LAPORAN HASIL PENELITIAN TERAPAN UNIVERSITAS LAMPUNG

LAPORAN HASIL PENELITIAN TERAPAN UNIVERSITAS LAMPUNG

ENKAPSULASI FUKOSANTIN EKSTRAK ETANOL CYCLOTELLA STRIATA MENGGUNAKAN NANOPARTIKEL KITOSAN

TIM PENGUSUL

Dr. Eng. Ni Luh Gede Ratna Juliasih, M.Si.

NIDN: 0013077704 SINTA ID 6090809 Dr. Drs. Andi Setiawan, M.S.

NIDN: 0022095803 SINTA ID: 6670317

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

2021

i DAFTAR ISI

Halaman SAMPUL

DAFTAR ISI i

RINGKASAN ii

BAB 1 LATAR BELAKANG 1

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2

BAB 3 METODE 5

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 9

BAB 5 KESIMPULAN 14

DAFTAR PUSTAKA 15

LAMPIRAN

ii

ENKAPSULASI FUKOSANTIN EKSTRAK ETANOL Cyclotella striata MENGGUNAKAN NANOPARTIKEL KITOSAN

Ni Luh Gede Ratna Juliasih, Gisti Kusuma Rani, Wulandari, Anggi Lefiyani, Fauzia Sabrina, Zeily Nurachman, Andi Setiawan

RINGKASAN

Potensi bioaktivitas senyawa fukosantin, seperti efek antioksidan, anti-inflamasi, antikanker maupun skin photoprotection, telah menarik perhatian peneliti terkait kemungkinan berbagai aplikasi di sektor industri makanan, kosmetik dan farmasi. Fukosantin mungkin diproduksi secara kimiawi, tetapi ekstraksi dari sumber alam dianggap lebih hemat biaya, efisien dan ramah lingkungan. Oleh karena itu, identifikasi sumber fukosantin, mengetahui metode ekstraksi senyawanya secara efisien, studi kuantifikasi, pemurnian dan stabilisasi produknya, sangat penting untuk produksi masa depan dan komersialisasi fukosantin. Cyclotella striata merupakan salah satu sumber fukosantin alami yang ramah lingkungan dan berkelanjutan serta dapat dikultivasi secara mixotropic ataupun heterotropic. Penelitian sebelumnya telah berhasil menurunkan biaya produksi fukosantin dari C. striata dengan produksi di media limbah cair industri tahu. Namun, rendahnya kelarutan fukosantin dalam air dan stabilitasnya yang rendah cenderung menghambat dalam pemanfaataan senyawa tersebut secara luas, sehingga diperlukan strategi untuk meningkatkan kestabilan fukosantin, yaitu dengan teknik enkapsulasi. Penelitian ini bertujuan meningkatkan kestabilan fukosantin C. striata dengan memanfaatkan nanopartikel kitosan sebagai material enkapsulasi untuk fukosantin. Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi kultivasi Cyclotella striata pada media limbah cair industri tahu, ekstraksi dengan etanol dan pemurnian fukosantin dengan fraksinasi menggunakan teknik Medium Pressure Liquid Chromatography (MPLC), yang dilanjutkan dengan enkapsulasi fukosantin dengan kitosan. Produktifitas biomassa C. striata meningkat 50% di media limbah cair industri tahu 15% (±666,66 mg/L/hari). Setelah diekstraksi dengan etanol dan dimurnikan dengan teknik MPLC, karakterisasi dengan spektrofotometer uv vis menunjukkan puncak pada daerah λ 446 nm, yang merupakan karakteristik fukosantin.

Kitosan yang dibuat dari limbah kulit udang memberikan hasil analisis IR berupa serapan gugus –OH pada 3440 cm^-1, serapan gugus C=O pada 1600 cm^-1, serapan gugus CN pada 1332 cm^-1 yang menunjukkan pembentukan kitosan. Selanjutnya, hasil uji SEM pada kitosan- nanopartikel tampak terbentuknya gumpalan. Optimalisasi pembentukan kitosan-nanopartikel masih dalam optimasi. Luaran dari penelitian ini adalah publikasi di Jurnal Internasional AACL Bioflux (Q3), dan Seminar International di 2^nd Bioinformatics and Biodiversity Conference (BBC 2021).

Kata Kunci: Cyclotella striata, diatom, fukosantin, nanopartikel, kitosan

1 BAB 1

LATAR BELAKANG

Meningkatnya perhatian publik terhadap masalah kesehatan dan pencegahan penyakit telah menciptakan pasar global yang menguntungkan untuk produk nutraceutical yaitu senyawa bahan alam yang memberikan manfaat medis atau kesehatan, termasuk pencegahan dan pengobatan penyakit. Hal ini menyebabkan peningkatan dramatis dalam permintaan senyawa karotenoid pada umumnya dan fukosantin pada khususnya. Di sisi lain, Indonesia memiliki potensi keanekaragaman mikroorgasnisme laut dan kondisi geografis yang strategis, yang belum dimanfaatkan dengan maksimal.

Fukosantin tergolong senyawa xanthophyll karotenoid yang dapat ditemukan pada makroalgae dan mikroalgae laut. Potensi efek terapeutik fukosantin untuk tujuan kesehatan telah didokumentasikan dengan baik. Sejumlah karya ilmiah telah menguatkan manfaat fukosantin, termasuk antioksidan, antikanker, antihipertensi, antiradang, antidiabetik, antimetrisitas, pelindung saraf, kemampuan anti-angiogenik dan juga efek fotoprotektif [1-3].

Dengan mempertimbangkan sifat-sifat tersebut, molekul fukosantin memiliki potensi aplikasi di beberapa sektor industri seperti sektor makanan, kosmetik dan farmasi. Namun pemanfaatan fukosantin sebagai nutraceutical dalam makanan dan suplemen nutrisi saat ini terkendala oleh permasalahan rendahnya kelarutan dalam air, stabilitas yang buruk, dan ketersediaannya terbatas [4]. Selain itu, kesulitan dalam mencapai efektivitas biaya dalam produksi dan ekstraksi biomassa fukosantin menyebabkan produksi fukosantin dari makroalga ataupun mikroalga terbatas, meskipun proporsinya tinggi dalam karotenoid alami.

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan fukosantin hasil kultivasi Cyclotella striata menggunakan limbah tahu dan meningkatkan kestabilan produk fukosantin dengan memanfaatkan nanopartikel kitosan. Fukosantin adalah pigmen karotenoid alami. Dalam beberapa tahun terakhir, telah terbukti bahwa mengkonsumsi fukosantin memberikan berbagai manfaat kesehatan, termasuk anti-obesitas, antidiabetes dan intervensi tumor [5].

Namun, karena kesulitan dalam mencapai efektivitas biaya produksi dan ekstraksi biomassa fukosantin maka produksi fukosantin dari makroalga atau mikroalga masih sangat terbatas meskipun proporsinya tinggi dalam karotenoid alami.

Hasil kajian yang telah dilakukan pada penelitian sebelumnya telah mampu mengatasi tingginya biaya produksi biomassa mikroalga dengan memanfaatkan limbah cair industri tapioka sebagai media tanam [6]. Selain itu, kultivasi mikroalga C. striata dengan limbah cair industri tahu juga telah dilakukan untuk mengatasi tingginya biaya produksi. Melalui

2

kegitan tersebut diperoleh gambaran bahwa kendala biaya produksi untuk mendapatkan fukosantin dapat diturunkan. Untuk ketidakstabilan fukosantin, maka nano/mikro-enkapsulasi merupakan teknologi yang ditawarkan untuk mengatasi permasalahan tersebut.

