations every 2 days.
Chitinase activity was tested using a UV-Vis spectrophotometer with the DNS method. the results of the analysis using UV-Vis spectrophotometer obtained the highest specific activity of the chitinase enzyme at the incubation time based on the 10th day of 2.6426 U/mg. Then the crude extract of the chitinase enzyme was purified using ammonium sulfate and dialysis, the specific activity was 7.5080 U/mg.
Key words: Actinomycetes, Chitinase enzyme, Shrimp shell.
EKSTRAKSI DAN UJI AKTIVITAS OPTIMUM ENZIM KITINASE PADA ACTINOMYCETES 19B19A1 MENGGUNAKAN MEDIA LIMBAH KULIT
UDANG
Oleh
IRMA FITRIA ANANDA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar SARJANA SAINS
Pada Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG
2022
RIWAYAT HIDUP
Irma Fitria Ananda lahir di Merak Belantung pada 24 Juni 2000. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Bapak Ismail Marzuki dan Ibu Mirnawati.
Penulis memiliki satu adik perempuan dan satu adik laki-laki.
Penulis menyelesaikan pendidikan Taman Kanak-Kanak di TK Dharma Wanita Pasuruan tahun 2006. Penulis melanjutkan pendidikan sekolah dasar di SD Negeri 3 Pasuruan dan menyelesaikannya pada tahun 2012. Pendidikan sekolah menengah pertama diselesaikan pada tahun 2015 di SMP Negeri 1 Penengahan.
Pendidikan sekolah menengah atas diselesaikan pada tahun 2018 di SMA Negeri 1 Kalianda, dan pada tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung melalui jalur SBMPTN (Seleksi Bersama Masuk Perguruan Tinggi Negeri).
Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif mengikuti beberapa kegiatan mahasiswa di lingkungan Fakultas MIPA Unila. Penulis memulai aktivitas organisasi sebagai Amar (Anggota Muda Rois) FMIPA Unila dan Kader Muda HIMAKI FMIPA Unila tahun 2018. Penulis mengikuti kegiatan Karya Wisata Ilmiah yang diadakan oleh BEM FMIPA Unila tahun 2019. Penulis pernah menjabat sebagai anggota Bidang Sains dan Penalaran Ilmu Kimia (SPIK) HIMAKI FMIPA Unila, anggota Bidang Kajian dan Keumatan Rois FMIPA Unila pada tahun 2020, anggota Bidang Kajian dan Keumatan Rois FMIPA Unila pada tahun 2020, dan sekretaris Dinas Hubungan Luar (HUBLU) BEM FMIPA 2021. Penulis pernah menjadi asisten matakuliah praktikum Biokimia II dan matakuliah praktikum Pengantar Kimia Analisis tahun 2022. Penulis
telah menyelesaikan Praktik Kerja Lapangan (PKL) di Laboratorium UPT LTSIT Universitas Lampung, Bandar Lampung dan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Desa Pasuruan, Kabupaten Lampung Selatan pada tahun 2021.
MOTTO
Laa haula wa laa quwwata illa billah
Tiada daya dan upaya kecuali dengan kekuatan Allah (Hadist)
“Allah tidak membebani seseorang melainkan sesuai dengan kesanggupannya...” (Q.S. Al-Baqarah : 286)
“Sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan.”
(Q.S. Al-Insyirah : 8)
“...Tetapi boleh jadi kamu tidak menyenangi sesuatu, padahal itu baik bagimu, dan boleh jadi kamu menyukai sesuatu, padahal itu tidak baik
bagimu. Allah mengetahui, sedang kamu tidak mengetahui.” (Q.S. Al- Baqarah : 216)
“Jangan menunda sesuatu karena waktu tidak akan menunggumu”
(Irma Fitria Ananda)
PERSEMBAHAN
Puji syukur kepada Allah SWT yang senantiasa memberikan karunia berupa nikmat iman dan islam, serta shalawat beriring salam semoga selalu
terlimpahkan kepada murabbi terbaik Nabi Muhammad SAW.
Dengan mengharap berkah dan ridho dari Allah SWT, ku persembahkan karya ini sebagai tanda bakti, cinta, dan kasihku kepada :
Kedua orangtua tercinta (Mama dan Ayah)
Terimakasih atas segala doa, kesabaran, kasih sayang, perhatian serta semangat yang selalu diberikan, sehingga ku dapat menyelesaikan karya ini dengan baik.
Kedua adik tersayang
(Noercholis Luqman Haviz dan Indah Annisa Lestari)
Yang telah memberikan canda tawa sehingga diri ini dapat selalu semangat.
Rasa hormatku kepada :
Ibu Dra. Aspita Laila, M.S., Bapak Prof. Dr. John Hendri, M.S., dan Ibu Dr.
Nurhasanah, S.Si., M.Si.
Dosen yang telah membimbingku selama mengerjakan penelitian dan tugas akhir.
Semua Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Kimia yang telah memberikan ilmu, bimbingan serta pengalaman kepada penulis selama menempuh pendidikan.
Seluruh sahabat dan teman-temanku yang selama ini telah mengajarkan arti kebersamaan, kekeluargaan dan kebahagiaan.
Serta
Almamaterku tercinta
SANWACANA
Alhamdulillahirobbil’alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya yang tiada pernah terputus dan selalu sebagai sumber kekuatan bagi penulis, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul
“Ekstraksi dan Uji Aktivitas Optimum Enzim Kitinase Pada Actinomycetes 19B19A1 Menggunakan Media Limbah Kulit Udang” sebagai syarat untuk mendapat gelar Sarjana Sains pada Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
Penulis menyadari bahwa terselesaikannya skripsi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan teriring doa penulis mengucapkan terima kasih kepada :
1. Bapak Ismail Marzuki dan Ibu Mirnawati selaku kedua orang tua atas segala doa, kasih sayang, dukungan moral dan finansial, nasihat serta motivasi yang selalu diberikan, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Semoga Allah SWT membalas atas segala yang telah diberikan dengan Jannah-Nya, Aamiin.
2. Ibu Dra. Aspita Laila, M.S. selaku Pembimbing I atas segala ilmu, kesabaran, motivasi, bimbingan, serta saran terbaiknya sehingga
penelitian dan skripsi ini dapat terselesaikan tepat waktu. Semoga Allah SWT catat sebagai amal jariyah dan selalu melimpahkan keberkahan, kenikmatan, serta kemudahan atas segala urusan ibu.
3. Bapak Prof. John Hendri, Ph.D. selaku pembimbing II atas semua waktu, ilmu, bimbingan serta motivasi yang selalu diberikan dengan kesabaran dan keikhlasan kepada penulis selama penelitian. Semoga Allah SWT
catat sebagai amal jariyah dan melimpahkan segala nikmat dan karunia- Nya dalam kehidupan bapak.
4. Ibu Dr. Nurhasanah, S.Si., M.Si. selaku pembahas penelitian yang telah membagikan ilmu, motivasi, kritik serta saran terbaik kepada penulis sehingga skripsi ini terselesaikan dengan baik. Semoga Allah SWT selalu melimpahkan keberkahan dan karunia-Nya dalam kehidupan ibu.
5. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T. selaku pembimbing
akademik sekaligus Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Univrsitas Lampung atas segala bimbingan serta motivasinya sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan dengan tepat waktu.
6. Bapak Mulyono, Ph.D. selaku ketua Jurusan Kimia FMIPA Unila.
7. Ibu Dr. Mita Rilyanti, M.Si. selaku sekretaris Jurusan Kimia FMIPA Unila.
8. Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung atas seluruh ilmu, motivasi, dan pengalamannya yang telah diberikan kepada penulis selama menjalankan pendidikan di kampus. Semoga ilmu yang diberikan bermanfaat dan Allah SWT balas semua kebaikan bapak dan ibu dengan pahala yang berlimpah.
9. Seluruh staf administrasi dan segala pihak di lingkungan Jurusan Kimia, Dekanat FMIPA, serta Universitas Lampung yang senantiasa membantu dalam sistem akademik, perkuliahan, penelitian, serta penyusunan skripsi dapat terselesaikan dengan baik.
