ABSTRAK
PENETAPAN WAKTU INKUBASI OPTIMUM DEGRADASI KITIN OLEH KITINASE DARI Actinomycetes ANL-4 SECARA
SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis
Oleh
Putri Heriyani Utami
ABSTRACT
DETERMINATION OF OPTIMUM INCUBATION TIME OF CHITIN DEGRADATION BY CHITINASE FROM Actinomycetes ANL-4 USING
SPECTROFOTOMETRY UV-Vis
By
Putri Heriyani Utami
PENETAPAN WAKTU INKUBASI OPTIMUM DEGRADASI KITIN OLEH KITINASE DARI Actinomycetes ANL-4 SECARA
SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis
Oleh
Putri Heriyani Utami
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS
Pada
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG
SPEKTROFOTOMITRI tIV' Vrs
Nama Mahasiswa
:
Fufi't%et@lqftffifi
Nomor Pokok Mahasiswa
:
1017011064Kimia
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
MEI{YETUJTII 1. Komisi Pembimbing Pembimbing
I
NrP 19600909 198811 2 001
Pembimbing
II
NrP 19581021 198703
I
0012. Ketua Jurusan Kimia
:
Dra.Aspita Laila, M.S.Sekretaris
:
Prof. Dr. John Hendri, M.S.Penguji
Bukan Pembimbing
:
Dr. Rinawati, M.Si.Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
3
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandar Lampung pada tanggal 06 Oktober 1992, sebagai anak pertama dari tiga bersaudara, putri dari Heriyadi dan Dwi Haryani.
Jenjang pendidikan diawali dari Sekolah Dasar di SD Negeri 1 Beringin Raya diselesaikan pada tahun 2004. Sekolah Menengah Pertama di SMP Negeri 2 Bandar Lampung diselesaikan pada tahun 2007, dan Sekolah Menengah Atas di SMTI Tanjung Karang diselesaikan pada tahun 2010. Tahun 2007, penulis terdaftar sebagai Mahasiswa Jurusan Kimia FMIPA Unila melalui jalur UML (Ujian Masuk Lokal).
Tumbuhkan Semangat Api Dalam Jiwa Disetiap Langkahmu !
(Putri Heriyani Utami)
Musuh yang paling berbahaya di dunia ini adalah penakut dan bimbang.
Teman yang paling setia hanyalah keberanian dan keyakinan yang
teguh.
(Andrew Jackson)
Mengusahakan sesuatu adalah jauh lebih baik dari pada tidak
melakukan apa apa, walau ada kalanya yang diusahakan itu gagal,
namun dari suatu kegagalan akan terbentuklah kemahiran
(Mutuiara Amaly)
Ada pelangi setelah turunnya hujan, ada bunga-bunga bermekaran
setelah turunnya hujan, ada sinar mentari yang hangat setelah
turunnya hujan. Karena sesungguhnya badai pasti berlalu, dan hikmah
Jadikanlah sabar dan salat sebagai penolongmu. Dan
sesungguhnya yang demikian itu sungguh berat, kecuali bagi
orang-orang yang khusyu (QS. Al-Baqarah : 45)
H s u
w ’
w
“Cu u
A
kami dan Allah adalah sebaik-baik pelindung
(QS. Al Imran: 173)
Ilmu tidak dapat diraih dengan mengistirahatkan badan
(bermalas-malasan) (HR Muslim)
Bila kerabatmu jahat terhadapmu, berbuat baiklah selalu kepadanya,
maka Allah senantiasa menolongmu (HR Bukhari)
Kupersembahkan karya kecilku ini sebagai tanda bakti
dan rasa tanggung jawabku
Kepada
Allah SWT
Ayah dan Ibuku yang senantiasa mencurahkan kasih
sayang serta doa dan dukungannya kepadaku. Tanpa
mereka aku bukan apa-apa.
Adik-adikku Abriani dan Ahmad Genaro yang
senantiasa memberikan keceriaan, dukungan, dan
motivasinya untukku.
Teman-teman terbaikku yang telah bersama-sama
berjuang menggapai impian
Guru-guruku yang terus memberikan dorongan dan
bimbingannya kepadaku
SANWACANA
Assalamu’alaikum Wr. Wb.
Alhamdulillah Puji dan syukur Penulis ucapkan kehadirat Allah SWT, atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul :
PENETAPAN WAKTU INKUBASI OPTIMUM DEGRADASI KITIN OLEH KITINASE DARI Actinomycetes ANL-4 SECARA
SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis
Dalam pelaksanaan dan penulisan skripsi ini tidak lepas dari kesulitan dan rintangan, namun itu semua dapat penulis lalui berkat rahmat dan ridha Allah SWT serta bantuan dan dorongan semangat dari orang-orang terkasih yang hadir dikehidupan penulis. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih setulus-tulusnya kepada :
memberikan banyak waktunya untuk membimbing penulis dengan sabar, memberikan banyak ilmu pengetahuan, saran, arahan, dukungan moral dan moril, serta motivasi untuk penulis. Terimakasih untuk perhatiannya yang telah dicurahkan kepada penulis sehingga sebagai pembimbing kedua, juga seperti orang tua kedua bagi penulis.
3. Dr. Rinawati, M.Si. selaku pembahas yang telah memberikan banyak ilmu pengetahuan, saran, dan arahannya dalam menyelesaikan skripsi ini.
4. Sonny Widiarto, S.Si., M.Sc. sebagai pembimbing akademik yang telah memberikan banyak ilmu pengetahuan serta dukungannya kepada penulis. 5. Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono selaku ketua jurusan Kimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung yang telah memberikan banyak arahan, saran, serta dukungannya kepada penulis selama ini.
6. Andi Setiawan, Ph. D selaku Manager Puncak baru di laboratorium Biomassa Universitas Lampung, yang telah memberikan banyak ilmu pengetahuan, saran, dan arahannya selama penulis melakukan penelitian di laboratorium Biomassa Universitas Lampung.
7. Prof. Dr. Suharso, Ph. D. Selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
8. Special thanks to Mr. Michael for all knowledge, motivation, advice, and guidance that had been given for writer during research in Biomass
saran, arahan, dan bantuannya selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium Biomassa Universitas Lampung.
10. Mbak Nora, Pak Ghani, Mas Nomo, Mbak Liza, dan seluruh dosen, laboran, serta staf di Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung.
11. Ayahku Heriyadi, ucapan selamatku kepada ayahanda tercinta yang berhasil mewujudkan impiannya menjadi anggota DPRD Kota Bandar Lampung. Terimakasih ayah untuk seluruh kasih sayang yang diberikan kepada anakmu, perjuangan dan usahamu dalam menafkahi keluarga dan menjadi kepala keluarga yang baik, semoga Allah SWT memberikan pahala yang melimpah untuk ayahanda.
12. Ibuku tercinta Dwi Haryani yang tak terhitung dan tak terhingga memberikan kasih sayang, dukungan, nasihat, motivasi, rasa aman dan kesetiaannya sebagai seorang ibu. Semoga Allah SWT selalu melindungi ibu.
13. Adik-adikku Abriani dan Ahmad Genaro yang senantiasa berbagi keceriaan, dukungan, semangat dan motivasnya, Gusti sayang kalian.
14. Datuk Djafar Aziz, Nenek Nuraini (Alm), Atu Herni, Yayik Yunus Payakun yang telah mencurahkan kasih sayang yang sangat besar dan banyak nasihat bagi penulis hingga saat ini.
Pipo, Siti Aisyah, Annisa Salsabila, Tika, Mbak Rahma, dan Mbak Yani, yang senentiasa berbagi keceriaan, dukungan, arahan, dan motivasinya selama ini.
17. Chintia Yolanda sebagai sahabat yang baik, partner kerja yang hebat dan sabar, yang senantiasa memberikan saran, dukungan, motivasi, keceriaan dan kehangatannya selama ini. Doaku untuk kesuksesanmu.
18. Sahabat-sahabat terbaikku, Widya Afriliani, S. Si., Fauziyyah Mu’min Shiddiq, S. Si., Rina Rachmawati S., S. Si., Lailatul Hasanah, Indah Aprianti, yang senantiasa berbagi semangat juang, keceriaan, kebersamaan, perhatian, dan motivasinya. Doaku untuk kesuksesan kalian semua.
19. Teman-teman sepermainan Chintya Gustianda, Sevina Silvi, S. Si., M. Nurul Fajri, Ely Setiawati, Funda Elysia, S. Si., Leni Astuti, S. Si.., Wynda Dwi Anggraini, S. Si., yang senantiasa berbagi dukungan, keceriaan, dan kebersamaannya.
20. Teman-Teman angkatan 2010, Rahmat Kurniawan, Desi Merianti, Agung Suprianto, Marta Selvina G., Rini Handayani R. P., Fajria Faiza, Syifa Kusuma W., Adetia Fatmawati, Silvana Maya P., Putri Sari D., M. Prasetio Ersa, Ariyanti, Juni Z., Rani Anggraini, Nurobiah, Ruli Prayetno, Kristi A., Purniawati, Faradilla S., Lolita Navatilopa A. K., Surtini, dan Maria atas bantuannya kepada penulis selama ini.
Yuliandari, S. Si., dan Yahya Arianta, S. Si., atas bimbingan, saran, dan bantuannya kepada penulis selama melakukan penelitian.
23. Sahabat baik di masa SMP hingga kini, titah eka dan mila, atas dukungan, motivasi, kekeluargaan, dan kebersamaannya selama ini.
24. Teman-teman KKN 2013, M. Rudi Yanto, Rudyansyah P., S. Si., Ria Nuliyatini, S. Si., Sakina Aziz, Sri Bulan Roma Intan, S., Damayanti, Rezki Ika P., Fikram, dan Dwi Setiawan, atas kesempatannya dalam kebersamaan dan kekeluargaan.