Faktanya, ekspansi pasar fukosantin diharapkan mencapai $ 120 juta pada tahun 2022 [7]. Meskipun demikian, komersialisasi dan produksi senyawa ini masih harus menghadapi tantangan tertentu, karena sintesis kimianya merupakan proses yang kompleks dan tidak efisien, serta metode ekstraksi dari organisme laut belum terstandarisasi [8]. Untuk mencapai keuntungan suatu produk, maka produk itu harus diperoleh dengan mudah dan cepat, dengan menggunakan teknologi berbiaya rendah [9]. Meskipun fukosantin dan karotenoid lainnya mungkin disintesis secara artifisial, namun ekstraksi senyawa tersebut dari sumber alam memberikan beberapa keuntungan, seperti akses yang mudah ke sumber, produksi yang ekonomis dan ramah lingkungan, serta menghindari penggunaan senyawa kimia berbahaya. Urgensi penelitian ini adalah produksi fukosantin berbiaya rendah dan enkapsulasi produk fukosantin untuk kestabilannya. Kajian mengenai studi terkait enkapsulasi fukosantin sangat penting untuk mendukung komersialisasi fukosantin.

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

Sejalan dengan kemajuan teknologi dan informasi, masyarakat saat ini terus mengejar kualitas hidup yang lebih baik dan gaya hidup yang lebih sehat. Hal ini berkaitan dengan kecenderungan konsumen semakin memperhatikan kesehatannya dengan mengkonsumsi bahan - bahan nutraceutical, seperti vitamin dan karotenoid. Senyawa fukosantin, merupakan karotenoid yang berasal dari organisme laut, dengan ikatan alenik yang khas pada gugus 5,6- monoepoksida dan hidroksil, merupakan pigmen aksesori dalam kloroplas dan terlibat dalam fotosintesis.

Fukosantin diketahui memiliki banyak khasiat yang bermanfaat, termasuk antioksidan [10], antikanker [5, 11] dan lain lain. Sebuah studi sebelumnya menyelidiki efek suplementasi fukosantin pada lemak tubuh pada manusia yang kelebihan berat badan [12].

Hasil penelitian menunjukkan bahwa subjek dalam kelompok perlakuan (fukosantin 2-4 mg/hari asupan) menunjukkan penurunan berat badan yang signifikan, dibandingkan dengan subjek dalam kelompok plasebo. Selain itu, penelitian lain mengilustrasikan bahwa konsumsi susu yang diperkaya fukosantin mengarah pada peningkatan bio-aksesibilitas fukosantin baik secara model in vitro maupun in vivo [13].

3

Mempertimbangkan uraian di atas, fukosantin dapat dianggap sebagai bahan nutraceutical yang dapat digunakan dalam industri makanan dan bidang lain untuk merancang nutraceuticals baru dan lebih baik. Namun, seperti hal senyawa karotenoid lainnya, fukosantin dipengaruhi oleh cahaya, oksigen, panas, dan pH. Karena banyak keterbatasannya, seperti kelarutan dalam air yang buruk (0,5 ppm), titik leleh tinggi (166−168°C) ), variabilitas kimiawi, dan bioaccessibility rendah, ada banyak tantangan dalam penggabungannya ke dalam produk nutraceutical.

Partikel berukuran nano merupakan salah satu cara mengatasi ketidaksetabilan senyawa bioaktif. Hasil studi menunjukkan bahwa teknologi nanopartikel (Np) telah banyak digunakan di sektor biomedis untuk mengobati penyakit seperti diabetes dan kanker [14].

Namun, dalam menginovasi sistem transportasi ataupun pelindung senyawa bioaktif, banyak tantangan yang perlu dipecahkan; salah satunya adalah pemilihan material nano.

Nanopartikel dapat dibuat dari berbagai bahan, tetapi beberapa bahan nanopartikel mungkin ada yang berbahaya bagi manusia karena dapat menimbulkan toksisitas bagi tubuh dan lingkungan selama produksi, aplikasi, dan pembuangannya. Beberapa bahan untuk pembentukan nan, terutama yang berbahan dasar logam dilaporkan menyebabkan efek samping yang tidak diinginkan pada organisme hidup. Misalnya, konsumsi perak yang berlebihan dapat menyebabkan argyria [15].

Di antara semua nanopertikel (Np) yang ada, biopolimer yang menghasilkan Np yang baik adalah kitosan (C = chitosan) karena sifat khususnya. Ia memiliki karakteristik antimikroba dan mampu menyembuhkan luka [16]. Selain itu, C adalah karbohidrat biodegradable dan biokompatibel. C juga telah banyak digunakan di sektor medis, misalnya, dalam meningkatkan pengiriman obat kanker, silibinin [17]. Hal ini dicapai dengan memfungsikan C secara hidrofobik, memungkinkannya membawa dan melepaskan obat hidrofobik dengan mudah. C adalah polimer yang sangat dapat dimodifikasi yang dapat dicangkokkan atau diikat silang untuk menghasilkan turunan. Kehadiran gugus amino dan hidroksil dalam C membuatnya menjadi elemen yang dapat dimodifikasi untuk berbagai bidang studi [18].

Nanopartikel kitosan (CNp) biasanya dibuat dengan metode gelasi ionik, yang menggambarkan reaksi ikatan silang Kitosan (C) dengan natrium tripolifosfat (STPP = sodium tripolyphosphate). C bermuatan positif berinteraksi dengan crosslinker bermuatan negatif yang disebut natrium trifolifosfat (STPP). Dilaporkan dalam sebuah penelitian bahwa kitosan (0,1%, 0,2%, 0,3%) dicampur dengan STPP (0,02%, 0,05%, 0,08%) pada suhu kamar untuk membuat CNp. Dalam studi lain, gelasi ionik kitosan dengan STPP juga diterapkan

4

untuk meningkatkan stabilitas dan menghasilkan nanopartikel kitosan dengan berat molekul rendah monodisperse. Melalui optimasi proses, nanopartikel dengan diameter lebih kecil (

±138 nm) dan stabilitas penyimpanan yang baik pada suhu kamar berhasil diproduksi.

Optimasi utama difokuskan pada penurunan konsentrasi asam asetat dan suhu lingkungan.

Namun, banyak parameter lain yang dipertimbangkan: konsentrasi kitosan dan larutan STPP, pH, dan suhu larutan kitosan dan kecepatan pengadukan. Suhu lingkungan selama cross- linking memainkan peran penting dalam membentuk Np yang berkualitas tinggi. Suhu lingkungan rendah lebih disukai karena menyebabkan laju pendinginan suspensi yang lebih cepat, menghasilkan lebih banyak ikatan hidrogen interaksi antara kitosan dan molekul air.

Selain itu, pada suhu lingkungan rendah molekul kitosan menjadi kaku lebih cepat dan akhirnya menstabilkan struktur partikel [19-20].

Nanopartikel kitosan bermuatan fukosantin menunjukkan ketersediaan hayati yang lebih baik.Tidak ada laporan tentang produk terkait penggunaan ekstrak fukosantin yang dienkapsulasi menggunakan nanopartikel berbahan biopolimer alami kitosan.

