MEKANISME AKTIVASI, PROLIFERASI DAN MATURASI SEL PUNCA INTESTINAL OLEH Lactobacillus plantarum IS-10506 UNTUK PERCEPATAN PERBAIKAN MUKOSA USUS (Studi eksperimental pada kerusakan mukosa usus tikus Sprague-Dawley yang mendapatkan Lipopolisakarida Escherich

(1)

ii DISERTASI

MEKANISME AKTIVASI, PROLIFERASI DAN MATURASI SEL PUNCA INTESTINAL OLEH Lactobacillus plantarum IS-10506

UNTUK PERCEPATAN PERBAIKAN MUKOSA USUS

(Studi eksperimental pada kerusakan mukosa usus tikus Sprague-Dawley yang mendapatkan Lipopolisakarida Escherichia coli O55:B5)

ALPHA FARDAH ATHIYYAH

PROGRAM STUDI ILMU KEDOKTERAN JENJANG DOKTOR FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

(2)

iii DISERTASI

ALPHA FARDAH ATHIYYAH

(3)

iv

DISERTASI

Untuk memperoleh Gelar Doktor

dalam Program Studi Ilmu Kedokteran Jenjang Doktor pada Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga

telah dipertahankan di hadapan Panitia Ujian Doktor Terbuka

Pada hari : Selasa Tanggal : 20 Oktober 2015

Pukul : 10.00 – 12.00

Oleh :

ALPHA FARDAH ATHIYYAH 090970140

(4)

(5)

vi

Disertasi ini telah disetujui untuk diuji dan dinilai oleh panitia penguji Ujian Tahap 2 (Terbuka)

pada Tanggal 20 Oktober 2015

Panitia penguji:

Ketua : 1. Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, drh

Anggota : 2. Prof. Dr.Subijanto Marto Sudarmo, dr.Sp.A(K). 3. Dr. Ingrid S Surono, Ir., MSc

4. Prof. Dr.Suhartono Taat Putra, dr., MS. 5. Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES 6. Prof.Dr. I Ketut Sudiana, Drs., M.Si 7. Dr. Anang Endaryanto, dr., SpA(K) 8. Dr. Hari Basuki Notobroto, dr., M.Kes

Ditetapkan dengan Surat Keputusan

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga

Nomor : 319/UN3.1.1/KD/2015

(6)

vii

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillahi Rabbil Alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT yang Maha Pengasih lagi Maha Penyayang atas segala rahmad dan karuniaNya sehingga disertasi ini dapat diselesaikan.

Disertasi ini dapat diselesaikan tidak lepas dari dorongan, bimbingan, arahan, saran dan koreksi dari Tim Promotor, oleh karena itu dengan segala kerendahan hati, perkenankan saya menghaturkan terima kasih yang tulus serta penghargaan yang setinggi-tingginya kepada yang terhormat :

Prof. Dr. Subijanto Marto Sudarmo, dr., SpA.(K) sebagai promotor yang telah dengan penuh pengertian, perhatian dan kesabaran telah memberikan dukungan mental, meluangkan banyak waktu untuk berdiskusi dan memberikan masukan, memperkenalkan saya pada berbagai konsep baru mengenai probiotik, sel punca intestinal dan signaling yang ada di dalamnya, saya ucapkan terima kasih yang tak terhingga.

Dr. Ingrid S. Surono, Ir.,MSc., sebagai Ko-promotor yang banyak memberikan masukan penting dan sangat mendasar dari bidang keahliannya yang sangat bermanfat bagi peningkatan mutu disertasi ini, serta kesediaannya dengan ikhlas bersusahpayah membantu penyediaan probiotik maupun berbagai informasi ilmiah terbaru untuk penulisan disertasi ini, saya ucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya dan penghargaan yang setinggi-tingginya.