10. Kedua adikku tercinta, Noercholies Luqman Haviz dan Indah Annisa Lestari yang selalu memberikan bantuan,canda tawa, serta kebahagiaan.
Semoga Allah SWT senantiasa melindungi, memberkahi dan mempermudah disetiap urusan kalian berdua.
11. Keluarga besar ayah dan mama yang telah memberikan dukungan moral, finansial, serta motivasi bagi penulis selama menjalankan pendidikan di kampus.
12. Sahabat-sahabat tercinta yang telah membersamai selama proses perkuliahan, yang mengajarkan arti kebersamaan, selalu memberikan canda tawa, bertukar kritik, nasihat, serta motivasi terbaik yang diberikan kepada penulis untuk menyelesaikan pendidikan hingga akhir. Terima kasih dan maaf apabila penulis selama ini belum bisa menjadi sahabat yang terbaik bagi kalian semua :Ema, Raifar, Laras, Bhaboklang, Indra, Tania, Ikhsan. Semoga ikatan persahabatan ini tidak hanya berlangsung di dunia saja melainkan kita dapat dipersatukan kembali oleh Allah SWT menjadi keluarga di Jannah-Nya. Aamiin.
13. Kak Nafila Khansa Salsabila, S.Si selaku pembimbing di laboratorium atas segala kesabarannya dalam berbagi ilmu, pengalaman, motivasi, kritik, dan saran terbaik kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan tugas akhir ini dengan baik.
14. Keluarga besar Lampung Peduli 2019-2022 yang telah memberikan beasiswa pendidikan kepada penulis selama menyelesaikan pendidikan di kampus.
15. Keluarga besar Karya Salemba Empat (KSE) Universitas Lampung tahun 2021-2022 yang telah memberikan beasiswa pendidikan, berbagi ilmu, pengalaman, motivasi terbaik kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan tugas akhir ini.
16. Keluarga Biokimia 2018 : Raifar, Ridho, Aulia, Nurmayana. Vei, Salsabila, Bethari, Lily, Dwi, Lupia, Firda, Risna, Nafisah, Olivia, Eka, Aan, April, Cipta, Natasya yang telah membersamai, saling membantu, saling menghibur, saling bertukar cerita dan memotivasi untuk terus semangat menimba ilmu lebih dalam di peergroup yang berisi “orang- orang sabar” ini. Semoga Allah SWT meridhoi dan memberkahi usaha
kita selama merawat makhluk ciptaan-Nya yang “tidak kasat mata”
tersebut, Aamiin.
17. Keluarga “Kimia 18 B” yang telah menerima penulis dengan sifat dan sikap yang ada, yang telah membersamai dalam proses perkuliahan, saling berbagi canda tawa, keluh kesah, emosi, kritik, dan saran terbaik kepada penulis. Semoga ikatan silaturahmi ini dapat selalu terhubung hingga kita berjumpa kembali di Jannah-Nya, dan semoga slogan kelas menjadi doa agar kita dapat sukses sampai di kancah internasional, Aamiin.
18. Keluarga “Kimia 2018” yang telah menjadi salah satu keluarga di hidup penulis, yang telah membersamai dari awal hingga akhir pendidikan di kampus. Terima kasih dan maaf apabila belum bisa menjadi teman atau sahabat yang baik bagi kalian. Semoga Allah SWT memberkahi dan meridhoi kita selama menjalankan pendidikan di kampus, dann semoga kita dapat mengimplementasikan ilmu yang telah didapat dalam berbagai bidang kehidupan yang akan ditekuni selanjutnya, Aamiin.
19. Mahasiswa bimbingan Ibu Aspita dan Pak John (angkatan 2017) : Kak Saras, Kak Rana, Kak Ikrom, Kak Rizky yang telah memberikan semangat dan doa bagi penulis.
20. Keluarga besar Kimia 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, dan 2021 atas persaudaraannya selama ini.
21. Kepengurusan HIMAKI FMIPA Unila periode 2019-2020, Rois FMIPA Unila 2019-2020, BEM FMIPA Unila 2021 atas segala kebersamaan, kekeluargaan, berbagi pikiran, pengalaman, serta motivasi terbaik untuk penulis dalam meng-upgrade diri menjadi lebih baik dari sebelumnya.
22. Keluarga besar BEM FMIPA Unila 2021/2022 atas kebersamaan, kekeluargaan, serta pengalaman bagi penulis dalam berorganisasi.
Terima kasih atas segala bantuan dan dukungan seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Semoga Allah SWT membalasnya dengan nikmat dan karunia-Nya dimanapun kalian berada.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, tetapi semoga dapat bermanfaat bagi para pembaca. Aamiin ya rabbal’alamin.
Bandar Lampung, 8 Desember 2022 Penulis,
Irma Fitria Ananda
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ... xvii
DAFTAR TABEL ... xix
DAFTAR GAMBAR ... xx
I. PENDAHULUAN ... 1
A. Latar Belakang ... ………1
B. Tujuan Penelitian ... 3
C. Manfaat Penelitian ... 4
II. TINJAUAN PUSTAKA ... 5
A. Udang ... 5
B. Kitin ... 5
C. Actinomycetes ... 6
D. Enzim Kitinase ... 8
E. Deproteinasi ... 9
F. Demineralisasi ... 10
G. Spektrofotometri UV-Vis ... 11
III. METODE PENELITIAN ... 14
A. Waktu dan Tempat ... 14
B. Alat dan Bahan ... 14
C. Prosedur Penelitian ... 14
1. Persiapan Sampel Kulit Udang, Kitin, dan Koloid Kitin ... 14
2. Peremajaan Isolat Actinomycetes 19B19A1... 15
3. Identifikasi Morfologi Actinomycetes 19B19A1 ... 16
4. Uji Aktivitas Kitinolitik Actinomycetes 19B19A1 ... 17
5. Persiapan Inokulum Actinomycetes 19B19A1 ... 17
6. Persiapan Media Limbah Kulit Udang Untuk Produksi Enzim ... 17
7. Fermentasi Keadaan Padat (Solid State Fermentation) ... 18
8. Uji Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Kitinase ... 18
9. Pemurnian Enzim Kitinase ... 19
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 23
A. Sampel Kulit Udang, Kitin, dan Koloid Kitin ... 23
B. Isolat Actinomycetes 19B19A1 ... 24
C. Identifikasi Morfologi Actinomycetes 19B19A1 ... 25
D. Aktivitas Kitinolitik Actinomycetes 19B19A1 ... 26
E. Inokulum Actinomycetes 19B19A1 ... 27
F. Fermentasi Keadaan Padat (Solid State Fermentation) ... 28
G. Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Kitinase ... 28
H. Pemurnian Enzim Kitinase ... 31
a. Fraksinasi dengan Amonium Sulfat ... 31
b. Dialisis Enzim Kitinase ... 33
I. Uji Aktivitas Enzim Kitinase ... 33
V. SIMPULAN DAN SARAN ... 35
A. Simpulan ... 35
B. Saran ... 35
DAFTAR PUSTAKA ... 36
LAMPIRAN ... 43
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Data hasil ekstrak kasar enzim kitinase ... 29
2. Data Variasi pH ... 30
3. Data fraksinasi enzim kitinase hari 10 ... 32
4. Hasil Optimum Enzim Kitinase ... 34
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Struktur Kitin. ... 6
2. Tipe struktur rantai spora Actinomycetes ... 7
3. Tipe Kitinase ... 13
4. Skema prosedur penelitian ... 22
5. Koloid Kitin ... 24
6. Hasil Peremajaan Actinomycetes 19B19A1 ... 24
7. Rantai Spora ... 25
8. Zona Bening Actinomycetes 19B19A1 ... 27
9. Inokulum Actinomycetes 19B19A1... 27
10. Grafik Ekstrak Kasar Enzim Kitinase ... 30
11. Grafik Pengujian Enzim Kitinase dengan Variasi pH ... 31
12. Grafik Fraksi Optimum Pada Pemurnian Ammonium Sulfat ... 32
13. Grafik Aktivitas Spesifik Optimum……….. 34
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Indonesia adalah negara maritim atau kepulauan terbesar di dunia, dimana dua per tiga dari luas wilayah Indonesia adalah laut. Indonesia memiliki potensi sumber daya kelautan yang begitu melimpah, sehingga Indonesia ditargetkan menjadi poros maritim dunia. Sumber daya kelautan dan perikanan Indonesia diperkirakan bernilai US$ 136,5 milyar yang mencakup berbagai sektor salah satunya adalah perikanan (Susetyo et al., 2018). Udang merupakan komoditas unggulan yang memiliki peran penting di sektor perikanan. Indonesia sebagai salah satu negara eksportir utama udang dunia, juga diimbangi dengan produksi udang dari tahun ke tahun mengalami peningkatan (Fatimah et al., 2020).