Mempertimbangkan hal tersebut maka tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempersiapkan dan mengkarakterisasi nanopartikel kitosan yang mengandung fukosantin dengan aktivitas antioksidan yang diawetkan dengan sifat pelepasan terkendali.

ROADMAP PENELITIAN

Enkapsulasi Fukosantin C. striata dari Limbah Cair Industri Tahu

Gambar 1. Road map pengembangan produk antioksidan dari C. sriata dalam media kultivasi limbah cair industri tahu C. striata

Lab Scale

Aklimatisasi pada media limbah cair industri tahu

• Optimasi produksi, ekstraksi, dan pemurnian

• Karakterisasi antioksidan fukosantin

Pilot Plant 40-60 L

• Validasi antioksidan fukosantin

• Enkapsulasi fukosantin

• Persiapan produksi

• Riset pasar

• prototipe

• Demonstrasi prototipe

• Validasi enkapsulasi

2019 2020 2021 2022-

2023

2024- 2025 Inovasi Produk Fukosantin

5 BAB 3 METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan bulan Mei – Oktober 2021 di UPT LTSIT Unila.

Bahan dan Alat

Kulit udang, natrium tripolifosfat (STPP), asam asetat glasial, natrium hidroksida (NaOH), asam klorida (HCl), etanol (EtOH), dan Metanol (MeOH) dibeli dari Merck-Sigma.

Fukosantin (Fx) diperoleh dari hasil kultivasi C. striata pada media limbah tahu.

Penyiapan Fukosantin

Kultur C. striata ditanam di media limbah cair industri tahu 30% dalam fotobioreaktor (PBR) ukuran 20-40 L, kerapatan sel 2 х 10⁵ sel mL^-1, diberikan aerasi dan pencahayaan intensitas 95 μmol m⁻² s⁻¹ pada suhu ruang dengan siklus terang/gelap = 12 : 12 selama 12 hari.

Pemanenan dilakukan dengan sentrifugasi 4000 rpm pada suhu 4°C selama 5 menit.

Biomassa C.striata selanjutnya ditimbang, diekstraksi dengan EtOH (12 g per 100 mL), disentrifugasi 4000 rpm selama 5 menit. Supernatannya difraksinasi menggunakan MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) kolom sepacore silika, laju alir EtOH 25 mL/min dengan detektor PDA (Photo Diode Array) pada λ364 nm, λ254 nm, dan λ220 nm. Setiap fraksi ditampung menggunakan pengumpul fraksi, selanjutnya dievaporasi dengan Rotary Evaporator Buchi/Ratavor R-20 pada tekanan 250 mBar.

Persiapan Kitosan

Sebanyak 25 g kulit udang ditambahkan 250 mL NaOH 4% (b/v). Larutan diatur pada suhu 80°C selama 1 jam. Selanjutnya larutan disaring dan dicuci menggunakan akuades kemudian dikeringkan pada suhu 60°C. Demineralisasi dilakukan dengan melarutkan 5 g serbuk deprotonasi kering ke dalam 75 mL HCl 1 M (v/v) kemudian diaduk selama 1 jam pada suhu kamar dan disaring. Residu dicuci dengan aquadest dan dikeringkan pada suhu 60°C. Hasil demineralisasi dilarutkan dalam 30 mL NaOCl 4% dan diaduk selama 1 jam pada suhu kamar kemudian disaring. Residu kemudian dicuci dengan aquades dan dikeringkan pada suhu 60°C. Hasil yang disebut kitin ini dikarakterisasi dengan spektrofotometer FTIR (Agilent Technologies Carey 630 FTIR). Selanjutnya, 1,5 g kitin dilarutkan dalam 22,5 mL NaOH 40% sambil direfluks pada suhu 80°C selama 1 jam, disaring dan dicuci dengan akuades

6

kemudian dikeringkan pada suhu 60°C. Hasil yang disebut kitosan ini dikarakterisasi dengan Spektrofotometer FT-IR.

Preparasi modifikasi kitosan

Kitosan (0,1 g) dilarutkan dalam 100 mL asam asetat glasial 1%. Pada saat yang sama, 0,25 g STPP dilarutkan ke dalam 100 mL akuades. Larutan STPP ditambahkan ke dalam larutan kitosan tetes demi tetes sambil diaduk selama 1 jam. Setelah itu, suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 600 rpm selama 1 jam. Hasilnya dibekukan dan dikarakterisasi dengan PSA (Particle Size Analyzer) dan SEM (ScanningScanning Electron Microscope).

Pembuatan Nanopartikel Kitosan-Fukosantin (CNp-Fx)

CNp dibuat dengan menggunakan metode gelasi ionik seperti yang dilaporkan oleh Chen et al. [21]. sekitar 1,0 mL asam asetat 1,0% ditambahkan ke kitosan, dan diencerkan hingga membentuk konsentrasi 0,5 mg/mL larutan kitosan (C). Selanjutnya, pH larutan C disesuaikan 5.0 dengan menambahkan 1 M larutan NaOH. Cross linkker STPP dilarutkan dengan aquadest hingga didapat konsentrasi 0,7 mg/mL, dibuat menjadi pH 2,0 dengan menggunakan HCl 1,0 M. Selanjutnya CNp dibentuk dengan menambahkan 600 L C ke larutan STPP (volume kisaran 0 ~ 300 L). Campuran tersebut kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 20 menit untuk memurnikannya.

Nanokitosan-Fukosantin CNp-Fx) dibuat dengan menuangkan kira-kira terlebih dahulu 10,0 mg Fx ke dalam 10,0 mL larutan STPP 0,7 mg/mL untuk membuat konsentrasi stok Fx 5,7 mM, selanjutnya diencerkan menjadi tiga konsentrasi yang berbeda. Sebanyak 250 L masing-masing Fx yang diencerkan tersebut, ditambahkan ke dalam tiga tabung berbeda berisi campuran 600 L larutan kitosan 0,5 mg/mL, sehingga diperoleh tiga variasi CNp-Fx.

Karakterisasi nanopartikel

Ukuran partikel dan potensial zeta

Distribusi ukuran partikel dianalisis dengan PSA (Particle Size Analyzer), sedangkan stabilitas CNp diukur dengan potensial zeta (Malvern Instruments Ltd., Malvern, U.K.).

Semua pengukuran dilakukan tiga kali pengulangan (triplo).

7 Analisis morpologi partikel

Morfologi partikel diperiksa dengan scanning electron microscope (SEM). Nanopartikel kitosan (CNp) dipisahkan dengan sentrifugasi pada 40.000 rpm selama 30 menit. Supernatan didekantasi dan pelet dibekukan dengan freeze dry dan diperiksa dengan SEM pada tegangan percepatan 15,0 kV.

Encapsulation Efficiency (EE) dan Loading Efficiency (LE)

EE fukosantin ditentukan dengan pemisahan nanopartikel dari media berair yang mengandung fukosantin yang tidak terkait menggunakan ultrasentrifugasi pada 40.000 rpm, 4°C selama 30 menit. Jumlah fukosantin dalam supernatan diukur dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Kolom C18 : 250 x 4,6 mm digunakan sebagai fase diam. Fase gerak terdiri dari 40% metanol dan 0,06% asam format. Sistem dijalankan secara isokratis dengan laju alir 0,8 mL/menit, injeksi sampel 20 μL, dan deteksi pada 327 nm menggunakan Photodiode Array Detector (PDA). Semua pengukuran dilakukan triplo. Encapsulation Efficiency (EE) dan Loading Efficiency (LE) dari fukosantin dihitung seperti persamaan 1 dan 2.