Dengan selesainya disertasi ini perkenankanlah saya mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

(7)

viii

kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada saya untuk mengikuti dan menyelesaikan pada Program Studi Ilmu Kedokteran Jenjang Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Prof. Dr. Agung Pranoto, dr., M.Kes.,Sp.PD., K-EMD, FINASIM dan Prof. Dr. Muhammad Amin, dr., Sp.P(K) selaku mantan Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

Prof. Dr. Teddy Ontoseno, dr., SpA(K)., Sp.JP., FIHA, selaku Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran Jenjang Doktor, Prof. Dr. Harjanto JM.,dr.,AIF selaku mantan Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran Jenjang Doktor Program Studi Program Pascasarjana Universitas Airlangga, yang telah membantu dalam pelaksanaan ujian kualifikasi, proposal, kelayakan dan disertasi.

Prof. Dr. Hj. Sri Hajati, SH., MS, Direktur Sekolah Pascasarjana, Prof. Suhariningsih, Ir., selaku Wakil Direktur Bidang Akademik dan Prof. Dr. H.R. Eddy Rahardjo, dr., SpAn.KIC selaku mantan Asisten Direktur I Bidang Akademik dan seluruh pimpinan dan staf Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga.

Direktur RSUD Dr. Soetomo, Dodo Anondo, dr., MPH. dan Dr. Slamet Riyadi Yuwono, dr. DTMH, MARS. Mantan Direktur RSUD Dr. Soetomo yang telah memberikan kesempatan kepada saya untuk mengikuti pendidikan Program Doktor pada Program Studi Ilmu Kedokteran Jenjang Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

(8)

ix

kepada saya untuk mengikuti pendidikan Program Doktor pada Program Studi Ilmu Kedokteran Jenjang Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

Ketua Divisi Gastroenterologi pada Departemen Ilmu Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Prof. Dr. Subijanto Marto Sudarmo, dr., SpA.(K) serta staf Divisi Gastroenterologi, Dr. IGM. Reza Gunadi Ranuh, dr., SpA(K) dan Andy Darma, dr., Sp.A, yang telah memberikan kesempatan dan dukungan moral kepada saya untuk mengikuti pendidikan Program Doktor pada Program Studi Ilmu Kedokteran Jenjang Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

Prof. Dr. Aulanni’am, DEA., drh., dari Lab. Biokimia Fakultas MIPA Universitas Brawijaya, Wibi Riawan, S.Si dari Lab. Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, yang telah memberikan bimbingan, saran dan membantu semua proses yang diperlukan di dalam Laboratorium serta interpretasi hasil pemeriksaan.

Para penguji yang saya hormati Prof. Dr. Suhartono Taat Putra, dr., M.S(K), Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES, , Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, drh, Prof. Dr. I Ketut Sudiana, drs., M.Si, Dr. Anang Endaryanto, dr., SpA(K), dan Dr. Hari Basuki Notobroto, dr., M.Kes yang telah memberikan koreksi, bimbingan dan saran yang sangat berharga mulai dari kegiatan penyusunan prausulan penelitian, usulan penelitian hingga penyusunan naskah disertasi dan ujian tertutup.

(9)

x

Terima kasih kepada semua pihak yang telah mendukung dan membantu proses pendidikan dan penelitian untuk penulisan disertasi saya. Disertasi ini tidak mungkin selesai tanpa bantuan dari semua staf pengajar Departemen Ilmu Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah memberikan kelonggaran untuk pengaturan jadwal pekerjaan saya selama pendidikan, penelitian dan penulisan disertasi.

Seluruh rekan pada Program Doktor pada Program Studi Ilmu Kedokteran Jenjang Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah bekerjasama dan saling memberikan motovasi untuk menyelesaikan pendidikan ini.

Akhirnya dalam kesempatan ini saya sampaikan rasa hormat dan kasih sayang saya kepada :

Orang tua saya bapak Muhammad Cholil Munif, dr., AIF., dan ibu Siti Zulaichah, yang telah mengasuh, mendidik, mengayomi, memberi tauladan yang baik dan penuh kasih sayang hingga saat ini. Juga kepada kedua mertua saya bapak Dasiran dan ibu Suyatmi, yang telah mendampingi saya dan keluarga menjalani kehidupan dan proses pendidikan ini.

Kepada saudara kandung saya Muhammad Nadlir Fakhry, dr., SpOT beserta istri Dwi Putri Lestari, dr., SpA., Muhammad Haris,dr. (Alm) yang selalu membantu saya apabila menemui kesulitan dalam menjalani kehidupan dan pendidikan.