Udang yang melimpah di Indonesia berdampak pada meningkatnya jumlah limbah cangkang udang. Limbah tersebut dapat menyebabkan pencemaran lingkungan terutama masalah bau yang dikeluarkan. Limbah kulit udang merupakan masalah yang perlu dicarikan upaya pemanfaatannya. Hal ini bukan saja memberikan nilai tambah pada usaha pengolahan udang akan tetapi, dapat menanggulangi masalah pencemaran lingkungan. Pada limbah kulit udang terdapat kandungan kitin yang memberikan manfaat bagi lingkungan dan dapat digunakan pada penelitian, antara lain dapat dijadikan sebagai nutrisi bagi mikroorganisme dan sebagai substrat penghasil enzim kitinase (Purkan et al., 2016).
Kitin adalah polimer yang tersusun atas monomer N-asetilglukosamin yang terikat melalui ikatan β (1-4). Kitin merupakan jenis polisakarida yang terbanyak setelah
selulosa dan senyawa penyusun kerangka hewan, seperti pada golongan anthropoda, molusca, nematoda, dan beberapa fungi (Ameilia dan Nuniek., 2017). Kitin merupakan zat unggulan untuk industri karena dapat diaplikasikan di berbagai bidang, terutama untuk keperluan medis dan lingkungan (Rosmawati et al., 2019). Kitin dapat diproduksi secara kimiawi maupun enzimatis. Keunggulan menggunakan kitin karena bahan bakunya yang mudah didapat dan memiliki dua manfaat yakni kitin dapat diproses lebih lanjut menjadi koloid kitin yang
digunakan sebagai nutrisi bagi mikroorganisme dan substrat pada produksi enzim kitinase. Namun, untuk mendegradasi kulit udang menjadi kitin, dibutuhkan bantuan mikroorganisme kitinolitik. Oleh karena itu, dalam proses hidrolisis kitin tersebut menggunakan mikroorganisme Actinomycetes (Setia dan Suharjono., 2015).
Actinomycetes merupakan mikroorganisme yang paling efisien dalam
menggunakan substrat bagi kelangsungan hidupnya. Actinomycetes dianggap sebagai sumber daya potensial karena banyak senyawa bioaktif seperti
antimikroba, antitumor, dan obat imunosupresan yang terkandung di dalamnya.
Actinomycetes merupakan sumber metabolit sekunder yang aktif secara biologis dan sumber masa depan yang menjanjikan untuk penemuan obat (Shaala et al., 2020). Actinomycetes dicirikan sebagai kelompok mikroorganisme yang paling penting di bidang bioteknologi, dimanfaatkan dalam produksi berbagai enzim.
Pada penelitian Soeka et al (2010) Actinomycetes yang berasal dari Bangka Belitung positif mempunyai aktivitas kitinase dengan nilai relatif dengan ditandai dengan adanya daerah bening disekitar isolatnya. Pada penelitian Salsabila (2020) telah diteliti Actinomycetes yang berasal dari perairan Buleleng, Bali yang
menunjukkan isolat Actinomycetes 18D36A1 dan 18D36A2 memiliki kemampuan dalam memproduksi enzim kitinase. Pada penelitian ini digunakan Actinomycetes 19B19A1 yang berasal dari perairan Gorontalo, untuk menguji aktivitas enzim kitinase. Actinomycetes 19B19A1 merupakan isolat unggul untuk mendegradasi kulit udang menjadi kitin karena memiliki aktivitas kitinolitik tinggi yang
dihasilkan dari zona hidrolisis yang besar, sehingga akan diperoleh enzim kitinase dengan aktivitas yang tinggi.
Produksi enzim kitinase dengan bantuan mikroorganisme lebih baik karena kemudahannya dalam berkembang biak dengan waktu yang relatif singkat.
Banyaknya manfaat enzim kitinase dan senyawa turunan kitin mengakibatkan meningkatnya kebutuhan enzim kitinase sehingga perlu dilakukan pengembangan produksi enzim kitinase dari sumber lokal yang melimpah di alam serta harganya yang relatif murah (Purkan et al., 2016). Untuk mendapatkan enzim kitinase perlu dilakukan ekstraksi dengan pelarut air agar diperoleh ekstrak kasar enzim dan dilakukan pemurnian untuk memperoleh enzim yang lebih murni. Pada penelitian ini akan dilakukan pengujian sebelum dimurnikan dan setelah pemurnian untuk dijadikan perbandingan. Pada produksi enzim kitinase dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya inkubasi pada waktu, pH, dan suhu tertentu. Faktor pH dan waktu inkubasi perlu dikontrol untuk mendapatkan aktivitas enzim kitinase yang optimum. Pada penelitian Sudaryati et al., (2016) melakukan penelitian tentang pemanfaatan limbah kulit udang untuk menghasilkan enzim kitinase dari
Streptomyces macrosporeus InaCC A454. Hasil dari penelitian tersebut diperoleh aktivitas kitinase optimum pada suhu 50°C pada pH 8 sebesar 0,0312 U/mL.
Terdapat pula penelitian Anggraini (2015) yang memperoleh pH optimum yaitu pH 7,0 dengan aktivitas unit sebesar 11,166 U/mL. Penelitian kali ini akan dilakukan produksi enzim kitinase pada substrat kitin limbah kulit udang oleh isolat Actinomycetes 19B19A1 dengan variasi waktu inkubasi, dan pH untuk mengetahui kondisi optimum aktivitas enzim kitinase.
B. Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah :
1. Memperoleh ekstrak kasar enzim kitinase dari limbah kulit udang hasil degradasi Actinomycetes 19B19A1.
2. Mengetahui kondisi optimum aktivitas enzim kitinase dari isolat Actinomycetes 19B19A1 terhadap pengaruh pH dan waktu inkubasi.
3. Memperoleh hasil pemurnian enzim kitinase.
C. Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memberi informasi mengenai kondisi optimum pada uji aktivitas unit enzim kitinase berdasarkan faktor pH dan waktu inkubasi menggunakan mikroba Actinomycetes 19B19A1.
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Udang
Udang merupakan jenis ikan konsumsi air payau, memiliki ruas 13 (5 ruas kepala dan 8 ruas dada) dan seluruh tubuhnya ditutupi oleh kerangka luar yang disebut eksosketelon. Udang merupakan biota laut yang tergolong kelas decapoda, karena decapoda tubuh udang dibagi menjadi tiga bagian yaitu kepala, dada dan perut. Bagian tubuh udang yang terbagi menjadi tiga bagian sehingga udang sering diproduksi pada pabrik-pabrik hanya bagian dada dan perut, bagian kepala termasuk limbah pabrik yang masih minim pemanfaatannya (Meiyani et al., 2014). Limbah yang dihasilkan pada industri pembekuan udang adalah limbah industri potensial berupa kepala dan kulit udang yang cukup besar, yakni dapat mencapai 36-49 % untuk bagian kepala, sedangkan kulit sebesar 17-23% dari keseluruhan berat badan (Purwaningsih, 2000). Udang memiliki komposisi kimia yang berbeda, hal ini menunjukkan seberapa besar kuantitas dan kualitas udang tersebut memberikan asupan gizi sesuai kebutuhan manusia. Keragaman
komposisi kimia diduga dapat disebabkan oleh faktor habitat, makanan, musim, spesies, dan umur udang (Jacoeb et al., 2008).