EE (%) = (berat fukosantin dalam nanopartikel x 100)/berat total fukosantin...1 LE (%) = (berat fukosantin dalam nanopartikel x100)/berat CNp-Fx...2

Pengaruh pH pada nanpartikel

pH merupakan salah satu faktor terpenting yang mempengaruhi potensial zeta dan ukuran nanopartikel. Nanopartikel dititrasi menggunakan 0,1 N NaOH untuk mengetahui titik isoelektrik sampel hingga pH 10. Titrasi dilakukan dan perubahan pH diplot sebagai fungsi dari potensial zeta.

8 Diagram Alir Penelitian

Gambar 2. Diagram alir penelitian

9 BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kultivasi C. striata

Penelitian sebelumnya, C. striata telah berhasil dikultivasi pada media limbah cair industri tahu hingga konsentrasi limbah cair industri tahu mencapai 15%. Hal ini menunjukkan bahwa C. striata dapat tumbuh dan beradaptasi dengan media limbah cair industri tahu, yang artinya media limbah cair industri tahu dapat menurunkan biaya produksi biomassa C. striata. Selain itu, pemanfaatan media limbah cair industri tahu sebagai media kultivasi C. striata dapat menurunkan potensinya sebagai pencemar lingkungan.

Hasil kultivasi C. striata dapat dilihat pada Gambar 3, dari hari ke 1 sampai dengan hari ke 14 terjadi perubahan warna kultur menjadi semakin pekat dan kepadatan sel yang semakin meningkat. Hasil pengamatan pada kurva pertumbuhan menujukkan terjadi fasa adaptasi di hari ke 1-3, fase eksponensial terjadi di hari ke 4-9, selanjutnya adalah fase stasioner dan fase kematian. Pertumbuhan C.striata dihitung dengan menggunakan haemocytometer yang dibantu dengan mikroskop berdasarkan kepadatan sel. Berat biomassa yang diperoleh dari kultivasi C. striata pada media limbah cair industri tahu adalah 6,0 g/L, lebih banyak dari biomassa C. striata yang dikultivasi pada media standar (3,3 g/L) dengan kenaikan berat biomassa sekitar 50%, sehingga produktivitas biomassa C. striata pada media limbah cair industri tahu (PB) dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut : PB (mg/L/hari) = (6000 mg/L)/(9 hari) = 666, 66 mg/L/hari.

Gambar 3. Kurva Pertumbuhan C.striata selama 14 hari

0 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000

0 5 10 15

Kepadatan Sel

Waktu (Hari)

10 Ekstraksi Fukosantin

Ekstraksi fukosantin dari biomassa basah C. striata sebanyak 4,5 gram dilakukan menggunakan EtOH 40 mL [22], karena EtOH merupakan pelarut yang aman dalam food grade. Proses ekstraksi dilakukan pada suhu kamar, karena senyawa fukosantin tidak stabil terhadap suhu tinggi. Proses ekstraksi menggunakan suhu tinggi dapat merusak senyawa fukosantin. Selanjutnya, ekstrak etanol disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit [23], untuk memudahkan pemisahan ekstrak. Gambar 4 menunjukkan ekstrak etanol dari C. striata.

Gambar 4. Ekstrak etanol C. striata

Identifikasi Fukosantin

Identifikasi fukosantin dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

Identifikasi senyawa fukosantin pada ekstrak kasar C.striata dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pada plat silika dengan fasa gerak etanol. Senyawa fukosantin memberikan noda kuning pada plat KLT. Berdasarkan hasil uji KLT diperoleh spot senyawa dengan warna kuning, yang diduga sebagai senyawa fukosantin dengan Rf 0,8. Gambar 5 menunjukkan hasil uji KLT fukosantin C. striata.

Gambar 5. Hasil KLT ekstrak kasar C. striata.

11

Fraksinasi menggunakan Medium Pressure Liquid Chromatography (MPLC).

Ekstrak C.striata selanjutnya difraksinasi menggunakan MPLC. Kromatogram dari proses MPLC dapat dilihat di Gambar 6.

Gambar 6. Kromatogram hasil MPLC senyawa fukosantin

Intensitas serapan pada 220 nm terlihat pada puncak biru muda, dimana semua senyawa karbon terdeteksi pada panjang gelombang ini, pada 364 nm teridentifikasi adanya gugus kromofor dan auksokrom, dan 254 nm dikategorikan sebagai senyawa dengan ikatan rangkap terkonjugasi. Fukosantin memiliki tujuh ikatan rangkap terkonjugasi sehingga mengabsorbansi kuat di daerah UV. Intensitas serapan yang diperoleh dari kromatogram pada MPLC menunjukkan bahwa metode ini dapat digunakan sebagai metode efektif untuk fraksinasi senyawa fukosantin .

Identifikasi senyawa fukosantin dengan Spektrofotometer UV-Vis

Kandungan fukosantin menunjukkan adanya puncak pada rentang panjang gelombang sekitar 443-449 nm seperti pada Gambar 7. Rentang pada puncak tersebut umumnya telah sesuai dengan penyerapan cahaya biru yang terlibat dalam sintesis karatenoid seperti fukosantin [22].

Hasil analisis lebih lanjut aktivitas antioxidant dari fukosantin dilakukan menggunakan voltammetri. Nilai potensial oksidasi fukosantin di daerah sekitar 0,45 V menunjukkan bahwa senyawa fukosantin yang diperoleh memiliki aktivitas antioksidan. Hal ini didukung dengan pernyataaan Amidi et al.,(2011) [24] yang menyatakan bahwa senyawa yang

12

memiliki potensi oksidasi lebih rendah atau sama dengan 0,45 V memiliki aktivitas antioksidan yang menjanjikan. Ikatan alenik bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan pada fukosantin. Selain itu, fukosantin memiliki enam atom oksigen yang menyebabkannya lebih sensitif terhadap radikal terutama dalam kondisi anoksik. Fukosantin juga mengandung gugus karbonil ,β-tak jenuh yang dapat berfungsi sebagai akseptor [25].

Gambar 7.Spektrum hasil analisis fukosantin ekstrak C. striata

Pembuatan kitin kitosan dari kulit udang

Saat ini limbah kulit udang merupakan sumber kitin dan kitosan yang potensial. Melalui proses kimia, kitin dan kitosan dapat diekstraksi dari limbah cangkang udang dengan cepat dan murah. Proses kimia dilakukan melalui tahapan deproteinasi, demineralisasi, depigmentasi dan asetilasi. Hasil analisis kitosan dapat dilihat pada Gambar 8. Spektrum tersebut menggambarkan karakteristik serapan –OH, C=O, dan C-O yang mencirikan senyawa kitin.

Analisis spektrum IR lebih lanjut menunjukkan bahwa puncak serapan masih teramati pada 1600 cm^-1. Hal ini menunjukkan bahwa gugus fungsi karbonil C=O belum terdeasetilasi dengan baik. Proses deasetilasi pada basa kuat menyebabkan hilangnya gugus asetil pada kitin dengan memutus ikatan antara karbon pada gugus asetil dan nitrogen pada gugus amina.

Konsentrasi NaOH yang tinggi dapat menghasilkan kitosan dengan tingkat deasetilasi yang

13

tinggi. Oleh karena itu, peningkatan kualitas kitosan perlu dilakukan untuk memperoleh nanokitosan yang lebih baik.