(10)

xi

Terima kasih saya sampaikan kepada semua pihak yang tidak bisa saya sebutkan satu per satu, yang telah memberi motivasi, dukungan dan membantu hingga disertasi ini dapat disusun.

(11)

xii RINGKASAN

Mekanisme aktivasi, proliferasi dan maturasi sel punca intestinal oleh

Lactobacillus plantarum IS 10506 untuk percepatan perbaikan mukosa usus

(studi eksperimental pada kerusakan mukosa tikus Sprague-Dawley yang mendapatkan Lipopolisakarisa Escherichia coli O55:B5)

Alpha Fardah Athiyyah

Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang memberikan manfaat kesehatan bagi host apabila diberikan dalam jumlah yang adekuat. Pemberian probiotik terbukti dapat memperpendek durasi diare pada anak dengan diare infeksius. Kesembuhan diare terkait erat dengan perbaikan epitel usus yang mengalami kerusakan. Pada penelitian dengan menggunakan tikus yang diberikan Salmonella typhimurium, pemberian 3 strain probiotik mengurangi skor kerusakan pada mukosa ileum, mengurangi inflamasi dan modulasi profil sitokin. Pemberian probiotik juga mencegah terjadinya diare terkait dengan pemberian antibiotika. Lactobacillus plantarum IS strain 10506 dan 20506 terbukti menimbulkan efek perbaikan protein penyusun brush border usus yang diwakili oleh ekspresi Galectin-4, Myosin-1a, Occludin dan ZO-1. Pemberian probiotik pada kerusakan mukosa akibat colitis yang dimodelkan dengan pemberian DSS, infeksi Salmonella typhimurium, radiasi ternyata pemberian probiotik memperbaiki kerusakan mukosa yang ditentukan dengan menggunakan skoring histologis. Pemberian sebagai prevensi lebih baik dibandingkan sebagai terapi. Probiotik dan juga protein yang dihasilkan oleh probiotik yaitu p40 dan p75 terbukti dapat menurunkan apoptosis yang ditentukan dengan metode TUNEL dan meningkatkan proliferasi yang ditentukan dengan PCNA. Kontak probiotik dengan epitel menginduksi Hsp27 dan memperbaiki kerusakan mukosa akibat pemberian DSS 3%. Penelitian yang dilakukan oleh Ciorba mendapatkan bahwa pemberian probiotik dapat berpengaruh pada mesenchymal stem cell dengan melakukan migrasi ke arah cripte sehingga jumlahnya bertambah dan akan meningkatkan survival dari kripte. Migrasi ini tergantung dari TLR2. Sampai saat ini mekanisme percepatan kesembuhan mukosa usus terkait dengan aktivasi, proliferasi dan maturasi sel punca intestinal baik preventif maupun kuratif pada individu yang mendapatkan probiotik masih belum bisa dijelaskan.

Subyek penelitian yang digunakan adalah Rattus norvegicus strain Spraque-Dawley dengan kelompok kontrol dan perlakuan yang tidak sama, namun diambil dari strain populasi yang sama. Sampel yang diteliti homogen dalam jenis kelamin, umur dan berat badan. Untuk meningkatkan validitas interna, saat pembagian sampel menjadi 4 kelompok dilakukan dengan alokasi acak (random assignment) yang menggunakan bilangan acak. Kelompok KN adalah kelompok tikus yang diberikan

plasebo selama masa penelitian. Kelompok KL adalah kelompok tikus yang diberikan

LPS Escherichia coli O55:B5 pada hari pertama dan selanjutnya diberikan plasebo. Kelompok KL-Pr sebagai kelompok kuratif adalah kelompok tikus yang diberikan LPS

Escherichia coli O55:B5 pada hari pertama, dan kemudian diberikan probiotik Lactobacillus plantarum IS-10506 pada hari kedua sampai dilakukan nekropsi. Kelompok KPr-7,L sebagai kelompok preventif adalah kelompok tikus yang diberikan

probiotik Lactobacillus plantarum IS-10506 6 hari sebelum pemberian LPS Escherichia coli O55:B5 dan kemudian probiotik dilanjutkan seampai dilakukan nekropsi. Kelompok KN diberikan plasebo menggunakan air steril per sonde selama

(12)

xiii

dilakukan sekali pada hari ke1 penelitian pada semua kelompok kecuali kelompok KN.