B. Kitin
Kitin adalah suatu biopolimer yang melimpah di alam setelah selulosa. Kitin umumnya ditemukan dalam bentuk kristal mikrofibril pada komponen struktural krustasea, serangga, sel-sel jamur dan mikroorganisme lainnya (Ray., 2013). Kitin merupakan polimer alam yang tersusun atas unit-unit molekul β-D-glukosamin dan gugus N-asetil, membentuk monomer yang akan diikat oleh ikatan beta (1, 4)
(Ameh et al., 2014). Kitin mempunyai rumus empiris (C6H9O4.NHCOCH3)n merupakan zat padat yang tidak larut dalam air, pelarut organik, alkali pekat, asam mineral lemah tetapi larut dalam asam-asam mineral yang pekat (Suryanto et al., 2005). Untuk dapat dicirikan sebagai kitin derajat asetilasinya harus berada di atas 50 % (Anitha et al., 2014). Adapun karakteristik dari kitin adalah bewarna putih, tidak larut dalam pelarut encer polar dan nonpolar, memiliki sifat biokompabilitas, biodegradabilitas, antibakteri, nontoksik, dan mempunyai bioaktivasi serta daya absorbsi yang ditentukan oleh sifat fisika dan kimianya (Zvezdova et al., 2011).
Gambar 1. Struktur Kitin (Nguyen dan Kobayasi, 2020).
C. Actinomycetes
Actinomycetes adalah bakteri gram positif berfilamen, ditandai oleh siklus hidup yang kompleks yang dimiliki oleh filum actinobacteria, jenis ini mewakili salah satu unit taksonomi terbesar di antara 18 garis keturunan utama yang saat ini dikenal dalam domain bacteria (Ventura et al., 2007). Terlihat secara morfologi, Actinomycetes berbentuk filamen-filamen seperti jamur berfilamen (filamentous fungi) yang merupakan eukariotik multiseluler, namun organisme ini memenuhi semua kriteria seperti bakteri yaitu bersel prokariotik (Magarvey et al., 2004).
Kelas Actinobacteria memiliki 6 ordo, 46 famili, dan 202 genus. Jumlah spesies yang telah ditemukan sebanyak 2.335 dan dapat terus bertambah seiring
banyaknya penelitian yang dilakukan. Streptomyces adalah genus terbesar yang memiliki lebih dari 500 jumlah spesies. Actinomycetes memiliki kandungan metabolit aktif yang lebih banyak dari mikroba lainnya, seperti antibiotik, agrokimia, enzim, imunosupresan, antiparasit, dan antikanker (Berdy, 2005).
Dinding sel Actinomycetes terdiri dari polimer gula,asam amino,dan asam gula
seperti dinding sel bakteri gram positif sedangkan dinding sel fungi terdiri dari selulosa dan kitin. Actinomycetes merupakan mikroorganisme peralihan antara jamur dan bakteri. Namun, tetap saja ada ciri khas yang cukup membatasinya menjadi satu kelompok yang jelas berbeda. Pada medium cair, pertumbuhan Actinomycetes ditandai dengan keruhnya medium dan terbentuk lapisan tipis dipermukaan medium (Anggraini, 2015).
Actinomycetes dengan miselia utama yang biasanya diproduksi dengan cara
membentuk spora aseksual. Actinomycetes memiliki berbagai macam morfologi, hal ini berdasarkan dengan ada atau tidak adanya miselium substrat atau miselium aerial, warna miselium, produksi pigmen melanoid, dan struktur rantai spora mereka. Pada Gambar 2 menunjukkan adanya perbedaan tipe struktur rantai spora Actinomycetes (Barka et al., 2016).
Gambar 2. Tipe struktur rantai spora Actinomycetes
D. Enzim Kitinase
Kitinase adalah sekelompok enzim hidrolitik yang memutus ikatan β-1,4-
glikosidik antara dua N-asetil-D-glukosamin (GlcNAc) berturut-turut dari rantai kitin (Xia et al., 2001). Enzim kitinase dapat dihasilkan oleh bakteri, fungi, tanaman, dan hewan. Bakteri memanfaatkan kitinase untuk asimilasi kitin sebagai sumber karbon dan nitrogen (Wu et al., 2005). Kitinase merupakan enzim yang mampu menghidrolisa polimer kitin menjadi kitin oligosakarida atau monomer N- asetilglukosamin. Pada jamur, kitinase berperan dalam pengaturan fisiologis saat pembelahan sel, diferensiasi, dan aktivitas mikoparasit. Selain itu, kitinase juga digunakan hewan untuk mengkonversikan kitin menjadi monomer dan
oligomernya, serta tumbuhan menggunakan kitinase untuk mendegradasi dinding sel fungi patogen (Gohel et al., 2012). Saat ini, enzim kitinase banyak digunakan sebagai agen biokontrol karena dapat mendegradasi kitin menjadi produk yang ramah lingkungan dan dapat digunakan dalam bidang kesehatan, pangan, industri, dan lain-lain (Herdyastuti et al., 2009). Enzim kitinase mampu menghidrolisa polimer kitin menjadi senyawa yang lebih sederhana dengan menghidrolisis kitin secara acak pada ikatan glikosidik. Adapun 3 sumber enzim kitinase adalah sebagai berikut :
a. Kitinase dari tanaman
Tumbuhan memiliki enzim endokitinase di batang, biji, bunga, dan umbi yang menghidrolisis secara acak internal ikatan β-1,4 dari kitin, menghasilkan produksi COS (chito-oligosakarida) dan GlcNAc. Tumbuhan yang menghasilkan kitinase (terutama dikelompokkan dalam keluarga 19 glikosil hidrolase) memainkan peran penting dalam embriogenesis, sintesis etilen, dan dalam memerangi tekanan lingkungan, yaitu dingin, kekeringan, dan konsentrasi garam tinggi (Smith dan Osburn, 2016). Kitinase dari tanaman Hippophae rhamnoides menunjukkan potensi luar biasa untuk mentoleransi tekanan abiotik, contohnya tekanan dingin (Kashyap dan Deswal, 2017).
b. Kitinase dari serangga
Kitinase pada serangga biasanya ditemukan di jaringan epitel ektodermal seperti foregut, kutikula, trakea, dan hindgut, serta dalam matriks peritrofik usus pada serangga (Lee et al., 2011). Contoh serangga penghasil kitinase yang paling banyak dipelajari adalah Mandusca sexta dan Bombyx mori (Dean et al., 2012).
c. Kitinase dari mikroorganisme
Sebagian besar kitin dari sumber mikroba telah dikelompokkan ke dalam keluarga 18 glikosil hidrolase (Bhattacharya et al., 2007). Kitinase telah ditemukan oleh para peneliti di kelompok bakteri dan kelompok jamur. Terdapat beberapa contoh dari Actinomycetes yang dilaporkan mengandung kadar kitinase yang menonjol, antara lain Thermobifida fusca (Rawway et al., 2018), Streptomyces pratensis (Gaber et al., 2016), dan Saccharothrix yanglingensis (Shivalee et al., 2018).
Kitinase terbagi menjadi 2 jenis, yaitu endokitinase dan eksokitinase : a. Endokitinase berperan dalam memecah kitin dari sisi dalam, sehingga
membentuk dimer di-asetilkitobiose dan multimer dari N-asetilglukosamin seperti kitotriose dan kitotetraose.
b. Eksokitinase terbagi menjadi 2 subkategori :
Kitobiosidase, terlibat dalam katalisis pelepasan di-asetilkitobiose (mulai dari ujung mikrofibil kitin yang tidak tereduksi) 1-4-β-glukosaminidase, terlibat dalam pembelahan produk oligomer endokitinase dan kitobiosidases, sehingga
menghasilkan monomer N-asetilglukosamin (Das et al., 2016). Penjelasan klasifikasi enzim kitinase dapat dilihat pada Gambar 2.