Gambar 8. Spektrum IR kitosan dari limbah kulit udang

Pembuatan Nanopartikel Kitosan-Fukosantin (CNp-Fx)

Kitosan memiliki karakteristik biokompatibilitas yang baik dan kemampuannya untuk meningkatkan permeabilitas membran membuat kitosan paling menjanjikan dalam pembuatan nanopartikel, karena memiliki kemampuan untuk membentuk membran [26].

Modifikasi fisik kitosan meliputi perubahan ukuran partikel atau butir kitosan menjadi lebih kecil untuk penggunaan yang lebih luas, yaitu modifikasi ukuran nanopartikel [27].

Nanopartikel memiliki sifat yang sangat spesifik, dengan luas permukaan yang tinggi dapat meningkatkan terjadinya reaksi kimia yang lebih banyak.

Metode yang paling umum dalam pembuatan nanopartikel adalah dengan metode gelasi ionik menggunakan magnetic stirrer. Metode gelasi ionik dapat dilakukan dengan mencampurkan polimer kitosan dengan polianion natrium tripolifosfat (STPP) yang menghasilkan interaksi antara muatan positif pada gugus amino kitosan dengan muatan tripolifosfat. Tripolifosfat digunakan karena dianggap sebagai agen pengikat silang terbaik (Abdel-Hafez et al., 2018). Modifikasi kitosan dengan menggunakan Na-TPP bertujuan untuk meningkatkan kelarutan kitosan dalam air. Na-TPP bila dilarutkan dalam air akan memberikan ion hidroksil sebagai gugus donor elektron (Esquivel, et al., 2015). Interaksi yang timbul antara kitosan dan Na-TPP menyebabkan jarak antar rantai kitosan menjadi renggang sehingga polikation kitosan memungkinkan berinteraksi dengan senyawa bioaktif.

Perhitungan partikel modern umumnya menggunakan analisis citra atau semacam

14

penghitungan partikel seperti PSA, masih dalam tahap optimasi. Hasil citra SEM untuk CNp- s ditunjukkan pada Gambar 9. Berdasarkan pengamatan dengan SEM dapat diketahui bahwa pembentukan gumpalan dari CNp-s diperoleh setelah proses freeze drying dan tidak dapat terdispersi kembali dalam pelarut berair. Proses penggumpalan CNp yang dibuat dengan gelasi ionik, seperti dijelaskan di atas dapat disebabkan oleh reaksi crosslink yang tidak lengkap. Hal ini disebabkan adanya gugus asetil pada kitosan yang belum mengalami deasetilasi.

Gambar 9. Gambar SEM CNp-s yang disiapkan menggunakan metode gelasi ionik

BAB V KESIMPULAN

Kesimpulan

Fukosantin dari C. striata diekstraksi menggunakan etanol dan menunjukkan serapan pada panjang gelombang maksimum 446 nm pada spektrofotometer uv-vis, yang menunjukkan karakteristik fukosantin. Hasil analisis produk kitosan menggunakan IR menunjukkan serapan gugus –OH pada 3440 cm^-1, serapan gugus C=O pada 1600 cm^-1, serapan gugus CN pada 1332 cm^-1 yang menunjukkan penyerapan senyawa kitin dan kitosan. Selanjutnya, hasil uji SEM pada kitosan-nanopartikel tampak kurang berhasil karena teramati terbentuknya gumpalan. Optimalisasi pembentukan kitosan-nanopartikel masih dalam optimasi.

15 Saran

Masih perlu dilakukan optimalisasi pembentukan kitosan nanopartikel untuk memperoleh CNp dengan derajat asetilasi yang tinggi. Selanjutnya, uji PSA, potensial zeta dan uji HPLC dilakukan untuk konfirmasi stabilitas nanopartikel kitosan-fukosantin (CNp-Fx) dan

perhitunganEncapsulation Efficiency (EE) serta Loading Efficiency (LE) dari fukosantin.

DAFTAR PUSTAKA

[1] Méresse, S., Fodil, M., Fleury, F., Chénais, B. 2020. Review : Fucoxanthin, A Marine- Derived Carotenoid from Brown Seaweeds and Microalgae: A Promising Bioactive Compound for Cancer Therapy. Int. J. Mol. Sci. 21: 9273. doi:10.3390/ijms21239273.

[2] Tavares, R.S.N., Kawakami, C.M., Pereira, K.C., Amaral, G.T.Benevenuto, C.G., Maria- Engler, S.S., Colepicolo, P., Debonsi, H.M., Gaspar, L.R. 2020. Fucoxanthin for Topical Administration, a Phototoxic vs. Photoprotective Potential in a Tiered Strategy Assessed by In Vitro Methods. Antioxidants. 9 : 328. doi:10.3390/antiox9040328.

[3] Maeda, H. 2015. Nutraceutical Effects of Fucoxanthin for Obesity and Diabetes Therapy : A Review. J.Oleo.Sci. 64 (2) : 125-132.

[4] Huang, Z., Xu, L., Zhu, X., Hu, J., Peng, H., Zeng, Z., Xiong, H. 2017. Stability and Bioaccessibility of Fucoxanthin in Nanoemulsions Prepared from Pinolenic Acid- contained Structured Lipid. De Gruyter. doi.org/10.1515/ijfe-2016-0273.

[5] Satomi, Y. 2017. Antitumor and Cancer-preventative Function of Fucoxanthin: A Marine Carotenoid. Anticancer Research. 37: 1557-1562. doi:10.21873/anticanres.11484.

[6] Juliasih, N.L.G.R., Utami, S., Setiawan, A. 2020. Evaluation on The Growth of Nannochloropsis sp. from Lampung Area in The Biogas Effluent of Tapioca Industry.

IOP Conf. Ser.: Mater. Sci. Eng. 673 012020. doi:10.1088/1757-899X/673/1/012020 [7] Research, I.M. Global Fukosantin Market Report 2018. 2018. Available online:

https://www.businessindustryreports.com/report/102177/global-fukosantin-market report- 2018 (accessed on 12 February 2021).

[8] Kanda, H., Kamo, Y., Machmudah, S., Wahyudiono, Goto, M. 2014. Extraction of Fucoxanthin from Raw Macroalgae Excluding Drying and Cell Wall Disruption by Liquefied Dimethyl Ether. Mar. Drugs .12 : 2383-2396. [CrossRef]

16

[9] Raguraman, V., MubarakAli, D., Narendrakumar, G., Thirugnanasambandam, R., Kirubagaran, R., Thajuddin, N. 2018. Unraveling Rapid Extraction of Fucoxanthin from Padina tetrastromatica: Purification, Characterization and Biomedical Application.

Process Biochem. 73 : 211–219. [CrossRef]

[10] Abdul, Q. A., Choi, R. J., Jung, H. A., Choi, J. S. 2016. Health Benefit of Fucosterol from Marine Algae: A Review. J. Sci. Food Agric. 96 : 1856-1866.

[11] Kumar, S., Hosokawa, M., Miyashita, K. 2013. Fucoxanthin: A Marine Carotenoid Exerting Anti-Cancer Effects by Affecting Multiple Mechanisms. Mar. Drugs. 11 : 5130-5147.

[12] Li, Y., Iwata, K., Sonoda, K., Shengquan, M. 2015. Focoxanthin Supplementation Reduces Body Fat in Over Weight Humans: A Randomized, Placebo Controlled Study.