Pemberian probiotik Lactobacillus plantarum IS-10506 dengan dosis 2,86 x 1010_CFU

dilakukan secara personde setiap hari pada kelompok KL-Pr, selama 6 hari dan pada

kelompok KPr-7,L diberikan selama 13 hari. Unit analisis adalah ileum. Struktur

anatomis ileum ditentukan dengan pemeriksaan mikroskop elektron. Variabel IL10 dan Hsp27 sebagai wakil dari respon probiotik setelah kontak dengan epitel dan respon awal terhadap stress , Lgr5 dan Bmi1 untuk petanda sel punca intestinal, β-catenin, ERK, STAT5 sebagai wakil aktivitas signalling sel punca intestinal, Ki67 untuk proses proliferasi, Hes1 sebagai progenitor enterosit dan cytokeratin 20 sebagai petanda enterosit matur. Kesemua variabel ini dilakukan dengan pemeriksaan imunohistokimia. Proposal penelitian telah mendapatkan penilaian dan pengesahan kelaikan etik dari Komisi Etik (Animal Care and Use Committe) Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. data hasil penelitian ini dianalisis dengan menggunakan beberapa uji statistik yaitu ANOVA, Kruskal Wallis A, Brown-Forsythe, Mann-Whitney dan analisa jalur.

Pemeriksaan SEM menunjukkan bahwa pada semua kelompok terjadi regenerasi setelah terjadinya kerusakan mukosa. Kelompok yang paling cepat dalam proses regenerasi adalah kelompok preventif, dimana pada hari ke4 sudah terjadi perbaikan. Kelompok preventif secara konsisten lebih baik dibandingkan dengan kelompok lain pada pemeriksaan imunohistokimia pada semua variabel, kemudian diikuti dengan kelompok kuratif. Pemberian probiotik meningkatkan jumlah sel punca baik sel punca yang aktif yaitu Lgr5+ maupun sel punca yang quiscent Bmi1+. Bmi1 lebih meningkat jumlahnya dibandingkan dengan Bmi1. Pemberian probiotik meningkatkan ekspresi IL10, Hsp27, β-catenin, ERK, STAT5, Ki67, Hes1 dan cytokeratin 20. Percepatan perbaikan mukosa paling baik terjadi pada kelompok preventif yaitu pada hari ke 4. Percepatan perbaikan mukosa ini ditunjukkan oleh SEM, Ki67 dan cytokeratin20.

Mekanisme percepatan perbaikan mukosa ini ditentukan dengan analisa jalur. Analisa jalur kelompok KN dan KL menunjukkan mekanisme pada regenerasi alamiah.

Jalur yang aktif dipakai adalah jalur Hsp27, Lgr5, Lgr5-ERK, Ki67, Hes1 dan cytokeratin20. Terdapat koefisien jalur negatif pada jalur ini yaitu dari Hsp27 ke Lgr5. Salah satu kemungkinan penyebab hal ini terjadi adalah ekspresi Hsp27 yang ditimbulkan belum cukup untuk membuat respon positif. Analisa jalur kelompok KL

dan KL-Pr menunjukkan mekanisme regenerasi yang digunakan pada kelompok kuratif.

Jalur aktif sampai dengan Lgr5-β catenin, Lgr-ERK, Bmi-βcatenin dan Bmi-ERK. Tidak ada jalur yang mengaktifkan proliferasi. Apabila dibandingkan dengan hasil analisa statistik pada kelompok kuratif, didapatkan secara statistik bermakna terjadi regenerasi yang lebih cepat dibandingkan dengan kelompok KL. Hal ini berarti pada

kelompok kuratif, menggunakan jalur lain untuk mempercepat proses regenerasi. Sedangkan pada kelompok preventif, jalur yang aktif pada kelompok regenerasi alamiah aktif kembali dengan koefisisn jalur semua positif. Kelompok preventif merupakan kelompok dengan proses regenerasi yang paling cepat. Hal ini berari kelompok preventif menggunakan jalur regenerasi alamiah dan jalur alternatif.