25. Keluarga Besar Panaragan Tulang Bawang Barat, Bapak, Ibu, Pakcik, Bikcik, Fadil, Ses Zubay, Adin Dedi Priyono, S. H., Aying Nopriyadi, S.Kom., Rudiyanto, Yunda Ruri, Derry, dll., atas kebersamaan, kekeluargaan, keceriaan dan kehangatan yang sempat dirasakan selama satu bulan tinggal disana.
26. Teman-teman kimia angkatan 2009, 2011, 2012, dan 2013 atas dukungan dan kerjasamanya selama ini.
27. Semua pihak yang telah banyak memberikan bantuan kepada penulis namun tidak dapat dituliskan satu-persatu.
Bandar Lampung, 22 Agustus 2014 Penulis
SANWACANA
Assalamu’alaikum Wr. Wb.
Alhamdulillah Puji dan syukur Penulis ucapkan kehadirat Allah SWT, atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul :
PENETAPAN WAKTU INKUBASI OPTIMUM DEGRADASI KITIN OLEH KITINASE DARI Actinomycetes ANL-4 SECARA
SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis
Dalam pelaksanaan dan penulisan skripsi ini tidak lepas dari kesulitan dan rintangan, namun itu semua dapat penulis lalui berkat rahmat dan ridha Allah SWT serta bantuan dan dorongan semangat dari orang-orang terkasih yang hadir dikehidupan penulis. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih setulus-tulusnya kepada :
memberikan banyak waktunya untuk membimbing penulis dengan sabar, memberikan banyak ilmu pengetahuan, saran, arahan, dukungan moral dan moril, serta motivasi untuk penulis. Terimakasih untuk perhatiannya yang telah dicurahkan kepada penulis sehingga sebagai pembimbing kedua, juga seperti orang tua kedua bagi penulis.
3. Dr. Rinawati, M.Si. selaku pembahas yang telah memberikan banyak ilmu pengetahuan, saran, dan arahannya dalam menyelesaikan skripsi ini.
4. Sonny Widiarto, S.Si., M.Sc. sebagai pembimbing akademik yang telah memberikan banyak ilmu pengetahuan serta dukungannya kepada penulis. 5. Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono selaku ketua jurusan Kimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung yang telah memberikan banyak arahan, saran, serta dukungannya kepada penulis selama ini.
6. Andi Setiawan, Ph. D selaku Manager Puncak baru di laboratorium Biomassa Universitas Lampung, yang telah memberikan banyak ilmu pengetahuan, saran, dan arahannya selama penulis melakukan penelitian di laboratorium Biomassa Universitas Lampung.
7. Prof. Dr. Suharso, Ph. D. Selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
8. Special thanks to Mr. Michael for all knowledge, motivation, advice, and guidance that had been given for writer during research in Biomass
saran, arahan, dan bantuannya selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium Biomassa Universitas Lampung.
10. Mbak Nora, Pak Ghani, Mas Nomo, Mbak Liza, dan seluruh dosen, laboran, serta staf di Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung.
11. Ayahku Heriyadi, ucapan selamatku kepada ayahanda tercinta yang berhasil mewujudkan impiannya menjadi anggota DPRD Kota Bandar Lampung. Terimakasih ayah untuk seluruh kasih sayang yang diberikan kepada anakmu, perjuangan dan usahamu dalam menafkahi keluarga dan menjadi kepala keluarga yang baik, semoga Allah SWT memberikan pahala yang melimpah untuk ayahanda.
12. Ibuku tercinta Dwi Haryani yang tak terhitung dan tak terhingga memberikan kasih sayang, dukungan, nasihat, motivasi, rasa aman dan kesetiaannya sebagai seorang ibu. Semoga Allah SWT selalu melindungi ibu.
13. Adik-adikku Abriani dan Ahmad Genaro yang senantiasa berbagi keceriaan, dukungan, semangat dan motivasnya, Gusti sayang kalian.
14. Datuk Djafar Aziz, Nenek Nuraini (Alm), Atu Herni, Yayik Yunus Payakun yang telah mencurahkan kasih sayang yang sangat besar dan banyak nasihat bagi penulis hingga saat ini.
Pipo, Siti Aisyah, Annisa Salsabila, Tika, Mbak Rahma, dan Mbak Yani, yang senentiasa berbagi keceriaan, dukungan, arahan, dan motivasinya selama ini.
17. Chintia Yolanda sebagai sahabat yang baik, partner kerja yang hebat dan sabar, yang senantiasa memberikan saran, dukungan, motivasi, keceriaan dan kehangatannya selama ini. Doaku untuk kesuksesanmu.
18. Sahabat-sahabat terbaikku, Widya Afriliani, S. Si., Fauziyyah Mu’min Shiddiq, S. Si., Rina Rachmawati S., S. Si., Lailatul Hasanah, Indah Aprianti, yang senantiasa berbagi semangat juang, keceriaan, kebersamaan, perhatian, dan motivasinya. Doaku untuk kesuksesan kalian semua.
19. Teman-teman sepermainan Chintya Gustianda, Sevina Silvi, S. Si., M. Nurul Fajri, Ely Setiawati, Funda Elysia, S. Si., Leni Astuti, S. Si.., Wynda Dwi Anggraini, S. Si., yang senantiasa berbagi dukungan, keceriaan, dan kebersamaannya.
20. Teman-Teman angkatan 2010, Rahmat Kurniawan, Desi Merianti, Agung Suprianto, Marta Selvina G., Rini Handayani R. P., Fajria Faiza, Syifa Kusuma W., Adetia Fatmawati, Silvana Maya P., Putri Sari D., M. Prasetio Ersa, Ariyanti, Juni Z., Rani Anggraini, Nurobiah, Ruli Prayetno, Kristi A., Purniawati, Faradilla S., Lolita Navatilopa A. K., Surtini, dan Maria atas bantuannya kepada penulis selama ini.
Yuliandari, S. Si., dan Yahya Arianta, S. Si., atas bimbingan, saran, dan bantuannya kepada penulis selama melakukan penelitian.
23. Sahabat baik di masa SMP hingga kini, titah eka dan mila, atas dukungan, motivasi, kekeluargaan, dan kebersamaannya selama ini.
24. Teman-teman KKN 2013, M. Rudi Yanto, Rudyansyah P., S. Si., Ria Nuliyatini, S. Si., Sakina Aziz, Sri Bulan Roma Intan, S., Damayanti, Rezki Ika P., Fikram, dan Dwi Setiawan, atas kesempatannya dalam kebersamaan dan kekeluargaan.
25. Keluarga Besar Panaragan Tulang Bawang Barat, Bapak, Ibu, Pakcik, Bikcik, Fadil, Ses Zubay, Adin Dedi Priyono, S. H., Aying Nopriyadi, S.Kom., Rudiyanto, Yunda Ruri, Derry, dll., atas kebersamaan, kekeluargaan, keceriaan dan kehangatan yang sempat dirasakan selama satu bulan tinggal disana.