Jpn. Pharmacol. Ther. 9 : 1317-1322.

[13] Mok, I.-K., Lee, J.K., Kim, J.H., Pan, C.-H., Kim, S.M. 2018. Fucoxanthin Bioavailability from Fucoxanthin-Fortified Milk: In Vivo and In Vitro Study. Food Chem. 258 : 79−86.

[14] Yao,Y., Zhou, Y., Liu, L., Xu, Y., Chen, Q., Wang, Y., Wu, S., Deng, Y., Zhang, J., Shao, A. 2020. Nanoparticle-Based Drug Delivery in Cancer Therapy and Its Role in Overcoming Drug Resistance. Front. Mol. Biosci.7:193. doi: 10.3389/fmolb.2020.00193 [15] Selim, H.M., Mohamed, D.S., Eskander, H.M.G. 2017. Silver Nanoparticles: Synthesis,

Medical Application, and Toxicity Effects. Int. J. Nanotech. Allied. Sci. 1(1): 45-53.

[16] Kravanja, G., Primožiˇc, M., Knez, Z., Leitgeb, M. 2019. Review : Chitosan-Based (Nano) Materials for Novel Biomedical Applications. Molecules. 24 : 1960.

doi:10.3390/molecules24101960

[17] Raval, M., Patel, P., Airao, V. et al. 2021. Novel Silibinin Loaded Chitosan-Coated PLGA/PCL Nanoparticles Based Inhalation Formulations with Improved Cytotoxicity and Bioavailability for Lung Cancer. BioNanoSci. 11. 67-83. doi.org/10.1007/s12668- 020-00797-

[18] Jangong, O.S., Gareso, P.L., Mutmainna, I., Tah, D. 2019. Fabrication and Characterization starch/chitosan Reinforced Polypropylene as Biodegradable. The 3^rd International Conference on Science Journal of Physics: Conference Series 1341 (2019) 082022 IOP Publishing. doi:10.1088/1742-6596/1341/8/082022

[19] Nguyen, T.V., Nguyen, T.T.H., Wang, S.L., Vo, T.P.K., Nguyen, A.D. 2017. Preparation of Chitosan Nanoparticles by TPP Ionic Gelation Combined with Spray Drying, and The

17

Antibacterial Activity of Chitosan Nanoparticles and A Chitosan Nanoparticle–

Amoxicillin Complex. Res. Chem. Intermed. 43 : 3527-3537.

[20] Sreekumar, S., Goycoolea, F.M., Moerschbacher, B.M., Rivera-Rodriguez, G.R. 2018.

Parameters Influencing The Size of Chitosan-TPP nano- and Microparticles. Sci. Rep. 8 : 4695.

[21] Chen, Z., Shu, G., Taarji, N., Barrow, C. J., Nakajima, M., Khalid, N., Neves, M. A.

2018. Gypenosides As Natural Emulsifiers for Oil-in Water Nanoemulsions Loaded with Astaxanthin: Insights of Formulation, Stability and Release Properties. Food Chem. 261 : 322-328.

[22] Wang, L.J., Fan, Y., Parsons, R.L., Hu, G.R., Zhang, P.Y., Li, F.L., 2018. A rapid method for the determination of fucoxanthin in diatom. Marine Drugs 16,33.

[23] Chen, C., Yeh, K., Aisyah, R., Lee, D., Chang, J. 2011. Cultivation Photobioreactor Design and Harvesting of Microalgae for Biodiesel Production: a Critical Review.

Bioresource Technology. 102 (1):71-81.

[24] Amidi, M., de Raad, M., Crommelin, D. J. A., Hennink, W.E., Mastrobattista, E. 2011.

Antigen-expressing immunostimulatory liposomes as a genetically programmable synthetic vaccine. Syst Synth Biol 5:21–31. DOI 10.1007/s11693-010-9066-z

[25] Park H. J, Lee M. K, Park Y. B, Shin Y. C and Choi M. S. 2011. Beneficial effects of Undaria pinnatifida Ethanol Extract on Diet-inducedinsulin Resistance in C57BL/6J mice. Food Chem.

Toxicol. 49: 727 - 733.

[26] Jiménez-Gómez, C. P. and Cecilia, J.A. 2020. Review : Chitosan: A Natural Biopolymer with a Wide and Varied Range of Applications.Molecules, 25, 3981; doi:10.3390/molecules25173981

[27] Torres-Giner, S., Prieto, C., Lagaron, J. M. 2020. Editorial Nanomaterials to Enhance Food Quality, Safety, and Health Impact.Nanomaterials, 10, 941; doi:10.3390/nano10050941

[28] Abdel-Hafez, S. M., Hathout, R. M., Sammour, O.A. 2018. Tracking the Transdermal Penetration Pathways of Optimized Curcumin-loaded Chitosan Nanoparticles via Confocal Laser Scanning Microscopy. International Journal of Biological Macromolecules 108: 753-764

[29] Esquivel, R., Juárez, J., Almada, M., Ibarra, J., Valdez, M.A. 2015. Synthesis and Characterization of New Thiolated Chitosan Nanoparticles Obtained by Ionic Gelation Method. International Journal of Polymer Science, Vol. 2015, Article ID 502058, 18 pages, 2015. https://doi.org/10.1155/2015/502058

18 Lampiran 1.

Abstrak Seminar International 2^nd Bioinformatics and Biodiversity Conference 2021

Preparation and Characterization of Nano Chitosan from Shrimp Shell Waste, Vannamei sp.

1 Ni Luh Gede Ratna Juliasih, ¹Gisti Kusuma Rani, ¹Wulandari, ¹Anggi Lefiyani, ¹Fauzia Sabrina, ²Zeily Nurachman, ^1*Andi Setiawan

1 Department of Chemistry, Faculty of Matematic and Natural Sciences, Lampung University, Jl. Sumantri Brojonegoro No. 1 Bandar Lampung 35145, Indonesia

2Biochemistry Division, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Institut Teknologi Bandung, Jl. Ganesha 10, Bandung 40231, Indonesia.

Corresponding author: A. Setiawan, andi.setiawan@fmipa.unila.ac.id

Abstract. The present work aims to prepare an ecofriendly and effective material of chitosan- nanoparticle. Chitosan nanoparticles were prepared from the extracted chitosan of shrimp shells waste using a traditional ionic gelation method in presence of sodium tripolyphosphate (STTP) as a cross-linker. To confirm the polymer structure and its characteristics, the prepared nanoparticles were characterized using FT-IR and SEM. The IR spectrum shows the absorption characteristics of –OH, C=O, and C-O which characterize chitin compounds. While the results of the analysis of chitosan products using IR showed the absorption of the –OH group at 3440 cm^-1, the absorption of the C=O group at 1600 cm^-1, the absorption of the CN group at 1332 cm^-1 which indicated the formation of chitosan compounds. However, it also shows that the absorption peak is still observed at 1600 cm^-1 in the IR spectrum of chitosan, which is indicates that the C=O carbonyl functional group has not been well deacetylated. As a conclusion that the process of making chitosan nanoparticles is strongly influenced by the quality of the chitosan used. The low degree of deacetylation will inhibit the crosslinking reaction between STTP and the NH2 group, so that the formation of nanoparticles can be inhibited. Optimization of the formation of nanoparticles is still being pursued through improvements in the deacetylation stage.

Keywords: chitin, chitosan-nanoparticle, ionic gelation, shrimp shell waste.