E. Deproteinasi
Deproteinasi merupakan proses penghilangan protein dari kitin. Secara umum proses deproteinasi dapat dilakukan dengan dua cara yaitu secara kimia dan enzimatik. Proses ini dapat dilakukan dengan dua metode yaitu secara kimia terutama dengan menggunakan larutan alkali seperti NaOH atau KOH dan secara enzimatik menggunakan enzim proteolitik. Deproteinasi secara kimiawi adalah
proses penghilangan protein dari sampel dengan memakai bahan kimia, pada proses ini menggunakan larutan alkali dengan konsentrasi rendah seperti NaOH 20% dan KOH 20%. Larutan alkali yang digunakan dalam proses deproteinasi harus dengan konsentrasi rendah dibawah 40% karena jika digunakan konsentrasi di atas 40% maka kulit udang akan mengalami deasetilasi sebagian (Hendri et al., 2007).
F. Demineralisasi
Demineralisasi merupakan proses penghilangan mineral dari sampel. Proses demineralisasi dapat dilakukan dengan larutan asam klorida (HCl) dan larutan ethylen diamin tetra asetat (EDTA). Mineral utama yang terkandung dalam sampel umumnya adalah kalsium fosfat (Ca3(PO4)2), kalsium karbonat (CaCO3) dan magnesium karbonat (MgCO3). Proses demineralisasi ini biasanya
menggunakan larutan asam klorida (HCl) 1,25 N (Hendri et al., 2007).
Kandungan mineral yang besar dalam cangkang dapat menyebabkan kecilnya daya serap apabila dimanfaatkan lebih lanjut (Ameilia dan Nuniek., 2017). Pada cangkang udang, pigmen karoten berikatan dengan protein dan lemak. Pada saat deproteinasi terjadi penghilangan protein pada suhu tinggi, sehingga ikatan pigmen yang bebas protein mendominasi menjadi warna pink bercampur kuning.
Setelah melalui proses demineralisasi, pigmen tidak berkurang hanya mengalami sedikit perubahan warna pink yang sebelumnya dominan menjadi kuning. Hal ini dikarenakan pigmen karotenoid kurang stabil dalam pH rendah maupun larutan asam (Sikorski, 2007). Pada proses demineralisasi menggunakan HCl dengan reaksi sebagai berikut:
CaCO3(s) + 2HCl(l) CaCl2(l) + H2O(l) CO2(g)
Konsentrasi kalsium karbonat akan mengalami pengurangan setiap waktu selama proses berlangsung, karena kalsium karbonat bereaksi dengan HCl membentuk garam klorida. Semakin lama waktu reaksi berlangsung semakin berkurang
konsentrasi kalsium karbonat pada kitin yang dihasilkan. Konsentrasi kalsium karbonat berkurang karena beraksi dengan HCl (Afriani et al., 2017).
G. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur nilai
absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu objek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan di serap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang di serap sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet
(Sastrohamidjojo, 2007). Spektrofotometri banyak dipakai untuk analisis kuantitatif daripada kualitatif karena melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis spektrum UV-Vis digunakan sebagai dasar pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer yang dinyatakan dalam persamaan sebagai berikut :
A = a . b . c Keterangan :
A : absorban
a : absorpsivitas molar b : tebal kuvet (cm) c : konsentrasi 20
H. Ekstraksi
Ekstraksi merupakan suatu proses pemisahan kandungan senyawa kimia dari jaringan tumbuhan ataupun hewan dengan menggunakan pelarut tertentu. Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi zat aktif dengan
menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian, hingga memenuhi baku yang ditetapkan (Mukhriani, 2014). Pada fase ekstraksi, mula- mula terjadi pembengkakan dinding sel dan pelonggaran kerangka selulosa dinding sel sehingga pori-pori dinding sel menjadi melebar yang menyebabkan pelarut dapat dengan mudah masuk kedalam sel. Bahan isi sel kemudian terlarut ke dalam pelarut sesuai dengan tingkat kelarutannya lalu berdifusi keluar akibat adanya gaya yang ditimbulkan karena perbedaan konsentrasi bahan terlarut yang terdapat di dalam dan di luar sel. Ekstraksi padat cair merupakan salah satu metode pemisahan cair - padatan. Pada proses ini, komponen yang tidak larut dipisahkan dari bahan padatan dengan bantuan solvent. Ketika solvent dicampur dengan sampel, maka solvent akan melarutkan ekstrak dengan difusi sampai terjadi keseimbangan konsentrasi (Prayudho et al., 2015).
Gambar 3. Tipe Kitinase (Das et al., 2016)
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada bulan April 2022 sampai dengan September 2022 di Laboratorium Biopolimer jurusan kimia, fakultas MIPA dan Unit Pelaksana Teknis Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi (UPT LTSIT) Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan yaitu alat-alat gelas (gelas beaker, erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur),cawan petri, kapas, kasa, karet gelang, kaca preparat, cover glass, tisu, pinset, jarum ose, lampu spirtus,mikropipet,neraca analitik, oven, hot plate, laminar air flow, inkubator, shaker inkubator, autoclave Tomy SX-700, sentrifius Hitachi CF 16RX II, mikroskop Zeiss axio A1, dan spektrofotometer UV-Vis.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu limbah kulit udang yang diperoleh dari Gudang lelang Teluk Betung, Bandar Lampung, aquades, bubuk agar, air laut buatan, HCl, metanol, NaOH, buffer fosfat, Na(K) tartrat, Dinitrosalicylic Acid (DNS).
C. Prosedur Penelitian
1. Persiapan Sampel Kulit Udang, Kitin, dan Koloid Kitin
Pada tahapan persiapan sampel kulit udang, limbah kulit udang yang diperoleh dari gudang lelang, Teluk Betung, Bandar Lampung, selanjutnya dikumpulkan untuk bahan baku. Kemudian dilakukan pengupasan kulit udang lalu dibersihkan dengan air dan dikeringkan di dalam oven pada suhu 60°C. Kemudian kulit udang tersebut diblender yang akan digunakan sebagai bahan baku substrat.
Pada tahapan pembuatan kitin dilakukan proses awal adalah demineralisasi yang ditambahkan HCl 1,25 N dengan perbandingan 1 : 10, dipanaskan 2 jam pada suhu 80°C, disaring, dan dinetralkan hingga pH 7. Setelah pH 7 disaring dan diletakkan di oven pada suhu 60°C. Proses ini dilakukan untuk menghilangkan mineral yang ada pada kulit udang tersebut. Selanjutnya,residu ditambahkan NaOH 3,5% dengan perbandingan yang sama (1 : 10), 28 gram diperoleh dari hasil demineralisasi sehingga dilakukan penambahan 280 mL NaOH lalu di stirrer selama 2 jam dengan suhu 60°C, kemudian dilakukan penetralan dengan aquades sampa pH netral. Lalu kitin disaring dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 60°C. Hasil dari deproteinasi tersebut berupa serbuk yang merupakan kitin.
Selanjutnya adalah tahapan pembuatan koloid kitin sebagai substrat. Koloid kitin dibuat dengan merujuk pada Saima dan Roohi (2013). Kitin yang dihasilkan dari deproteinasi sebanyak 18 gram, lalu ditambahkan HCl pekat dengan perbandingan 1:10, sehingga HCl yang digunakan 180 mL. Kemudian distirer selama 2 jam, ditambahkan aquades 2 L, diaduk, dan didiamkan hingga terbentuk suspensi.
Selanjutnya ditambahkan aquades hingga pH menjadi netral dan disaring.
Endapan yang terbentuk merupakan koloid kitin. Selanjutnya diautoklaf pada 121°C selama 15 menit, dan disimpan pada freezer agar tahan hingga beberapa minggu. Koloid kitin tersebut selanjutnya akan digunakan sebagai nutrisi pada tahap peremajaan Actinomycetes 19B19A1.