26. Teman-teman kimia angkatan 2009, 2011, 2012, dan 2013 atas dukungan dan kerjasamanya selama ini.
27. Semua pihak yang telah banyak memberikan bantuan kepada penulis namun tidak dapat dituliskan satu-persatu.
Bandar Lampung, 22 Agustus 2014 Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ... iv
DAFTAR TABEL... .. vi
I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang... ... 1
B. Tujuan Penelitian ... 3
C. Manfaat Penelitian ... 4
II.TINJAUAN PUSTAKA A.Kitin ... 5
B.Kitosan ... 6
C.Ekstraksi Kitin ... 8
1. Deproteinasi ... 8
2. Demineralisasi ... 9
D. Enzim ... 9
1. Mekanisme kerja enzim ... 10
2. Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim ... 11
E. Kitinase ... 12
F. Actinomycetes ... 15
G. Kitooligosakarida ... 17
H. N-asetilglukosamin………. ... 18
I. Glukosamin……… ... 19
J. Fermentasi………... 20
K. Fermentasi Cair Sistem Tertutup (Batch)……….. ... 21
1. Tahapan Proses Fermentasi Batch……… ... 22
2. Aplikasi Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch).... ... 23
L. Fourier Transform Infrared (FTIR)... 24
M. Spektrofotometri UV-Vis……… 26
1. Komponen-komponen dalam Spektrofotometer UV-Vis…… 27
2. Pemilihan Pelarut... 28
3. Analisis Senyawa Turunan Kitin/ Kitosan... 29
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat... 33
B. Alat dan Bahan ... 33
C. Prosedur Penelitian ... 34
1. Pembuatan Kitin ... 34
a. Persiapan Sampel Kulit Udang……… ... 34
b. Deproteinasi……….. ... 35
c. Demineralisasi……… ... 35
2. Karakterisasi Kitin dengan FTIR……… ... 36
3. Pembuatan Media……… ... 36
a. Media ISP-2……….. ... 36
b. Larutan Mineral Garam Actinomycetes ANL-4……... 36
4. Pertumbuhan Actinomycetes ANL-4……….. ... 37
5. Persiapan Inokulum………. ... 37
6. Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch)…………... 37
7. Analisis Glukosamin Secara Spektrofotometri UV-Vis... ... 38
a. Pembuatan Larutan Standar PTH (fenil tiourea)... .. 39
b. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ... 39
c. Kalibrasi Glukosamin Sampel... 40
8. Analisis Kemurnian Glukosamin dengan HPLC... 40
a. Pembuatan Larutan Standar Glukosamin... 40
b. Pemeriksaan Sampel Glukosamin Hasil Fermentasi... 40
IV. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN A. Isolasi Kitin... 42
1. Deproteinasi... 42
2. Demineralisasi... 43
B. Karakterisasi Kitin dengan Spektroskopi FTIR... 44
C. Peremajaan Actinomycetes ANL-4... 46
D. Penetapan Waktu Inkubasi Optimum... 47
1. Fermentasi Cair Sistem Tertutup (Batch Fermentation)... 47
2. Penentuan Kadar Glukosamin dalam Rendemen Hasil Fermentasi Secara Spektrofotometri UV-Vis... 50
3. Analisis Kemurnian Glukosamin dengan HPLC-ELSD... 57
V. SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan... 62
B. Saran... 63
DAFTAR PUSTAKA ... 64
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Pelarut-pelarut untuk daerah ultraviolet dan cahaya tampak ... 29 2. Persentase rendemen glukosamin dalam substrat kitin awal... 77 3. Hasil pengukuran absorbansi larutan standar fenil tiourea (PTH)... 78 4. Hasil pengukuran absorbansi rendemen hasil fermentasi... 78 5. Konsentrasi sebenarnya glukosamin dalam rendemen hasil
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Struktur Kitin ... 5 2. Struktur Kitosan……… ... 7 3. Reaksi pemutusan ikatan β-1,4 pada bagian internal mikrofibril kitin…. 13
4. Reaksi pembebasan unit-unit diasetilkitobiose oleh enzim eksokitinase.. 13
5. Reaksi pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose dan kitotetraose dan
menghasilkan monomer-monomer GIcNAc……….. 14
6. Struktur N-asetilglukosamin……….. 19
7. Struktur glukosamin………... 19
8. Skema komponen-komponen spektrofotometri UV-Vis...…………. 27
9. Diagram Blok Sistem Kromatografi Cair... 31
10. Kitin hasil isolasi... 44 11. Spektrum kitin standar dan spektrum kitin hasil isolasi... 45 12. Struktur Kitin dengan Posisi Nomor Atom... 46
13. Kurva persentase rendemen hasil fermentasi terhadap lamanya waktu
inkubasi kitin dengan Actinomycetes ANL-4... 49 14. Reaksi antara glukosamin dengan fenil isotiosianat menghasilkan
senyawa derivat fenil tiourea... 51
15. Hasil scanning panjang gelombang maksimum (A) fenil isotiosianat (PITC), (B) larutan glukosamin-PITC (PTH),
dan (C) larutan glukosamin... 52
16. Kurva kalibrasi larutan standar senyawa PTH... 53
17. Hubungan waktu inkubasi (hari) dengan persentase bobot
rendemen hasil fermentasi (% b/b) dan kadar Glc sebenarnya dalam
rendemen (% b/b)... . 56
18. Kromatogram HPLC-ELSD glukosamin standar (A), glukosamin hasil fermentasi kitin dengan Actinomycetes ANL-4 hari ke 5 (2000 mg/L) (B) dan hari ke 15 (1000 mg/L) (C)... 58 19. Reaksi pemutusan ikatan glikosidik rantai kitin oleh enzim
endikitinase dari Actinomycetes ANL-4 menjadi
monomer-monomernya... 60
20. Reaksi pemutusan ikatan glikosidik pada rantai kitin oleh enzim eksokitinase dan pemutusan gugus asetamida oleh enzim deasetilase dari Actinomycetes ANL-4 secara serempak menghasilkan dimer
21. Reaksi pemutusan ikatan glikosidik pada rantai kitin oleh enzim endokitinase dan pemutusan gugus asetamida oleh enzim deasetilase dari Actinomycetes ANL-4 menjadi monomer-monomer
glukosamin... 61
22. Skema Penelitian... 73
23. Filtrat deproteinasi sebelum dan sesudah diuji dengan CuSO4... 74
24. Filtrat demineralisasi sebelum dan sesuash diuji dengan (NH4)2C2O4... 74
25. Isolat Actinomycetes ANL-4... 74
26. Hasil mikroskopik isolat Actinomycetes ANL-4 2014... 75
27. Hasil mikroskopik isolat Actinomycetes ANL-4 2010... 75
28. Media fermentasi Actinomycetes ANL-4... 75
29. Rendemen glukosamin hasil fermentasi kitin dengan
I. PENDAHULUAN
A.Latar Belakang
Kitin, suatu polimer tak larut yang tersusun dari residu β
-1,4-N-asetil-D-glukosamin (GlcNAc), merupakan polisakarida paling melimpah dan terbarukan di bumi setelah selulosa (Stevens, 2005). Kitin hanya dapat larut dalam beberapa pelarut organik. Rendahnya kelarutan kitin ini merupakan faktor yang membatasi aplikasi dan investigasi sifat dan strukturnya (Dutta et al., 2009). Bagaimanapun, beberapa strategi telah dikembangkan untuk mengubah kitin menjadi oligomer kecil yang larut (kitooligomer), yang lebih berguna untuk diaplikasikan dalam obat-obatan, pertanian, dan industri (Stevens, 2005).
Enzim kitinase dapat berfungsi dalam degradasi kitin menjadi oligomer hingga dimernya (Patil et al., 2000). Kitinase menurut Shakhbazau and Kartel (2008) dibagi menjadi tiga tipe antara lain endokitinase, eksokitinase, dan β-1,4-N-asetil glukosamidase. Endokitinase merupakan jalur yang memotong secara acak ikatan β-1,4 bagian internal kitin dengan produk akhir oligomer pendek N-asetil
teratur (tidak secara acak). Enzim ini sering juga disebut kitobiosidase. Sedangkan β-1,4-N-asetil glukosaminidase merupakan enzim yang memotong kitin menjadi monomernya, yaitu N-asetilglukosamin.
Salah satu mikroorganisme penghasil enzim kitinase adalah Actinomycetes. Actinomycetes memiliki aktivitas biologis dan sporanya sangat esensial untuk biokonversi. Mikroorganisme ini sangat efisien dalam menggunakan substrat bagi kelangsungan hidupnya. Substrat kitin mudah dihidrolisis oleh Actinomycetes menjadi karbohidrat yang lebih sederhana (N-asetilglukosamin) dengan bantuan fermentasi (Samsuri et al., 2003).
Produksi enzim melalui proses fermentasi memiliki beberapa keunggulan, diantaranya adalah substrat yang digunakan dapat disesuaikan dengan
mikroorganisme, sehingga biaya produksi lebih murah. Jumlah produksi juga dapat ditingkatkan dengan optimasi kondisi fermentasi dan perbaikan strain (Ton et al., 2010).
Produksi enzim kitinase juga berkaitan dengan kemampuan bakteri dalam mendegradasi kitin. Degradasi kitin oleh bakteri bergantung pada faktor lingkungan seperti pH, suhu, konsentrasi kitin, dan waktu inkubasi. Selain itu kitin termasuk senyawa yang sulit untuk didegradasi, sehingga bakteri
Pada penelitian sebelumnya, Yuliandari (2013) melakukan uji pengaruh penambahan media inokulum dan media kitin dalam proses fermentasi kitin menggunakan Actinomycetes ANL-4. Proses fermentasi ini berlangsung selama 45 hari dan glukosamin yang dihasilkan adalah 99% dari 10 gram berat kitin awal. Hal ini menunjukkan bahwa proses produksi glukosamin melalui fermentasi kitin memerlukan waktu yang cukup lama dan belum diketahui secara pasti kapan glukosamin terbentuk dengan jumlah maksimum dalam rentang waktu fermentasi 45 hari tersebut.
Oleh karena itu, penelitian ini perlu dilakukan untuk menetapkan waktu inkubasi optimum degradasi kitin oleh kitinase yang dihasilkan dari bakteri Actinomycetes ANL-4, berdasarkan pada jumlah glukosamin yang diproduksi pada tiap selang waktu 5 hari proses fermentasi . Glukosamin direaksikan dengan fenil isotiosianat (PITC) untuk membentuk derivat fenil tiourea (PTH) yang kemudian dapat diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Konsentrasi glukosamin dalam rendemen hasil fermentasi diperoleh dengan mengkalibrasi hasil
pengukuran absorbansi ke dalam kurva standar. Metode ini dipilih karena lebih mudah, sensitif, akurat, dan tepat (Gadgoli, 2006).
B.Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut:
2. Menetapkan waktu inkubasi optimum bagi enzim kitinase yang dihasilkan oleh isolat Actinomycetes ANL-4 dalam mendegradasi kitin selama 45 hari waktu fermentasi.
3. Menentukan kemurnian glukosamin yang diperoleh menggunakan HPLC-ELSD.
C.Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang:
1. Mengetahui kadar glukosamin dalam rendemen hasil fermentasi dan substrat kitin setiap selang waktu 5 hari.
2. Memperoleh waktu inkubasi optimum enzim kitinase dari ANL-4 untuk menghasilkan glukosamin dalam jumlah optimum dengan waktu yang relatif lebih singkat.
I. TINJAUAN PUSTAKA
A.Kitin
Kitin merupakan suatu polimer linier yang sebagian besar tersusun dari unit-unit β-(1→4)-2-asetamida-2-deoksi-β-D-glukopiranosa dan sebagian dari β-(1→4) -2-amino-2-deoksi-β-D-glukopiranosa (Kumirska et al., 2010). Kitin terdistribusi luas di lingkungan biosfer seperti pada kulit crustacea (kepiting, udang, dan lobster), ubur-ubur, komponen struktur eksternal insekta, dinding sel fungi (22-40%), alga, nematoda ataupun tumbuhan (Gohel et al., 2004). Rantai kitin antara satu dengan yang lainnya berasosiasi melalui ikatan hidrogen yang sangat kuat antara gugus N-H dari satu rantai dengan gugus C=O dari rantai lain yang berdekatan. Ikatan hidrogen ini menyebabkan kitin tidak larut dalam air dan membentuk serabut (fibril) (Suryanto dan Yurnaliza, 2005).