19 Lampiran 2. Draft Publikasi

20

Encapsulated Fucoxanthin in Chitosan-Nanoparticles: A novel strategy for retained antioxidant

1Ni Luh Gede Ratna Juliasih, ¹Gisti Kusuma Rani, ²Zeily Nurachman, ^1*Andi Setiawan

1Departement of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Lampung University, Jl. Soemantri Brojonegoro No. 1, Bandar Lampung, 35145, Indonesia

2Biochemistry Division, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Institut Teknologi Bandung, Jl. Ganesha 10, Bandung 40231, Indonesia

Corresponding author: A. Setiawan, andi.setiawan@fmipa.unila.ac.id

Abstract. Chitosan has been extensively used as a matrix for the encapsulation of several valuable compounds. This study aims to characterize antioxidant activities of fucoxanthin encapsulated in chitosan-nanoparticle. Fucoxanthin was obtained from the extraction of Cyclotela striata biomass and chitosan was obtained from shrimp shell waste. Fucoxanthin test results using UV-Vis showed absorption at a maximum wavelength of 446 nm which indicates the characteristics of fucoxanthin. While the results of the analysis of chitosan products using IR showed the absorption of the –OH group at 3440 cm^-1, the absorption of the C=O group at 1600 cm^-1, the absorption of the CN group at 1332 cm^-1 which indicated the absorption of chitin and chitosan compounds. Furthermore, the results of the SEM test on chitosan- nanoparticles seemed less successful due to the observed formation of clumps. Optimization of the formation of chitosan-nanoparticles is still under optimization.

Key Words: chitosan, fucoxanthin, ecapsulation, nanopartikel, antioxidant.

Introduction. The level of public awareness of the importance of healthy food, environmental protection, and sustainable use of natural resources tends to continue to increase. It also has a positive impact on increasing people's awareness of natural products or natural compounds taking into account that they are non-toxic, low pollution, and have relatively lower side effects (Khanahmadi et al., 2014). Diatom is one type of microalgae that is a sustainable natural resource. In addition, this type of microalgae has been known to produce important compounds such as lipids, sterols, isoprenoids, and pigments such as fucoxanthin, carotene, diatoxanthin, and diadinoxanthin (Pennington et al., 1988). Several studies have shown that carotenoid compounds such as fucoxanthin have biological activities that function as anti-obesity, antioxidant, anticancer, anti-inflammatory, and other important benefits, so that these compounds are widely used in the food industry and as combined ingredients in the manufacture of nutraceuticals, cosmetics, and pharmaceutical products (Lopes et al., 2020). However, fucoxantthin compounds are relatively unstable in their application, so efforts are needed to maintain the stability of these compounds.

Recently, the results of the study on the application of nanotechnology have made it possible to apply the technique of encapsulating unstable compounds such as fucoxanthin. However, the selection of a suitable matrix material for the intended application is very important because it affects the encapsulation efficiency (EE) and stability of the nanostructures formed as well as the release profile of the encapsulated molecules (Casanova et al., 2016). One of the commonly used techniques for encapsulation is the ion gelation method. This method is relatively simple and inexpensive.

Natural macromolecules, one of which is the chitosan biopolymer, has been used as a matrix for encapsulation of various natural and synthetic molecules. Chitosan is a unique cationic polysaccharide, has film-forming and gel-forming properties, encapsulation potential, etc. This

21

biopolymer considered safe by the Food and Drug Administration (FDA). There are many potential applications of chitosan in various fields, such as food, pharmaceuticals and cosmetics (Morin-Crini et al., 2019). The cationic properties of chitosan lead, under acidic conditions, to the development of various forms, such as nano/micro-particles, emulsions, fibers, hydrogels, films and membranes.

Chitosan, in its various forms, has been widely used as a matrix for encapsulation of extracts, essential oils and bioactive compounds (Detsi et al., 2020).

In this study, fucoxanthin encapsulation was carried out using the ionic gelation method.

Fucoxanthin compound was obtained from the extraction of Cyclotella striata biomass. Based on the author's knowledge, studies on the encapsulation of fucoxanthin in chitosan-nanoparticles have not been reported. Information related to the ability of chitosan nanoparticles to encapsulate fucoxanthin in maintaining the stability of antioxidant activity is very important as a basis for developing technological innovation products.

Material and Method

Isolate Cyclotela striata In this research, the diatom of C. striata were obtained from the culture collection of the Biochemistry Laboratory Institut Teknologi Bandung, Indonesia. C. striata isolates were obtained from sampling on Tanjung Bidadari Island, Kepulauan Seribu, Jakarta Indonesia. C.

striata was cultivated in standard media refers to Nurachman et al (2012) with some modifications. To prevent contamination, tools and materials were sterilized for 15 minutes at 121ºC, 1.2 Mpa. Starter cultures of C. striata were grown in glass bottles containing 700 mL of 22 ppt artificial seawater media (Bochenski et al., 2019), which consisted of the addition of 0.2% KNO³, 0.25% Na³PO⁴, 0.2% FeCl³, 0.15% Na2SiO3.5H2O, 0.1% Na2CO3, the culture medium was adjusted in the pH range 7.4 – 8.2.

Lighting using a fluorescent lamp produced 95 moles of photons m⁻² s⁻¹. With a lighting duration of 12 hours (light): 12 hours (dark), a temperature of ± 27° C and supplied with a carbon source by an aerator. Diatom growth was measured every day until the stationary phase, and then cell density was observed using a ZEISS Axio Imager Z2m microscope at 100× magnification.

Extraction and Isolation of Fucoxanthin Biomass of C. striata were harvested using a centrifugation technique using a HITACHI CF 16 RXII 4000 rpm centrifuge for 5 minutes (Medina et al., 2019), so that C.striata pellets were obtained, the pellets obtained were then weighed using an analytical balance KERN:ABS 220-4 and cell productivity was calculated. The harvested biomass was then taken 5g wet weight, and extracted with 40 mL (2x) EtOH then centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes. The volume of the supernatant was concentrated using a vacuum rotary evaporator (Buchi/Ratavor R-20) at low pressure of 60 Mbar and the weight of the extract was weighed using an analytical balance KERN: ABS 220-4. The crude extract obtained was clean up by silica open column chromatography (L 400 mm x 30 mm in. dia) using EtOH, then fractionated using medium pressure liquid chromatography (MPLC). Chromatography was carried out on a Buchi system of the Sepacore X50 type connected to a 40 g Buchi Reveleris SiO² column and eluted using a step-gradient EtOH (100%

EtOH), the flow rate was adjusted to 25mL/min and detected using a Photo Diode Array (PDA) detector at 364 nm, 254 nm, and 220 nm. Fraction of fucoxanthin was analysis using Spectrophotometer Carry 100.

Prepraration Chitosan 25 g shrimp shell was added by 250 mL NaOH 4% (b/v). In this section, the solution was set up at 80°C for 1 hour. Furthermore, solution was filtered and washed using distilled water then dried at 60°C temperature. Demineralisation was done by dissolving 5 g of the dried deprotonation powder into 75 mL HCl 1 M (v/v) and was then stirred for 1 hour at room temperature and filtered. The residue was washed by distilled water and dried at 60°C temperature. The demineralisation result was dissolved in 30 mL NaOCl 4% and stirred for 1 hour at room temperature then filtered. The residue was then washed by distilled water and dried at 60°C temperature. This result called chitin was characterized by FTIR (Agilent Technologies Carey 630 FTIR)

22

spectrophotometer. 1.5 g chitin was dissolved in 22,5 mL NaOH 40% while refluxed at 80°C for 1 hour, filtered and washed by distilled water then dried at 60°C. This result called chitosan was characterized by FT-IR Spectrophotometer.