2. Peremajaan Isolat Actinomycetes 19B19A1
Isolat yang digunakan adalah Actinomycetes 19B19A1 yang diperoleh dari perairan Gorontalo koleksi laboratorium UPT LTSIT Unila, yang diambil secara
acak pada perairan terbatas dengan teknik scuba diving pada kedalaman 10 - 25 m. Peremajaan isolat dilakukan pada media agar koloid kitin. Pembuatan media agar menggunakan tahapan dari Saima dan Roohi (2013) dengan beberapa modifikasi. Media agar koloid kitin terbuat dari 2% koloid kitin (b/v) , dan 2%
agar yang dilarutkan dalam air laut buatan. Proses perlakuan air laut buatan yakni 400 gram garam ditambahkan ke dalam 5 liter air lalu diukur dengan alat salinitas sampai 30 PPT. Kemudian disaring menggunakan kapas dan kertas saring untuk menghilangkan kotoran. Setelah itu, campuran koloid kitin, agar, dan air laut buatan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada 1 atm, 121°C. Isolat Actinomycetes 19B19A1 digoreskan pada media agar koloid kitin pada cawan petri tersebut.
Tahapan selanjutnya adalah peremajaan isolat pada media agar miring. Tahapan ini dilakukan untuk memelihara isolat Actinomycetes 19B19A1 agar tetap hidup dan dapat digunakan kembali pada kegiatan selanjutnya. Peremajaan isolat dilakukan sama seperti penapisan Actinomycetes 19B19A1 pada media agar koloid kitin, namun tahapan ini dilakukan pada tabung reaksi yakni media agar miring.
3. Identifikasi Morfologi Actinomycetes 19B19A1
Tahapan ini merujuk pada Singh et al (2014) menggunakan metode cover slip culture. Metode tersebut dilakukan dengan cara menggoreskan strain di atas media agar lalu ditancapkan cover glass dengan kemiringan 45° di daerah goresan. Setelah isolat tumbuh, dilakukan identifikasi berdasarkan pertumbuhan hari ke 7 dan hari ke 14. Pengamatan secara makroskopi dilakukan terhadap warna pertumbuhan, tekstur, dan pigmen, sedangkan struktur Actinomycetes diamati secara mikroskopi berupa jenis spora merujuk pada Li et al., (2016) menggunakan mikroskop Axio Zeiss A1.
4. Uji Aktivitas Kitinolitik Actinomycetes 19B19A1
Uji aktivitas kitinolitik Actinomycetes dilakukan dengan penampakan zona bening pada media agar koloid kitin yang terbuat dari 2% koloid kitin (b/v) , dan 2%
agar yang dilarutkan dalam air laut buatan. Lalu, kedua media disterilisasi menggunakan autoklaf pada 121°C selama 15 menit. Kemudian, strain Actinomycetes 19B19A1 diinokulasikan pada media agar koloid kitin dan diinkubasi selama 14 hari dalam inkubator hingga terlihat zona bening.
5. Persiapan Inokulum Actinomycetes 19B19A1
Persiapan inokulum Actinomycetes 19B19A1 dilakukan dengan mengambil dan memisahkan spora kultur Actinomycetes 19B19A1 yang telah ditumbuhkan pada media agar koloid kitin selama 14 hari. Kemudian, spora kultur diinokulasikan ke dalam labu erlenmeyer yang berisi 0,2 gram koloid kitin dan 20 mL air laut buatan yang telah disterilisasi sebelumnya. Kemudian diinkubasi selama 14 hari dan diamati pertumbuhannya. Selanjutnya, labu erlenmeyer diletakkan pada shaker inkubator dengan kecepatan 175 rpm selama 14 hari pada suhu 25oC.
6. Persiapan Media Limbah Kulit Udang Untuk Produksi Enzim Limbah kulit udang yang diperoleh dari Gudang Lelang, Teluk Betung
dibersihkan, dan dicuci menggunakan air keran untuk menghilangkan bahan yang tidak diinginkan seperti partikel tanah dan pasir. Lalu dikeringkan semalaman pada oven dengan suhu 60°C. Kemudian digiling menggunakan blender listrik hingga berbentuk serbuk lalu dikumpulkan, dan disimpan di tempat kering pada suhu kamar dalam wadah kedap udara untuk dilanjutkan pada tahap fermentasi keadaan padat (solid state fermentation) tanpa perlakuan demineralisasi atau deproteinisasi (Suresh et al., 2012).
7. Fermentasi Keadaan Padat (Solid State Fermentation)
Pada tahapan ini dilakukan variasi pH 6,7,8 dan waktu selama 14 hari. Produksi kitinase dilakukan pada tabung yang terisi 20 gram serbuk limbah kulit udang kering sebagai media produksi. Kemudian, ditambahkan 20 mL buffer fosfat pH 7 sebagai tahap awal dalam penentuan pH optimum. Kemudian disterilisasi pada 1 atm selama 15 menit. Selanjutnya media diinokulasi dengan 20 ml suspensi Actinomycetes 19B19A1 pada media limbah kulit udang yang telah halus tersebut dan dishaker 175 rpm lalu diinkubasi pada temperatur ruang. Pada proses ini, dilakukan variasi waktu inkubasi selama 14 hari dan diisolasi per-2 hari dengan tahapan menurut Suresh (2012). Pada variasi waktu dilakukan untuk mengetahui waktu optimum agar memperoleh aktivitas terbaik enzim kitinase. Setelah
diperoleh waktu optimum pada pH 7, tahapan selanjutnya yakni memvariasikan pH 6 dan 8 dengan perlakuan yang sama seperti pH 7. Setelah itu, akan
dilanjutkan ke tahap pengujian aktivitas ekstrak kasar enzim kitinase.
8. Uji Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Kitinase
Hasil dari tahapan fermentasi dilanjutkan ke tahap ekstraksi, merujuk pada Indrawati et al., (2019) yakni media kulit udang yang telah diinkubasi selama 14 hari selanjutnya akan diisolasi per-2 hari, kemudian ditambahkan 100 mL aquades dan dihomogenkan dengan shaker pada kecepatan 175 rpm selama 2 jam.
Ekstraksi dilakukan menggunakan pelarut aquades untuk membantu pelepasan enzim dari media padat. Setelah itu, ekstraksi enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi pada 7.000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4°C. Supernatan kemudian disaring dengan kertas saring dan filtrat yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar enzim. Setelah itu, dilakukan uji aktivitas enzim dengan metode Mandels menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
Uji aktivitas enzim dilakukan dengan merujuk pada Vahed et al (2013). Pada uji ativitas enzim yakni filtrat (1 mL) dan substrat (1 mL koloid kitin 1%) diinkubasi terlebih dahulu pada suhu 40°C selama 30 menit sebelum ditambahkan reagen
DNS (2 mL). Kontrol tiap sampel dibuat dengan tidak ditambahkan enzim . Larutan standar glukosamin dengan variasi konsentrasi digunakan sebagai standar. Satu unit aktivitas kitinase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk melepaskan 1 µmol glukosamin dalam satu menit.
Pada uji kadar protein dilakukan dengan direaksikan 400 µl filtrat dengan 2 mL reagen bradford, lalu diukur absorbansi pada panjang gelombang 595 nm. Uji ini digunakan juga larutan BSA dengan variasi konsentrasi sebagai standar.
9. Pemurnian Enzim Kitinase
Pada tahapan ini dilakukan pemurnian setelah didapatkan waktu dan pH optimum dari proses sebelumnya. Ekstrak kasar enzim yang telah diperoleh, dilakukan proses pemurnian dengan metode fraksinasi dengan ammonium sulfat dan dialisis sebagai berikut :
a. Fraksinasi Kitinase dengan Amonium Sulfat
Pada tahap fraksinasi ini merujuk pada Gangwar et al., (2016). Ammonium sulfat ditambahkan kedalam ekstrak kasar enzim sambil diaduk dengan magnetic stirrer dengan kecepatan lambat sampai padatan ammonium sulfat larut sempurna.