Kitin berbentuk padatan amorf atau kristal, berwarna putih, dan dapat terurai secara hayati (biodegradable). Kitin bersifat tidak larut dalam air, asam anorganik encer, asam organik, alkali pekat dan pelarut organik tetapi larut dalam asam pekat seperti asam sulfat, asam nitrit, asam fosfat, dan asam format anhidrat. Kitin dalam asam pekat dapat terdegradasi menjadi monomernya dan memutuskan gugus asetil (Einbu, 2007). Ketika derajat N-asetilasi (didefinisikan sebagai rata-rata jumlah unit N-asetil-D-glukosamin per 100 monomer yang dituliskan sebagai persentase) kurang dari 50%, maka kitin dapat larut dalam larutan asam dan kemudian disebut kitosan (Pillai et al., 2009).
B. Kitosan
Kitosan merupakan suatu heteropolimer dari residu N-asetil-glukosamin dan D-glukosamin yang dapat diperoleh dari kitin melalui proses deasetilasi sebagian. Nama kitosan berkaitan dengan rangkaian kesatuan polimer turunan kitin yang dapat digambarkan dan dikelompokkan berdasarkan fraksi residu N-asetil (FA) atau derajat N-asetilasi (DA), derajat polimerisasi (DP) atau bobot molekul dan pola N-asetilasi (PA) (Aam et al., 2010).
Kitosan merupakan biomolekul non toksik dengan LD50 setara dengan 16 g/kg BB
Kitosan tidak beracun dan mudah terbiodegradasi. Kitosan tidak larut dalam air, dalam larutan basa kuat, dalam H2SO4, dan dalam beberapa pelarut organik
[image:31.595.136.489.244.317.2]seperti alkohol dan aseton. Kitosan sedikit larut dalam asam klorida dan asam nitrat serta larut baik dalam asam lemah seperti asam formiat dan asam asetat (Sugita et al., 2009). Struktur kitosan dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Struktur Kitosan (Murray et al., 2003)
C. Ekstraksi Kitin
Kulit udang mengandung protein (25-40 %), kalsium karbonat (45-50%), dan kitin (15-20%), namun besarnya kandungan tersebut bergantung pada jenis udangnya (Foucher et al., 2009). Ekstraksi kitin dari kulit udang dilakukan
melalui dua tahapan proses yaitu penyisihan protein (deproteinasi) dan penyisihan kalsium karbonat (demineralisasi) (Mahmoud et al., 2007). Kedua tahapan proses dalam ekstraksi kitin tersebut dapat dilakukan secara kimia maupun biologi (Beaney et al., 2005).
1. Deproteinasi
Protein yang terikat secara fisik dalam kulit udang dapat dihilangkan dengan perlakuan fisik seperti pengecilan ukuran dan pencucian dengan air. Adapun protein yang terikat secara kovalen dapat dihilangkan dengan perlakuan kimia yaitu pelarutan dalam larutan basa kuat atau dengan perlakuan biologis
2. Demineralisasi
Kulit udang mengandung mineral 30-35% (berat kering), komposisi yang utama adalah kalsium karbonat. Komponen mineral ini dapat dilarutkan dengan penambahan asam seperti asam klorida, asam sulfat, atau asam laktat
(Synowiecki and Al-Khateeb, 2003). Demineralisasi optimum dapat diperoleh dengan ekstraksi menggunakan HCl 1,0 M yang diinkubasi pada suhu 75oC selama 1 jam (Bahariah, 2005).
Proses demineralisasi sebaiknya dilakukan setelah proses ekstraksi protein karena penambahan larutan alkali pada proses sebelumnya akan memberikan efek penstabil pada kulit udang dan memaksimalkan produk dan kualitas protein yang dihasilkan. Kontaminasi protein pada cairan ekstrak mineral dapat terjadi apabila proses demineralisasi dilakukan sebelum proses deproteinasi (Angka dan Suhartono, 2000).
D. Enzim
Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel hidup, dan mempunyai fungsi penting sebagai biokatalisator reaksi biokimia yang secara kolektif membentuk metabolisme-perantara dari sel. Enzim dapat mempercepat reaksi dengan cara menurunkan energi bebas pengaktifan. Katalis bergabung dengan reaktan sedemikian rupa sehingga dihasilkan keadaan transisi yang
tanpa katalis. Setelah reaksi terbentuk, katalis dibebaskan kembali ke keadaan semula (Lehninger, 2005).
Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa adalah (1) dapat meningkatkan produk lebih tinggi; (2) bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah; dan (3) bersifat spesifik dan selektif terhadap substrat tertentu. Enzim telah banyak digunakan dalam bidang industri pangan, farmasi, dan industri kimia lainnya. Enzim dapat diisolasi dari hewan, tumbuha, dan mikroorganisme (Azmi, 2006).
1. Mekanisme kerja enzim
Enzim dapat menyesuaikan diri dengan substrat (molekul yang akan
dikerjakan) untuk membentuk suatu kompleks enzim substrat. Ikatan-ikatan substrat dapat menjadi tegang oleh gaya tarik antara substrat dan enzim. Ikatan tegang memiliki energi tinggi dan mudah terputus; oleh karena itu, reaksi yang diinginkan berlangsung lebih mudah dan menghasilkan suatu kompleks enzim-produk. Dalam banyak hal, produk dan substrat itu tidak sama bentuknya, jadi kesesuaian antara produk dan enzim tidak lagi sempurna. Bentuk yang diubah dari produk itu menyebabkan kompleks berdisosiasi, dan molekul enzim siap menerima molekul substrat lain. Teori aktivitas enzim ini disebut teori kesesuaian-terimbas (teori induced fit).
besar dimana reaksi terjadi disebut sisi aktif. Pada sisi ini terdapat gugus prostetik (jika ada). Gugus prostetik logam diduga berfungsi sebagai zat elektrofilik, dan dengan jalan ini mengkatalisis reaksi yang diinginkan (Fessenden dan Fessenden, 1990).
2. Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim
Beberapa faktor yang mempengaruhi kerja enzim adalah sebagai berikut :
a. Konsentrasi Enzim
Seperti halnya katalis lain, kecepatan suatu reaksi yang menggunakan enzim tergantung pada konsentrasi enzim tersebut. Pada konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim.
b. Konsentrasi Substrat
Laju reaksi yang dikatalisasi oleh enzim mula-mula meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat. Setelah konsentrasi substrat dinaikkan lebih lanjut akan tercapai suatu laju maksimum. Pada konsentrasi substrat yang menghasilkan laju reaksi maksimum enzim telah dalam keadaan jenuh dengan substrat.
c. Suhu
terganggu dan demikian konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatan reaksinyapun akan menurun.
d. Derajat Keasaman (pH)
Reaksi suatu enzim dipengaruhi oleh perubahan pH karena akan berakibat langsung terhadap sifat ion dari gugus-gugus amino dan karboksilat, sehingga akan mempengaruhi bagian aktif enzim dan konformasi dari enzim, pH yang terlalu rendah atau terlalu tinggi akan mengakibatkan denaturasi dari protein enzim.
e. Penghambat enzim (Inhibitor)
Inhibitor dapat meminimalkan kerja enzim karena akan membentuk ikatan dengan sisi aktif enzim sehingga mengganggu proses pembentukan dan kestabilan ikatan kompleks enzim substrat. Ada beberapa proses inhibisi enzim, yaitu inhibisi kompetitif, inhibisi non-kompetitif, dan inhibisi umpan-balik (Lehninger, 2005).
E. Kitinase
Kitinase merupakan glikosil hidrolase yang mengkatalisis degradasi kitin. Enzim ini ditemukan dalam berbagai organisme, termasuk organisme yang tidak
1. Endokitinase yaitu kitinase yang memotong secara acak ikatan β-1,4 bagian internal mikrofibril kitin. Produk akhir yang terbentuk bersifat mudah larut berupa oligomer pendek N-asetilglukosamin (GIcNAc) yang mempunyai berat molekul rendah seperti kitotetraose.
Gambar 3. Reaksi pemutusan ikatan β-1,4 pada bagian internal mikrofibril kitin
(Suryanto et al., 2005)
2. Eksokitinase dinamakan juga kitobiodase atau kitin 1,4-β-kitobiodase, yaitu enzim yang mengatalisis secara aktif pembebasan unit-unit diasetilkitobiose tanpa ada unit-unit monosakarida atau polisakarida yang dibentuk. Pemotongan hanya terjadi pada ujung non reduksi mikrofibril kitin dan tidak secara acak.
[image:37.595.122.502.547.649.2]3. β-1,4-N-asetilglukosaminidase merupakan suatu kitinase yang bekerja pada pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose dan kitotetraose dengan menghasilkan monomer-monomer GIcNAc.
Gambar 5. Reaksi pemutusan diasetilkitobiose, kitotriose dan kitotetraose dan menghasilkan monomer-monomer GIcNAc (Suryanto et al., 2005)
kitinase untuk mendegradasi dinding sel fungi patogen. Insekta menggunakan kitinase untuk perkembangannya (Gohel et al., 2006).
Sama seperti enzim pada umumnya, aktivitas kitinase juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan, seperti pH, suhu, serta faktor kimiawi tertentu yang secara khusus dapat mempengaruhi enzim tersebut (Campbell et al., 2002). Dalam penelitian yang dilakukan oleh Anggraini (2010), enzim kitinase ekstraselular yang diproduksi oleh Actinomycetes menunjukkan aktivitas optimum pada pH 7 dan dengan temperatur 30oC. Substrat yang digunakan merupakan koloidal kitin yang dicuci dengan NaOH. Berdasarkan pengamatan terhadap waktu inkubasi substrat kitin dengan enzim kitinase, diketahui bahwa enzim kitinase
menunjukkan aktifitas paling tinggi pada menit ke 20.