Chitosan modified preparation Chitosan (0.1 g) was dissolved in 100 mL glacial acetic acid 1%. At the same time, 0.25 g Na-TPP was dissolved into 100 mL distilled water. The Na-TPP solution was added into chitosan solution dropwise while stirred for 1 hour. Afterward, the suspension was centrifuged at 600 rpm for 1 hour. The result was freeze dryed and characterized by PSA and SEM.

Preparation of fucoxantine loaded chitosan nanoparticles (CNP) The nanoparticles were prepared according to the procedure reported by Calvo et al.(1997), based on the ionic gelation of chitosan with TPP anions. In brief, chitosan was dissolved in acetic acid aqueous solution at various concentrations and the concentration of acetic acid in aqueous solution was, in all cases 1.75 times that of chitosan. Under magnetic stirring at room temperature, 3 ml of TPP aqueous solution at various concentrations was added into 5 ml of chitosan solutions using a peristaltic HPLC pump with 0.2 ml/min flow rate. The final concentration of chitosan and TPP in nanoparticle suspensions were 1.5, 2, 2.5, 3 mg/ml and 0.5, 0.6 and 0.7 mg/ml respectively. The concentration of acetic acid in aqueous solution was 1.75 times the final concentration of chitosan. Nanoparticles were separated by centrifugation followed by lyophilisation of nanoparticles and stored at 4°C until further use.

Characterization of nanoparticles

Particle size and zeta potential The sizes and zeta potential of the CNP were measured with a Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, U.K.). The particle size distribution of the nanoparticles is reported as a polydispersity index (PDI). All measurements were performed in triplicates. 3 ml of sample was taken in a cuvette and was analysed at 25 C with at an angle of 90.

Scanning electron microscope (SEM) Particle morphology was examined by scanning electron microscope (SEM). The CNP were separated by centrifugation at 40,000 g for 30 min. The supernatant was decanted and the pellet was freeze dried with the lyophilizer and was examined by SEM at an accelerating voltage of 15.0 kV. One drop of nanoparticles was placed on a graphite surface and when the sample had dried then it was coated with gold using ion sputter.

Analyis FTIR FTIR spectra of chitosan, fucoxanthin, sodium tripolyphosphate and CNP were obtained to detect the functional groups using FTIR spectrometer (Thermoelectron Corporation, USA). These samples were scanned from 4000 to 400 cm^-1 wave number. Differential scanning calorimetry (DSC) monitors heat effects associated with phase transitions and chemical reactions as a function of temperature. The difference in heat flow to the sample and a reference was recorded. DSC was calibrated using an empty aluminium pan as a standard and samples weighing about 3-6 mg were heated in sealed aluminium pans. Thermogram was recorded covering a range of 25-300°C at a heat rate of 10°C/min, under dry nitrogen condition.

Encapsulation (EE) and loading efficiency (LE)

The EE of fucoxanthin was determined by the separation of nanoparticles from the aqueous medium containing non-associated fucoxanthin using ultracentrifugation at 40,000 g, 4°C for 30 min. The amount of free fucoxanthin in the supernatant was measured by high performance liquid chromatography (Shimadzu HPLC System). A 250 x 4.6 mm column (C18 column; Waters) was used as a solid phase. The mobile phase consisted of 40% methanol and 0.06% formic acid. The system was run isocratically with a flow rate of 0.8 ml/min 20 ml of sample was injected into the column and the quantification was done at 327 nm using Photo diode array detector. All measurements were performed in triplicate. The encapsulation efficiency (EE) and Loading capacity (LC) offucoxantin were calculated as below.

23

EE (%) = (weight of Fuc in nanoparticles x 100)/weight of total Fuc LC (%) = (weight of Fuc in nanoparticle 100)/weight of nanoparticles Fuc

Antioxidant

Activity by DPPH Scavenging Activity Concentration variation of fucoxanthin encapsulated by chitosan was made by dissolving it into methanol solution. The concentration was made into 100, 200, 300, 400, 500 ppm. Then, 3 mL of DPPH solution (made by 2 mg DPPH in 50 mL methanol) was added for every concentration of 1.5 mL sample and incubated for 30 minutes in dark room. Ascorbic acid was used for positive control with various concentration of 10, 20, 30, 40 and 50 ppm.

Antioxidant activity was measured using UV-Vis Spectrophotometer at 517 nm wavelength.

Result and Discussion

Isolate C. striata

In this study, isolates of C. striata were obtained from the Biochemistry Laboratory of the Research and Innovation Building, Bandung Institute of Technology, which were obtained from Tanjung Bidadari Island, Thousand Islands, Indonesia. In this study, C. striata cultivation has been successfully carried out on modified artificial sea water. Observation of the growth curve of C. striata on modified artificial sea water showed an exponential growth curve starting from day 1 to day 13 and tended to decrease on day 14. The growth curve of C. striata on modified artificial sea water media has a relatively normal pattern when compared to the growth pattern that has been carried out by Nurachman et al., (2012).

Preparation Fucoxanthin

At this stage, fucoxanthin from C. strita biomass was obtained by conventional extraction using ethanol solvent and was cleaned using an open column SiO2 technique with ethanol mobile phase.

The choice of solvent was based on consideration of the nature of the solvent that was environmentally friendly and safe for commercial product applications (Poojary et al., 2016), although it was less effective when compared to the use of other solvents (Xia et al., 2013). Based on the results of experiments using crude EtOH extract 5 grams, fucoxanthin extract was 0.11 g in modified media.

Furthermore, the preparation of fucoxanthin was carried out by MPLC using a 40 gram SiO² column (dia. 2.5 cm x L 15 cm) with the mobile phase of EtOH at a flow rate of 25mL/min. nm as shown in Figure 1.

The orange color on the chromatogram shows absorption at 220 nm to detect organic compounds with non-UV active single bonds, 254 nm to detect conjugated double bonds, and 254 nm to detect chromophore groups. The wavelength is a characteristic of the fucoxanthin fraction which accumulates in the fraction 7 tube which will then be used for further analysis regarding the characterization of fucoxanthin.

24

Figure 1. Purification fucoxanthin using medium pressure liquid chromatography.

The results of the analysis using UV Vis spectrometer (Figure 2), it was seen that fucoxanthin absorption for each sample using standard media and tofu waste media showed absorption at max 447 and 665 nm, indicating the absorption characteristics of carotenoid compounds which indicated fucoxanthin compounds (Wang et al., 2018).

Figure 2. Characteristic spectrum UV-Vis fucoxanthin after purifcation

The range at these peaks generally corresponds to the absorption of blue light involved in the synthesis of carotenoids such as fucoxanthin (Lu et al., 2018). The results of this study are in accordance with Jaswir et al. (2012) who identified fucoxanthin from the isolation of Turbinaria turbinata and S. plagyophyllum using a UV-Vis spectrophotometer at a maximum wavelength of about 450 nm (Xia et al., 2013) who also identified fucoxanthin from the marine diatom Odontella aurita with a wavelength of about 446 nm, and Sulistiyani et al. (2013) characterized the spectra absorption maxima for fucoxantin are 447.6-448.4 nm.