Tingkat kejenuhan ammonium sulfat 0-20% dikelompokkan menjadi fraksi 1 (F1), 20-40% fraksi 2 (F2), 40-60% fraksi 3 (F3), 60-80% fraksi 4 (F4) dan 80- 100% fraksi 5 (F5). Selanjutnya campuran disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Hasil sentrifugasi akan diperoleh endapan yang terpisah dari filtratnya. Endapan diambil dan disuspensikan dengan bufer fosfat pH 7 dengan konsentrasi 0,1 M. Filtrat yang diperoleh kemudian dilanjutkan dengan perlakuan yang sama untuk fraksi berikutnya.
b. Dialisis Enzim Kitinase
Proses dialisis merujuk pada Gangwar et al., (2016) dilakukan dengan memasukkan masing-masing fraksi yang terbaik sebanyak 10 mL kedalam
membran selofan dan merendamnya dalam bufer fosfat pH 7 konsentrasi 0,01 M dan diaduk dengan magnetic stirrer pada suhu dingin. Kemudian, buffer fosfat diganti tiap empat jam sekali. Tahap dialisis dilakukan selama 24 jam. Setelah itu, dilakukan pengujian aktivitas enzim kitinase dengan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis. Pengukuran dilakukan dengan tahapan yang sama seperti pada pengujian ekstrak kasar enzim kitinase.
Skema prosedur penelitian yang dilakukan dapat dilihat pada Gambar 4.
Limbah kulit udang -Demineralisasi -Deproteinasi
Koloid Kitin
-ditambahkan koloid kitin 2% , agar 2% dan 125 mL air laut
-diautoklaf
-dituangkan pada cawan petri dan tabung reaksi -digoreskan Actinomycetes 19B19A1
Hasil peremajaan Hasil zona bening Actinomycetes 19B19A1 Actinomycetes 19B19A1
-diidentifikasi menggunakan mikroskop -dilakukan inokulasi Actinomycetes 19B19A1
-diinkubasi selama 14 hari
Hasil inokulum Actinomycetes 19B19A1
-ditambahkan pada media limbah kulit udang
-dilakukan variasi pH 6,7,8
-dilakukan variasi waktu 2,4,6,8,10,12,14
Hasil fermentasi Actinomycetes 19B19A1 pada media limbah kulit udang
-diekstraksi dengan pelarut air
Ekstrak kasar enzim kitinase
-diuji dengan spektrofotometer UV-Vis -dimurnikan dengan fraksinasi ammonium sulfat
-dialisis
-diukur dengan Spektrofotometer Uv-vis
Hasil
Gambar 4. Skema prosedur penelitian
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Dari hasil penelitian dan pembahasan yang telah dilakukan dapat disimpulkan sebagai berikut:
1. Aktivitas unit enzim kitinase sebelum pemurnian, yaitu 0.0544 U/mL, kadar protein enzim kitinase yaitu 0,0205 mg/mL, dan aktivitas spesifik enzim kitinase yaitu 2,6426 U/mg.
2. Enzim kitinase optimum pada hari ke 10 dengan pH 7.
3. Aktivitas unit enzim kitinase setelah pemurnian yaitu 0,0809 U/mL, kadar protein sebesar 0,0107 mg/mL, dan aktivitas spesifik enzim kitinase yaitu 7,5080 U/mg.
4. Hasil aktivitas total enzim kitinase sebelum pemurnian adalah 5,4400 U, hasil persentase yakni 100%, dan kemurnian sebesar 1 kali.
5. Hasil aktivitas total enzim kitinase setelah pemurnian sebesar 1,2135 U, hasil persentase yakni 22,3069%, dan kemurnian sebesar 2,8411 kali.
B. Saran
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, maka disarankan untuk penelitian selanjutnya dapat menggunakan metode pemurnian kromatografi penukar ion, kromatografi penyaringan molekul, kromatografi afinitas, ataupun amobilisasi terhadap enzim kitinase.
DAFTAR PUSTAKA
Abu bakar, H., Wahyudi, A. T., dan Yuhana, M. 2011. Skrining Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp. Sebagai Penghasil Senyawa
Antimikroba. Ilmu Kelautan. Jakarta.
Afriani, Y., Ahmad, F., Drastinawati. 2017. Kinetika Reaksi Demineralisasi Pada Isolasi Kitin Dari Limbah Ebi. Jurnal FTEKNIK. 4 (2): 3.
Ameilia, A., dan Nuniek, H. 2017. Kitin Dari Cangkang Rajungan Yang Diperoleh Secara Enzimatik Pada Tahap Deproteinasi. UNESA Journal of Chemistry. 6(2):82.
Anggraini, W. (2015). Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Kitinase dari Isolat Actinomycetes dengan Metode Somogyi-Nelson. Jurnal Ilmiah Pendidikan Fisika Al-Biruni. 4(2): 219–230.
Bhattacharya, D., Nagpure, A., and Gupta, R.K. 2007. Bacterial chitinase:
properties and potential. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1) : 21-28.
Berdy, J. 2005. Bioactive microbial metabolites a personal view. Journal Antibiotics. 58:1-26.
Das, S., Roy, D., and Sen, R. 2016. Utilization of Chitinaceous Wastes for the Production of Chitinase. Adv Food Nutrition Research. 78: 27-46.
Dean, R., Van, J.A., Pretorius, Z.A., Hammond-Kosack, K.E., Pietro, A., Spanu, P.D., Rudd, J.J., Dickman, M., Kahmann, R., and Ellis, J. 2012. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant Pathol. 13: 414- 430.
Fatimah, S. S., Marwanti, S., dan Supardi, S. 2020. Kinerja Ekspor Udang Indonesia Di Amerika Serikat Tahun 2009-2017: Pendekatan Model Constant Market Share (Cms). Jurnal Sosial Ekonomi Kelautan Dan Perikanan. 1(1):57.
Funkhouser, J., Aronson, N. 2007. Chitinase family GH18: Evolutionary
Insights From The Genomic History Of A Diverse Protein Family. BMC Evol Biol. 7: 96-111.
Gaber, Y., Mekasha, S., Vaaje-Kolstad, G., Eijsink, V.G., and Fraaije, M.W.
2016. Characterization Of A Chitinase From The Cellulolytic Actinomycetes Thermobifida Fusca. Biochim Biophys Acta (BBA) Proteins Proteom. 1864 : 1253-1259.
Gangwar, M., Singh, V., Pandey.A.K., Tripathi, C.K.M., and Mishra, B.N. 2016.
Purification and Characterization Of Chitinase From Streptomyces violascens NRRL B2700. Indian Journal of Experimental Biology. 54:64-71.
Gohel, S. D., and Singh, S.P. 2012. Purification Strategies, Characteristics and Thermodynamic Analysis Of A Highly Thermostable Alkaline Protease From A Salttolerant Alkaliphilic Actinomycetes, Nocardiopsis Alba OK-5. Journal Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 889:61-68.
Goodfellow, M., Kampfer, P., Busse, H.J., Trujillo, M.E., Suzuki, K.I., Ludwig, W., and Whitman, W.B. 2011. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2nd Edition Volume 5. Springer. New York.
Hendri, J., Wardana., Laila, A., Ginting, I. S. 2007. Penentuan Kadar Ca Dan Mg Pada Hasil Demineralisasi Optimum Kulit Udang Windu Gravimetri Dan Spektroskopi Serapan Atom. Jurnal Sains MIPA.13 (2).
Herdyastuti, N., Raharjo, T.J., Mudasir, dan Matsjeh, S. 2009. Chitinase and Chitinolytic Mikroorganism: Isolation, Characterization and Potential.
Journal Chem. 9:1 (37-47).
Kashyap, P., and Deswal, R. 2017. A Novel Class I Chitinase From Hippophae Rhamnoides: Indications For Participating In Ice-CBF Cold Stress Signaling Pathway. Plant Sci. 259:62-70.