Kitinase dalam mikroorganisme dapat dihambat secara kompetitif oleh beberapa senyawa. Peter (2005) menuliskan bahwa kitinase dihambat oleh alosamidin dan beberapa senyawa selain gula. Argifin dan argadin menghambat kitinase serangga Lucilia curpina. Yurnaliza (2002) melaporkan bahwa N-asetilglukosamin dan glukosa menghambat sintesis kitinase pada Trichoderma harzianumm.
F. Actinomycetes
2007). Actinomycetes telah dieksploitasi secara komersil untuk produksi farmasi, enzim, agen antitumor, inhibitor enzim, dan sebagainya (Remya and
Vijayakumar, 2008).
Actinomycetes memiliki sifat-sifat yang umum dimiliki oleh jamur dan bakteri. Terlihat dari luar seperti jamur (eukariotik), namun organisme ini sesuai dengan semua kriteria untuk sel prokariotik, yaitu dinding selnya mengandung asam muramat, tidak mempunyai mitokondrion, mengandung ribosom 70s, tidak mempunyai pembungkus nukleus, garis tengah selnya berkisar dari 0,5-2,0 µm, dan dapat dimatikan atau dihambat oleh banyak antibiotik bakteri. Pada lempeng agar, Actinomycetes dapat dibedakan dengan mudah dari bakteri dimana koloni bakteri tumbuh dengan cepat dan berlendir, sedangkan Actinomycetes muncul perlahan dan berbubuk serta melekat erat pada permukaan agar (Rao, 1994).
Walaupun Actinomycetes dikatakan sebagai bakteri peralihan antara bakteri dan fungi (Alexander,1997), tetapi Actinomycetes mempunyai ciri yang khas yang cukup membatasinya menjadi satu kelompok yang jelas berbeda. Pada medium cair, pertumbuhan Actinomycetes ditandai dengan keruhnya medium dan terbentuk lapisan tipis di permukaan medium.
Medium yang baik untuk menumbuhkan Actinomycetes adalah medium yang mengandung glukosa; gliserol atau tepung sebagai sumber karbon; nitrat atau kasein sebagai sumber nitrogen dan mineral-mineral tertentu seperti NaCl,
K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCO3, FeSO4. 7H2O. Inkubasi biasanya selama 2-7 hari
(Jutono, 1995).
G. Kitooligosakarida
Kitooligosakarida seperti kitodiosa (G2), kitotriosa (G3), kitotetraosa (G4), kitopentosa (G5), kitoheksosa (G6), dan kitoheptosa (G7) banyak digunakan dalam aplikasi medis karena aktivitas biologisnya yang menarik, seperti
antibakteri, penginduksi enzim lisozim, dan perangsang antibodi. Kitooligomer yang besar (kitoheksosa dan kitoheptosa) dapat melawan aktivitas antitumor pada mencit dan juga dapat menimbulkan aktivitas kitinase pada tanaman.
Kitooligosakarida dapat diperoleh dengan metode kimiawi atau enzimatik dari kitin atau kitosan. Kitosanolisis yang dicapai oleh asam, sebagian besar dapat dilakukan menggunakan HCl atau HNO2. Metode ini sangat sederhana dengan
hasil yang baik, namun sulit untuk mengontrol metode ini dan sulit untuk menghilangkan asam kuat dan produk samping dari reaksi pencoklatannya. Kerugian lain dalam menggunakan HNO2 adalah modifikasi struktur produk
Degradasi secara enzimatik telah diakui sebagai pendekatan yang paling menjanjikan untuk memperoleh oligomer kitosan. Hal ini dikarenakan kondisi reaksi yang moderat tanpa produk samping dan proses degradasinya mudah diamati (Xie et al., 2011). Hidrolisis kitosan dengan enzim kitinase diikuti oleh pemutusan N-asetilasi kimiawi dari hidrolisat, sebaik hidolisis kitosan ter-N-asetilasi menggunakan enzim lisozim. Hal ini menunjukkan bahwa hidrolisis enzimatik dapat berguna untuk memperoleh beragam N-asetilkitooligosakarida.
Bagaimanapun, semua metode degradasi ini, menghasilkan sedikit jumlah kitooligosakarida, atau kitooligosakarida tidak seluruhnya dapat diproduksi (Somchai and Duenpen, 2007).
H. N-asetilglukosamin
N-asetilglukosamin (GlcNAc) merupakan monomer dari kitin yang memiliki rumus molekul C6H15NO6 yang berisi campuran murni 6,9% nitrogen dengan
struktur kimia yang sama dengan selulosa yang diganti oleh suatu unit asetil amino (CH3COONH2) (Pasaribu, 2004). Pada umumnya, GlcNAc berbentuk
Gambar 6. Struktur N-asetilglukosamin (Anonim, 2013)
Senyawa GlcNAc pada umumnya dihasilkan melalui hidrolisis asam (HCl) dari kitin. Produksi GlcNAc paling baik dihasilkan dari hidrolisis β-kitin. Produksi GlcNAc dari kitin harus melalui dua tahap. Pada awalnya kitin dipecah secara perlahan oleh endokitinase menjadi oligosakarida, selanjutnya oligosakarida dipecah secara cepat oleh eksokitinase menjadi GlcNAc (Sashiwa et al., 2003).
I. Glukosamin
Glukosamin merupakan gula beramina dengan rumus molekul C6H13NO5.
Glukosamin dalam bentuk murni berupa serbuk kristal putih dengan titik leleh 190-194oC. Glukosamin memiliki kelarutan tinggi dalam air dengan titik larut 100 mg/mL pada suhu 20oC (Kralovec and Barrow, 2008).
[image:43.595.247.379.610.701.2]Glukosamin telah dilaporkan memiliki potensi untuk mencegah perubahan struktur pada pasien osteoarthritis (OA) dan secara bersamaan dapat digabungkan menjadi suplemen (Richy et al., 2003). Gula amino secara alami disintesis dalam tubuh manusia dan karena aplikasinya yang luas, maka muncul ketertarikan untuk memproduksi glukosamin secara komersil.
Glukosamin ditemukan dalam limbah kulit crustacea seperti udang, kepiting, dan lobster. Glukosamin dapat diperoleh dari pemecahan langsung substrat kitin dari limbah kerang-kerangan, tetapi dalam pemanfaatan kitin secara langsung,
beberapa usaha di buat untuk menghasilkan glukosamin melalui proses fermentasi (Kuk et al., 2005).
J. Fermentasi
Ahli mikrobiologi industri memperluas pengertian fermentasi yaitu segala proses untuk menghasilkan suatu produk dari kultur mikroorganisme (Rohmat, 2007). Produk yang dapat diperoleh dari proses fermentasi adalah enzim, sel
Fermentasi dapat dilakukan dengan metode kultur permukaan dan kultur terendam. Medium kultur permukaan dapat berupa medium padat, semi padat, atau cair. Sedangkan kultur terendam dilakukan dalam medium cair menggunakan bioreaktor yang dapat berupa labu yang diberi aerasi, labu yang digoyang dengan shaker atau fermentor (Rahman, 1992). Menurut Rahman (1992), medium cair mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan dengan medium padat, yaitu:
1. Jenis dan konsentrasi komponen-komponen medium dapat diatur sesuai dengan yang diinginkan,
2. dapat memberikan kondisi yang optimum untuk pertumbuhan, 3. pemakaian medium lebih efisien
Kondisi yang optimum untuk fermentasi tergantung pada jenis mikroorganisme yang digunakan. Pengendalian faktor-faktor fermentasi bertujuan untuk
menciptakan kondisi yang optimum bagi pertumbuhan dan produksi metabolit yang diinginkan dari suatu mikroorganisme tertentu. Fermentasi medium cair lebih memungkinkan adanya pengendalian faktor-faktor fisik dan kimia yang mempengaruhi proses fermentasi seperti suhu, pH, dan kebutuhan oksigen (Ton et al., 2010).
K. Fermentasi Cair Sistem Tertutup (Batch)
sistem tertutup, tidak ada penambahan media baru, ada penambahan oksigen dan aerasi, antifoam dan asam atau basa dengan cara mengontrol pH (Iman, 2008). Bioreaktor tipe batch memiliki keuntungan lain yaitu dapat digunakan ketika bahan tersedia pada waktu-waktu tertentu dan bila memiliki kandungan padatan tinggi (25%). Bila bahan berserat atau sulit untuk diproses, tipe batch akan lebih cocok dibanding tipe aliran kontinyu, karena lama proses dapat ditingkatkan dengan mudah. Bila proses terjadi kesalahan, misalnya karena bahan beracun, proses dapat dihentikan dan dimulai dengan yang baru (Susanto, 2012).
1. Tahapan Proses Fermentasi Batch
Menurut Mitchel et al. (2006) tahapan-tahapan proses fermentasi batch secara umum, antara lain :
a. Persiapan substrat, dimana substrat harus dipotong, digiling, dipecahkan, atau dibuat menjadi butiran kecil. Dengan penambahan air dan nutrisi disebut pra-perawatan substrat untuk menambah ketersediaan gizi.
b. Persiapan inokulum, tipe dan persiapan inokulum tergantung pada mikroorganisme yang digunakan. Banyak proses fermentasi batch
melibatkan bakteri, jamur, dan salah satunya adalah Actinomycetes, maka digunakan spora hasil inokulasi. Tujuan dari langkah ini adalah untuk mengembangkan sebuah inokulum dengan tingkat kelangsungan mikroorganisme yang tinggi.
d. Inokulasi dan pengerjaan, pengerjaan tahapan ini adalah dengan
menyebarkan substrat pada media yang telah disterilkan secara hati-hati untuk menghindari kontaminasi dari mikroorganisme yang tidak diinginkan.
e. Pada proses ini banyak hal yang harus diperhatikan antara lain pH medium, suhu, dan waktu inkubasi. Aerasi atau penambahan oksigen dapat dilakukan apabila diperlukan. Actinomycetes merupakan mikroorganisme fakultatif anaerobik, yaitu mikroorganisme yang memanfaatkan oksigen disekitarnya jika tersedia.
f. Kultivasi, pada tahapan ini diperlukan bantuan mekanis untuk memisahkan substrat padat dari medium. Penggunaan kertas saring dan sentrifugasi dapat dipakai untuk memisahkan substrat.
2. Aplikasi Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch)
Menurut Holker et al. (2004) dan Pandey et al. (2008), aplikasi dari fermentasi batch secara tradisional, antara lain :
a. Yogurt, diproduksi dengan cara memfermentasikan air susu dengan bakteri bukan khamir. Biasanya menggunakan campuran Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophillus. Bakteri mengubah laktosa pada kondisi anaerobik. Laktosa diubah menjadi asam laktat yang bersifat
menggumpalkan kasein (protein susu).
Streptococcus thermophillus dan Lactobacillus bulgaricus. Enzim yang diperlukan untuk menghasilkan keju adalah rennet yang mengandung cymosin yang bersifat menggumpalkan kasein.
c. Bir, minuman beralkohol. Sari buah yang diberi Saccaromyces cerevcieae kemudian diinkubasikan, didapatkan minuman beralkohol.
L. Fourier Transform Infrared (FTIR)
Fourier Transform Infrared (FTIR) merupakan suatu teknik spektroskopi inframerah yang dapat mengidentifikasi kendungan gugus fungsi suatu senyawa termasuk senyawa kalsium fosfat, namun tidak dapat mengidentifikasi unsur-unsur penyusunnya. Ada dua jenis energi vibrasi yaitu vibrasi bending dan vibrasi streching. Vibrasi bending yaitu pergerakan atom yang menyebabkan perubahan sudut ikatan antara dua ikatan atom atau pergerakan dari seluruh atom terhadap atom lainnya. Sedangkan vibrasi stretching adalah pergerakan atom yang teratur sepanjang sumbu ikatan antara dua atom sehingga jarak antara dua atom dapat bertambah atau berkurang (Samsiah, 2009).
pola interferensi. Dengan adanya ADC (Analog to Digital Converter) akan mengubah pengukuran tersebut menjadi suatu format digital yang dapat digunakan oleh komputer. Kemudian interferogram diubah menjadi suatu pita spektrum tunggal oleh FFT (Fast Fourier Transform) (Nurofik, 2008).
Identifikasi gugus fungsi biasanya dilakukan pada daerah bilangan gelombang 800-4000 cm-1. Sebagai contoh, senyawa kitin memberikan data serapan IR : v = 3448,5 cm-1 yang memberikan vibrasi ulur NH amida (NH amina) dan OH; v = 2920-2873 cm-1 yang menunjukkan vibrasi ulur CH, CH2, dan CH3; v = 1450,4
cm-1 yang menunjukkan vibrasi tekuk NH; v = 1153,4 cm-1 yang menunjukkan vibrasi ulur C-N; v = 1033,8 cm-1 yang menunjukkan vibrasi ulur C-O; dan v = 871,8 cm-1 yang menunjukkan vibrasi tekuk ke luar bidang N-H (Syahmani dan Solahuddin, 2009).
Spektroskopi FTIR telah digunakan untuk membandingkan kemurnian kitin hasil isolasi dari pupa ulat sutera. Efisiensi dari produksi kitosan melalui N-deasetilasi dari kitin juga diinvestigasi menggunakan IR dalam pekerjaan ini. Selama N-deasetilasi kitin, pita pada 1655 cm-1 secara bertahap menurun, sedangkan pada 1590 cm-1 meningkat, pada umumnya hal ini mengindikasikan gugus NH2
M. Spektroskopi UV-Visible
Spektroskopi ultraviolet/visible (UV-Vis) merupakan teknik analisis yang penting karena dua alasan: pertama, teknik ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi dalam molekul; kedua, dapat digunakan untuk pengukuran. Spektroskopi UV-Vis melibatkan absorpsi radiasi elektromagnetik dari kisaran 200-800 nm dan kemudian eksitasi elektron ke tingkat energi lebih tinggi. Absorpsi cahaya ultraviolet/tampak oleh molekul organik terbatas hanya untuk beberapa gugus fungsi (kromofor) yang mengandung elektron valensi dari energi eksitasi yang rendah. Spektrum UV-Vis merupakan spektrum yang kompleks dan nampak seperti pita absorpsi berlanjut, hal ini dikarenakan gangguan yang besar dari transisi rotasi dan vibrasi pada transisi elektronik memberikan kombinasi garis yang tumpang tindih (overlapping). Dewasa ini, deteksi individu dari transfer elektron tanpa gangguan yang besar oleh pita vibrasi yang berdekatan juga dapat direkam (Hunger and Weitkamp, 2001).
Gambar 8. Skema komponen-komponen spektroskopi UV-Vis (Pangestu, 2011)
1. Komponen-komponen Spektrofotometer UV-Vis
Untuk mendapatkan hasil pengukuran yang optimum, setiap komponen dari instrumen yang dipakai harus berfungsi dengan baik. Komponen-komponen spektrofotometri UV-Vis meliputi sumber sinar, monokromatro, dan sistem optik.
a. Sebagai sumber sinar; lampu deuterium atau lampu hidrogen untuk pengukuran UV dan lampu tungsten digunakan untuk daerah tampak (visible).
c. Optik-optik; dapat didesain untuk memecah sumber sinar sehingga sumber sinar melewati 2 kompartemen, dan sebagai mana dalam spektrofotometer berkas ganda (double beam), suatu larutan blanko dapat digunakan dalam suatu kompartemen untuk mengoreksi pembacaan atau spektrum sampel. Yang paling sering digunakan sebagai blanko dalam spektrofotometri adalah semua pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel atau pereaksi (Rohman, 2007).
2. Pemilihan pelarut
Tabel 1. Pelarut-pelarut untuk daerah ultraviolet dan cahaya tampak (Day dan Underwood, 2002) Pelarut Perkiraan Tansparansi Minimum (nm) Pelarut Perkiraan Tansparansi Minimum (nm) Air Metanol Sikloheksana Heksana Dietil eter p-dioksana Etanol 190 210 210 210 220 220 230 Kloroform Karbon tetraklorida Benzena Toluena Piridina Aseton Karbon disulfida 250 265 280 285 305 330 380
3. Analisis senyawa turunan kitin/kitosan
Spektra UV-Vis turunan kitin/kitosan biasanya direkam dalam larutan asam (asam asetat, asam posforat, asam perklorat, dam asam hidroklorida) dalam sel kwarsa 1 cm pada suhu kamar. Terkadang air, larutan basa, atau larutan DMSO digunakan. Spektra difusi refleksi UV-Vis dari sampel bubuk atau lapisan tipis diukur. Analisis dalam ultraviolet vakum melewati kisaran inframerah juga digunakan (Kumirska et al., 2010).
Kitin dan kitosan termasuk rasio beragam dari dua gugus kromofor UV jauh, N-asetil glukosamin dan glukosamin; sebagai hasil, koefisien eksistensi mereka untuk panjang gelombang lebih pendek dari 225 nm bukan nol. Hal ini
dikarenakan, residu N-asetil glukosamin dan glukosamin menunjukkan tidak adanya interaksi dengan rantai kitin/kitosan, unit-unit monomer berkontribusi dalam jalur tambahan, sederhana untuk total absorbansi polimer-polimer ini pada panjang gelombang khusus. Spektra UV dari campuran Nasetil
spektra kitosan, dan λ maks adalah 201 nm dalam larutan HCl 0,1 M (Liu et
al., 2006).
Gadgoli (2006) mengukur kadar glukosamin sulfat dalam tablet menggunakan spektrofotometri UV. Larutan berair dari tablet atau obat memperlihatkan absorpsi maksimal pada 190 nm, yang tidak dapat dimanfaatkan untuk penentuan kuantitatif. Pendekatan alternatif adalah mendrivatisasi obat ke dalam kromofor dalam molekul yang juga mampu untuk digunakan dalam penentuan spektrofotometri. Gugus amina dari obat direaksikan dengan fenil isotiosianat (PITC) untuk memperoleh turunan fenil tiourea (PTH), yang memperlihatkan absorpsi maksimal pada 240 nm. Metode tersebut kemudian dioptimalkan kondisi reaksinya dan diamati bahwa reaksi dipengaruhi oleh pemanasan sampel dalam medium basa dengan larutan metanol dari PITC. Lebih lanjut, obat tersebut, menjasi gula amino (glukosamin), membutuhkan waktu stabilisasi selama 24 jam dalam pH basa, dimana kondisi basa diberikan oleh natrium asetat. Kandungan glukosamin sulfat dalam formula tablet
dihitung dengan menerapkan faktor pengenceran yang sesuai dan meramalkan kemungknan dari kurva kalibrasi.
N. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
umum digunakan untuk identifikasi senyawa nonpolar dan fasa terbalik yang umum digunakan untuk identifikasi senyawa polar. Pada fasa normal, fasa gerak yang digunakan kurang polar dibandingkan dengan fasa diam. Sedangkan pada fasa terbalik, fasa gerak lebih polar dibandingkan dengan fasa diam (Kupiec, 2004).