Lee, C.G., Silva, C.A., Dela Cruz, C.S., Ahangari, F., Ma, B., Kang, M.J., He, C.H., Takyar, S., and Elias, J.A. 2011. Role Of Chitin and Chitinase-Like Proteins In Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Rev. Physiol.
73:479-501.
Li, Q., Chen, X., Jiang, Y., and Jiang, C. 2016. Morphological Identification of Actinobacteria. Review. Chapter 3.
Madigan, M.T., Martiko, J.M., and Parker, J. 2003. Biology of Microorganisms.
Tenth Edition. Pearson Education, Inc. USA.
Magarvey, N.A., Keller, J.M., Bernan, V., Dworkin, M., and Sherman, D.H. 2004.
Isolation and Characterization Of Novel Marine-Derived Actinomycetetaxa Rich In Bioactive Metabolite. Environ Microbiol. 70 (12) : 7520-7529.
Matsumoto, K.S. 2006. Fungal Chitinases In Guevara-Gonzales R.G and Torres- Pacheco I (Eds) Advences in Agricultural and Food Biotechnology. Research Signpost. India. 289-304.
Meiyani, D.N.T., Putut H.R., April, D.A. 2014. Pemanfaatan Air Rebusan Kepala Udang Putih (Penaeus Merguiensis) Sebagai Flavor Dalam Bentuk Bubuk Dengan Penambahan Maltodekstrin. Jurnal Pengolahan dan Bioteknologi Hasil Perikanan. 3(2).
Mukhriani. 2014. Ekstraksi Pemisahan Senyawa dan Identifikasi Senyawa Aktif.
Jurnal Kesehatan. Volume VII No. 2.
Nguyen, K. D., and Kobayashi, T. 2020. Chitin Hydrogels Prepared at Various Lithium Chloride N -Dimethylacetamide Solutions by Water Vapor-Induced Phase Inversion. Journal of Chemistry.
Nofiani, R., Nurbetty, S., dan Sapar, A. 2009. Aktifitas Antimikroba Ekstrak Metanol Bakteri Berasosiasi Spons Dari Pulau Lemukutan Kalimantan Barat. Universitas Tanjung Pura. Pontianak.
Prayudho, A.N., Okky, N., Setyadi, Antaresti. 2015. Koefisien Transfer Massa Kurkumin Dari Temulawak. Jurnal Ilmiah Widya Teknik. 14:1.
Pujiati., Ardhi, W., dan Prasetyo, E.N. 2018. Produksi Purifikasi Enzim Selulase Dari Kapang Trichoderma viride dan Potensinya Dalam Bioscouring. Media Grafika. Jawa Timur.
Purkan, P., Afaf, B., dan Arju, R.S. 2016. Produksi Enzim Kitinase Dari Aspergillus niger Menggunakan Limbah Cangkang Rajungan Sebagai Induser. Journal Kimia Riset. 1 (1): 34-41.
Purwaningsih, S. 2000. Teknologi Pembekuan Udang. Penebar Swadaya. Jakarta.
Rachmawati, S.K. 2022. Waktu Inkubasi Optimum Actinomycetes Isolat 19B19A1 (Streptomyces Tritolerans) Pada Media Serbuk Kulit Udang.
Skripsi. Universitas Lampung.
Rawway, M., Beltagy, E.A., Abdul-Raouf, U.M., Elshenawy, M.A., and Kelany, M.S. 2018. Optimization Of Process Parameters For Chitinase Production By A Marine Aspergillus flavus MK20. Journal Ecol. Health Environ. 6 : 1- 8.
Ray, S. S. 2013. Evironmentally friendly polymer nanocomposites. Composite Science and Technology. Woodhead Publishing Limited. Elsevier.
Rosmawati, A., Barlah, R., and Arie, S. 2019. Biorecovery Of Chitin From Shrimp Shell Waste (Litopenaeus vanamme) Using Fermentation and Co- Fermentation Of L.plantarum and B.thuringiensis. Journal Materials Science and Engineering. 1-4.
Saima, M.K., and Roohi, I.Z.A. 2013. Isolation Of Novel Chitinolytic Bacteria and Production Optimization Of Extracellular Chitinase. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 11: 39-46.
Salsabila, N. K. 2020. Penapisan Actinomycetes yang Berasosiasi dengan Spons Sebagai Sumber Enzim Kitinase Menggunakan Media Limbah Kulit Udang.
Skripsi. Universitas Lampung.
Sastrohamidjojo, H. 2007. Spektroskopi. Liberty. Yogyakarta.
Shaala, L.A., Diaa T.A., Torki A.A., and Sameh S.E. 2020. Antimicrobial Chlorinated 3-Phenylpropanoic Acid Derivatives from the Red Sea Marine Actinomycetes Streptomyces coelicolor LY001. Marine Drug. 18(9): 450.
Shivalee, A., Lingappa, K., and Mahesh, D. 2018. Influence Of Bioprocess Variables On The Production Of Extracellular Chitinase Under Submerged Fermentation By Streptomyces pratensis Strain KLSL55. Journal Genet.
Eng. Biotechnol. In press.
Sikorski, E.Z. 2007. Chemical and Functional Properties Of Food Components 3rd Edition. CRC Press. United States of America.
Singh, L. S., Sharma, H., and Talukdar, N. C. 2014. Production Of Potent Antimicrobial Agent By Actinomycetes, Streptomyces sannanensis Strain SU118 Isolated From Phoomdi In Loktak Lake of Manipur, India. BMC Microbiology. 14(1): 1–13.
Smith, R.S., and Osburn, R.M. 2016. Combined Used of
LipoChitooligosaccharides and Chitinous Compounds For Enhanced Plant Growth and Yield. U.S. Patent 9,253,989.
Sudaryati, Y., and Triana, E. 2016. Pemanfaatan Limbah Kulit Udang Untuk Menghasilkan Enzim Kitinase Dari Streptomyces macrosporeus InaCC A454. Mikrobiologi. 91–101.
Suresh, P. V. 2012. Biodegradation Of Shrimp Processing Bio-Waste and
Concomitant Production Of Chitinase Enzyme and N-acetyl-D-glucosamine By marine bacteria: production and process Optimization. World Journal Microbiol Biotechnol. 28 : 2945-2962.
Susetyo, Y. A., Saian, P. O. N., dan Somya, R. 2018. Pembangunan Sistem Informasi Zona Potensi Sumber Daya Kelautan Kabupaten Gunungkidul Berbasis HMVC Menggunakan Google Maps API dan JSON. Indonesian Journal of Computing and Modeling. 2: 101-107.
Taylor, M., Rada, R., Steger, D., and Wagner, M. 2007. Spongeassociated Microorganisms: Evolution, Ecology, and Biotechnological Potential.
Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71(2): 295-347.
Vahed, M., Motalebi, E., Rigi, G., Noghabi, K. A., Soudi, M. R., Sadeghi, M., and Ahmadian, G. 2013. Improving The Chitinolytic Activity Of Bacillus
pumilus SG2 By Random Mutagenesis. Journal of Microbiology and Biotechnology. 23(11): 1519–1528.
Ventura, M., Canchaya C., Tauch, A., Chandra, G., Fitzgerald, G.F., Chater, K.F., and Van Slinderen, D. 2007. Genomics Of Antibacteria: Tracing The
Evolutionary History Of An Ancient Phylum. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 71:
495-548.
Xia, G., Jin, C., Zhou, J., Yang, S., Zhang, S., and Jin, C. 2001. A Novel Chitinase Having A Unique Mode Of Action From Aspergillus YJ-407. European Journal of Biochemistry. 268:4079-4085.
Wu. Y., Munir, H., and Reza Fassihi. 2005. Development Of A Simple Analytical Methodology For Determination Of Glukosamin Release From Modified Release Matrix Tablets. Article in Journal Of Pharmaceutical And Biomedical Analysis.
Zvesdova, D., Velyana, G., and Lyubomir, V. 2011. Non-isothermal kinetics of Degradation OD Chitin and Chitosan. University Of Ruse. Bulgaria.