[image:55.595.188.437.345.596.2]Prinsip pemisahan senyawa menggunakan HPLC adalah perbedaan distribusi komponen diantara fasa diam dan fasa geraknya. Semakin lama terdistribusi dalam fasa diam, maka semakin lama waktu retensinya (Clark, 2007).
Gambar 9. Diagram Blok Sistem Kromatografi Cair (Lindsay, 1992)
Untuk itu, sebagian metode menggunakan derivat untuk menaikkan deteksi UV ataupun fluoresens. Derivat-derivat tersebut meliputi fenil isotiosianat (PITC), asam antranilat/natrium sianoborohidrida, dan
6-aminokuinolil-N-hidroksisuksinimidil karbamat (AQC).
Metode lain yaitu menggunakan kolom C8 dengan deteksi UV pada panjang gelombang 195 nm. Metode ini cukup sederhana namun tetap saja memberikan renspon yang relatif rendah dan HCl sendiri dapat memberikan kromatogram yang sama. Metode yang didasarkan pada deteksi indeks refraktif (RI) biasanya
membutuhkan fasa kolom ikatan amino, yang telah diketahui memiliki stabilitas terbatas, dan hasil yang juga rendah sensitifitasnya.
Metode HPLC dengan menggunakan evaporasi detektor hamburan cahaya (ELSD) dapat meningkatkan sensitivitas, serta digunakan kolom HPLC yang sangat stabil, mudah, dan cepat (Jacyno and Dean, 2004). Detektor evaporasi hamburan cahaya ideal untuk mendeteksi analit tanpa gugus kromofor UV, karena analisis tidak bergantung pada sifat optik dari suatu senyawa.
I. METODOLOGI PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2014 sampai dengan bulan Juni 2014, dengan tahapan kegiatan yaitu pengambilan sampel di Gudang Lelang, Teluk Betung, pembuatan serta karakterisasi kitin, serta pengukuran konsentrasi glukosamin hasil fermentasi secara spektrofotometri UV-Vis, dilakukan di Laboratorium Biomassa Terpadu, Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah kitin dan glukosamin standar produk WAKO Jepang, agar for microbiology, dekstrosa, yeast extract, malt extract, isolat
Actinomycetes ANL-4, air laut steril, cycloheximide, nalidixic acid, NaOH, HCl, (NH4)2SO4, NaCl, K2HPO4, MgSO4, CaCl2, CH3COONa, PITC (phenyl
isothiocyanate), metanol, kertas saring, kapas, kain kasa, aquades, indikator universal, serbuk kulit udang.
C. Prosedur Penelitian
1. Isolasi Kitin
Proses ekstraksi kitin terdiri dari tiga tahap, yaitu: deproteinasi yang merupakan proses pemisahan protein dari kulit udang, demineralisasi yang merupakan proses pemisahan mineral, dan depigmentasi yang merupakan tahap pemutihan kitin. Namun pada penelitian ini tidak akan dilakukan tahap depigmentasi karena kitin yang dihasilkan tidak untuk dikomersialkan.
a. Persiapan Sampel Kulit Udang
Limbah kulit dan kepala udang untuk bahan baku pembuatan kitin dikumpulkan dari pengepul udang di kecamatan Teluk Betung, Bandar Lampung. Limbah kulit dan kepala udang dipisahkan dari isi dan
b. Deproteinasi
Sebanyak 100 g sampel kulit udang ditimbang dan dimasukkan dalam bejana tahan asam dan basa yang dilengkapi dengan termometer dan batang pengaduk, dan diletakkan dalam penangas air. Kemudian sampel
ditambahkan 1000 ml larutan NaOH 20% dan dipanaskan selama 1 jam pada suhu 90oC (Pariera, 2004). Selanjutnya dilakukan penyaringan hingga diperoleh residu dan filtrat. Untuk menguji apakah protein telah berhasil dipisahkan dari kitin, maka diambil 5 ml filtrat dan ditambahkan dengan CuSO4. Protein dengan CuSO4 akan membentuk kompleks berwarna ungu.
Residunya dicuci dengan air suling hingga pH netral kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 60oC selama 24 jam.
c. Demineralisasi
Kitin kasar hasil deproteinasi dimasukkan dalam bejana tahan asam dan basa yang dilengkapi dengan batang pengaduk dan termometer, dan
diletakkan dalam penangas air. Kemudian ditambahkan HCl 1,25 N dengan perbandingan 1 : 10 (v/v) dan dipanaskan pada suhu 90oC selama 1 jam
2. Karakterisasi Kitin dengan FTIR
Kitin murni yang diperoleh dari dua tahap yaitu deproteinasi dan
demineralisasi akan dibaca menggunakan Spektrofotometer FTIR. Kitin dibuat pellet dengan KBr, kemudian dilakukan scanning pada daerah frekuensi antara 4000-1 sampai dengan 400-1. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan hasil pembacaan kitin standar.
3. Pembuatan Media
a. Media ISP-2 (International Streptomyces Project-2)
Media ISP-2 terdiri dari 0,4 g yeast extract; 1 gram malt extract; 0,4 gram dekstrosa, dan 2 gram agar, lalu dilarutkan dalam 100 ml air laut steril kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 2 atm. Setelah itu media disinari dengan sinar uv dalam laminar air flow selama 5 menit dan ditambahkan masing-masing 25 µL cycloheximide dan nalidixic acid (Margavey et al., 2004).
b. Larutan Mineral Garam Actinomycetes ANL-4
Larutan ini terdiri dari 0,4% (NH4)2SO4, 0,6% NaCl, 0,1% K2HPO4, 0,01%
MgSO4, 0,01% CaCl2, dan 1% kitin. Larutan disterilkan dengan autoklaf
4. Pertumbuhan Actinomycetes ANL-4
Media ISP-2 yang telah ditambahkan masing-masing 25 µL cycloheximide dan nalidixic acid kemudian dituang secara hati-hati ke dalam cawan petri dan tabung reaksi (media agar miring) yang telah disterilisasi sebelumnya.
Cycloheximide dan nalidixic acid ditambahkan untuk menghindari kontaminasi dengan jamur (Margavey et al., 2004). Setelah agar memadat, strain
Actinomycetes ANL-4 ditumbuhkan pada media 2. Selanjutnya media ISP-2 tersebut diinkubasi dalam inkubator pada suhu 30oC dan pertumbuhan Actinomycetes diamati setelah ± 7 hari waktu inkubasi.
5. Persiapan Inokulum
Spora kultur 7-9 hari dipisahkan dan dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 100 ml yang berisi 10 ml larutan mineral garam yang telah disterilisasi. Media inokulum ini dibuat 9 replikat. Labu erlenmeyer diletakkan pada shaker
inkubator dengan kecepatan 200 rpm pada suhu 30oC selama 7 hari.
6. Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch) Kitin dengan Actinomycetes ANL-4
Fermentasi batch dilakukan dengan menggunakan Shaker Incubator sistem tertutup. Substrat yang digunakan adalah kitin. Sebelum digunakan, kitin dipanaskan dalam larutan 0,5% NaOH dengan perbandingan 1:1 selama 1 jam. Selanjutnya kitin dibilas dengan akuades hingga pH 7, lalu filtratnya
Sebanyak 1 g substrat kitin dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 100 ml. Substrat kemudian direndam dalam 10 ml larutan mineral garam yang terdiri dari 0,4% (NH4)2SO4, 0,6% NaCl, 0,1% K2HPO4, dan 0,01% CaCl2. Media
fermentasi ini dibuat 9 replikat. Selanjutnya media disterilisasi dengan autoklaf pada 2 atm temperatur 121oC selama 20 menit. Kultur awal diinokulasikan dalam media kitin dengan perbandingan 1 : 1, lalu media cair difermentasikan pada 30oC dengan kecepatan shaking 250 rpm selama 45 hari (Chahal et al., 1996).
Sejumlah hasil dari fermentasi batch, pada tiap selang waktu 5 hari, dipanaskan dengan waterbath pada suhu 70oC selama 45 menit. Kemudian dicampurkan dengan 5 ml air suling dengan membiarkan labu erlenmeyer pada rotary shaker selama 1 jam pada 200 rpm. Campuran disaring menggunakan kertas saring dan filtrat disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC. Semua filtrat yang dieroleh, dibekukan dalam freezer selama 24 jam, kemudian diliofilisasi menggunakan freeze dry sampai terbentuk kristal
glukosamin.
7. Analisis Glukosamin dengan Spektrofotometer UV-Vis
a. Pembuatan larutan standar PTH (fenil tiourea)
Larutan standar yang digunakan adalah larutan PTH, hasil reaksi
glukosamin (Glc) standar WAKO yang dengan fenil isotiosianat (PITC) dalam metanol. Konsentrasi larutan Glc dan PITC yang dibuat masing-masing adalah 3, 6, 9, 12, dan 15 mg/L. Mula-mula ditimbang 0,1 gram sampel, lalu dilarutkan dalam 10 ml CH3COONa dan didiamkan selama 24
jam agar larutan stabil. Larutan standar induk ini kemudian diencerkan secara bertahap hingga menjadi 100 ppm. Larutan standar 3, 6, 9, 12, dan 15 mg/L dibuat dengan dipipet secara teliti 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; dan 1,5 larutan standar 100 mg/L, masing-masing diencerkan dengan pelarut CH3COONa
dalam labu takar 10 ml hingga tanda batas tera, lalu dihomogenkan. Larutan PITC dibuat dengan variasi konsentrasi yang sama menggunakan pelarut metanol dalam labu takar 10 ml. Selanjutnya 10 ml larutan Glc dicampurkan dengan 10 ml larutan PITC dan dikocok dalam labu takar 25 ml selama ± 5 menit. Reaksi antara glukosamin dengan PITC menghasilkan senyawa derivat fenil tiourea (PTH).
b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Penentuan panjang gelombang maksimum untuk analisis dengan
c. Kalibrasi glukosamin sampel
Rendemen glukosamin dari setiap 5 hari inkubasi diambil 0,1 gram sebagai sampel yang akan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Sampel ini dilarutkan dengan natrium asetat dalam labu ukur 10 ml
sehingga diperoleh konsentrasi 10.000 mg/L. Larutan ini diencerkan secara bertahap sampai diperoleh konsentrasi 12 ppm, kemudian larutan sampel 12 ppm ini direaksikan dengan PITC dengan konsentrasi yang sama.
Absorbansi glukosamin dalam sampel dikalibrasikan dengan kurva standar PTH menggunakan persamaan regresi linear. Hasil yang diperoleh
dikalikan dengan faktor pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi glukosamin dalam rendemen hasil fermentasi tiap selang waktu 5 hari.
8. Analisis Kemurnian Glukosamin dengan HPLC
a. Pembuatan standar Glukosamin
Sebanyak 50 mg glukosamin standar dilarutkan dalam 25 ml akuabides. Kemudian didiamkan selama ± 24 jam dan diperoleh konsentrasi akhir 2000 mg/L.
b. Pemeriksaan Sampel Glukosamin Hasil Fermentasi
merupakan campuran pelarut polar, laju alir 0,8 mL/menit, laju gas N2 1,6
V. SIMPULAN DAN SARAN
A.SIMPULAN
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Hari ke 5 inkubasi telah menunjukkan produksi glukosamin yang cukup tinggi, yaitu sebesar 63 % dari 1 gram bobot kitin awal dengan kadar glukosamin dalam rendemen sebesar 97,88 %.
2. Produksi glukosamin paling tinggi dihasilkan pada hari ke 15 inkubasi, yaitu sebesar 71,70 % dengan kadar glukosamin dalam rendemen sebesar
95,50%.
3. Kromatogram HPLC-ELSD rendemen hasil fermentasi kitin dengan
Actinomycetes ANL-4 pada hari ke 5 dan hari ke 15 inkubasi menunjukkan adanya dua puncak, dengan satu puncak yang dominan pada rentang waktu retensi 2-3 menit. Glukosamin standar WAKO Jepang juga memiliki rentang waktu retensi 2-3 menit.
5. Berdasarkan hasil pengukuran menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan analisis kemurnian dengan HPLC-ELSD, diketahui bahwa hari ke 15 inkubasi merupakan waktu optimum degradasi kitin oleh Actinomycetes ANL-4.
B.SARAN
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, maka pada penelitian selanjutnya disarankan untuk :
1. Menelusuri kurva pertumbuhan dari Actinomycetes ANL-4.
2. Mengidentifikasi karakteristik morfologi dari isolat Actinomycetes ANL-4 menggunakan SEM (Scanning Electron Microscope).
3. Menganalisis kemurnian glukosamin hasil fermentasi setiap selang waktu 1 jam dalam 1 hari waktu inkubasi kitin dengan Actinomycetes ANL-4 menggunakan HPLC-ELSD dengan rentang waktu 0-9 menit.
4. Menganalisis karakteristik kerja enzim kitinase dari Actinomycetes ANL-4 dalam mendegradasi kitin selama proses fermentasi menggunakan
DAFTAR PUSTAKA
Aam, B.B., Ellinor B.H., Anne L.N., Morten S., Kjell M.V., and Vincent G.H.E. 2010. Production of Chitooligosaccharides and Their Potential
Applications in Medicine. Review Marine Drugs. 8: 1482-1517.
Alexander, M. 1997. Introduction to Soil Microbiology 2nd Edition. John Wiley and Sons. New York.
Anggraini, W. 2010. Uji Aktivitas Enzim Kitinase dari Isolat Actinomycetes Selama Proses Solid State Fermentation Kitin Dengan Metode Somogyi-Nelson. Skripsi. Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Angka, S.L. dan M.T. Suhartono. 2000. Bioteknologi Hasil Laut. PKSPL-IPB. Bogor.
Anonim. 2013. N-Acetylglucosamine. http://en.wikipedia.org/wiki/N-Acetylglucosamine. Diakses pada tanggal 30 Januari 2014.
Azmi, J. 2006. Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi Aspergillus oryzae Untuk Isolasi Enzim Amilase Pada Medium Pati Biji Nangka (Arthocarphus heterophilus Lmk). Jurnal Biogenesis. 2(2): 55-58.
Bahariah. 2005. Pengaruh Konsentrasi NaOH dan Suhu pada Proses Deproteinasi Untuk Produksi Kitin dari Limbah Kulit Udang Putih (Penaeus
merguensis). Skripsi. Universitas Hasanuddin. Makassar.
Beaney, P., J Lizardi-Mendoza, and M Healy. 2005. Comparison of Chitins Produced by Chemical and Bioprocessing Methods. J. Chem. Technol. Biotechnol. (80): 145-150.
Cabrera J.C. and Cutsem, P.V. 2005. Preparation of Chitooligosaccarides with Degree of Polymerization Higher Than 6 by Acid or Enzymatic
Degradation of Chitosan. Biochemical Engineering Journal. 25: 165-172.
Campbell, N.A., J.B. Reece and L.G. Mitchell. 2002. Biologi. Terjemahan dari Biology, oleh Lestari, R., E.I.M Adil & N. Anita. Erlangga. Jakarta.
Chahal, P.S., D.S. Chahal, and G.B.B. Lee. 1996. Production of Cellulase in Solid State Fermentation with Trichoderma reesi MCG80 on Wheat Straw. Applied Biochemistry and Biotechnology. 57-58: 433-441.
Clark, K. 2007. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). http:/www.chem-is-try.org/. Diakses pada tanggal 10 Juni 2014.
Dachriyanus, 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi. Andalas University Press. Padang.
Day, R.A. dan Underwood, A.L. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. Erlangga. Jakarta.
Donderski,W. dan M. Tzrebiatowska. 2000. Influence of Physical and Chemical Factors on The Activity of Chitinases Produced by Planktonic Bacteria Isolated from Jezorak Lake. Polish Journal of Environmental Studies. 9(2); 77-82.
Dutta, K. P., Shipra Tripathi, Mehrotra, K. G., Joydeep Dutta. 2009. Perspectives for Chitosan Based Antimicrobial Films in Food Applications. Food Chemistry. 114: 1173-1182.
Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S. 1990. Kimia Organik Jilid 2. Erlangga. Jakarta.
Foucher, J.P., G.K. Westbrook, A. Boetius, S. Ceramicola, S. Dupre, J. Mascle, J. Mienert, O. Pfannkuche, C.Pierre, and D. Praeg. 2009. Structure and Drivers of Cold Seep Ecosystems. Oceanography. 22 : 92-109.
Gadgoli, C. 2006. Spectophotometric Method for Determination of Glucosamine in Tables. Saraswathi Vidya Bhavan’s College of Pharmachy. Sonarpada. Dombivli (East). 5: 83-84.
Gohel, V., A. Singh, M. Vimal, P. Ashwini, and H. S. Chatpar. 2006.
Bioprospecting and Antifungal Potential of Chitinolytic Mocroorganisms. African Journal of Biotechnology. 5(2): 54-72.
Gohel, V., P. Vyas and H.S. Chhatpar. 2004. Activity Staining Method of Chitinase on Chitin Agar Plate Through Polyacrylamide Gel Electrophoresis. African Journal of Biotechnology. 4: 87-90.
Holker, U.,M. Hofer, and J.Lenz. 2004. Biotechnological Advantages of Laboratory-Scale Solid State Fermentation with Fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 64: 175-186.
Hunger, M. and Weitkamp, J. 2001. In situ IR, NMR, EPR, and UV/Vis Spectroscopy: Tools For New Insight Into The Mechanisms of
Heterogeneous Catalysis. Angew. Chemistry International. 40: 2954-2971.
Iman, R. 2008. Sistem Operasi Fermentasi. Departemen Biologi FMIPA IPB. Bogor.
Jacyno, M. and Dean C.T. 2004. New High Sensitivity HPLC Assay For
Glucosamine Using ELSD. http:/www.dongmyung.co.kr/. Diakses pada tanggal 23 Juni 2014.
Junoto, F. 1995. Enzim Pangan. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Kuk, J. H., Jung W. J., Jo G. H., Kim Y. C., Kim K. Y., Park R. D. 2005.
Production of N-acetyl-β-Dglucosamine from chitin by Aeromonas sp. GJ-18 Crude Enzyme. Application Microbial Biotechnology. 68: 384-389.
Kumar, R.M.N.V. 2000. A Riview of Chitin and Chitosan Applications. React. Functional Polymer. 46: 1-27.
Kumirska, J., Czerwicka, M., Kaczynski, Z., Bychowska, A., Brzozowski, K., Thoming, J., Stepnowski, P. 2010. Application of Spectroscopic Methods for Structural Analysis of Chitin and Chitosan. Marine Drugs. 8: 1567-1636.
Kupiec, T. 2004. Quality-Control Analytical Methods: High-Performance Liquid Chromatography. International Journal of Pharmaceutical Compounding. 8(3): 223-227.
Lehninger, A.L. 2005. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry, oleh Thenawidjadja, M. Erlangga. Jakarta.
Lindsay, S. 1992. High Performance Liquid Chromatography. Wiley. New York.
Liu, D., Wei, Y., Yao, P., Jiang, L. 2006. Determination of Degree of Acetylation of Chitosan by UV Spectrofotometry Using Dual Standards. Carbohydrate Res. 341: 782-785.
Mahmoud, N.S., Ghaly, A.E., and Arab, F. 2007. Uncoventional Approach For Demineralization of Depr