(13)

xiv SUMMARY

Mechanism of activation , proliferation and maturation of intestinal stem cells by

Lactobacillus plantarum IS-10506 to accelerate regeneration of intestinal mucosa

(an experimental study on mucosal damage on Sprague-Dawley rats due to

Lypopolisaccharide Escherichia coli O55:B5)

Alpha Fardah Athiyyah

Probiotics in its proper measure are highly beneficial living mirco-organisms for human beings. Studies shown its benefit in shortened duration of infectious diarrhea in children. Resolving diarrhea correlates with the gut epithelial repair. Studies on rats exposed to Salmonella typhimurium, 3 probiotic strains administration were proven to lower ileal mucosal damage scores, reduce inflammation, and modulate the cytokine profile. Probiotics prevent the incidence of diarrhea related to antibiotics. Lactobacillus plantarum IS strain 10506 and 20506 was shown to be effective in repairing protein comprising the gut brush border, presented by the expression of Galectin-4, Myosin-1a, Occludin and ZO-1. Probiotics administered in mucosal damage due to colitis modelled by DSS, salmonella typhimurium infection, and radiation were proven to repair the mucosal damage with the improving histological scores. Prevention gives more benefits compared to therapy. Probiotics and protein produced by the probiotics p40 and p75 were shown to reduce apoptosis by TUNEL method and increase proliferaton by PCNA. Probiotic induced Hsp27 once it makes contact to the epithel and repair the mucosal damage due to DSS3%. A study by Ciorba showed that probiotics influenced the mesenchymal stem cell by migrating towards the crypte leading to increase amount of the crypte, hence its survival. Migration depends on TLR2. To date, the mechanism of gut mucosal healing acceleration by means of activation, proliferation and maturation of the intestinal stem cell in individuals receiving probiotics remains unclear.

Subjects of this study was Rattus norvegicus strain Spraque-Dawley for case and control group with different exposures and treatments. Samples enrolled were homogeneous in term of sex, age and body weight. To increase the internal validity, samples were classified into groups at random allocation. KN was a group of rats

receiving placebo and KL was a group receiving LPS Escherichia coli O55:B5 on the

first day and placebo on the following day. KL-Pr were the curative groups given LPS

Eschericia coli O55:B55 on the first day and Lactobacillus plantarum IS-10506 on the following until necropsy occured. KPr-7,L was the preventive group consisting of rats

receiving probiotic Lactobacillus plantarum IS-10506 for 6 days prior to LPS Escherichia coli O55:B5 and probiotics were continued until it reached necropsy. KN

was given placebo consisting of sterile water via tube for 14 days. LPS Escherichia coli O55:B5 was adminstered for 250μg/kgbw once daily on day 1 of the study for all groups with the exception of KN. Lactobacillus plantarum IS-10506 for 2,86 x

1010_{CFU were administered via tube every day, K}

L-Pr group was assigned for 6 days

and KPr-7,L was given for 13 days. Analysis unit was the ileum. Anatomical structure

(14)

xv

progenitor and cytokeratin 20 was the marker for mature enterocyte. All variables were examined for immunohistochemistry. This study had been evaluated for ethics approval by the animal care and usee committee of veterinary faculty Airlangga University. Data was analyzed using ANOVA, Kruskal Wallis A, Brown-Forsyte, Mann-Whitney, and pathway analysis.

SEM showed that all groups performed regeneration following mucosal damage. The most accelerated group in the regenerative process was the preventive group showing improvement on day 4 of the study. Preventive group consistently showed better result compared to other grups in regards to immunohistochemistry examination for all variables, followed by the curative group. Probiotics increase the numbers of stem cell for both active (Lgr5+) and quiscent (Bmi1+). Bmi1 had larger amount than Bmi1. Probiotics increase the expression of IL10, Hsp 27, β-catenin, ERK, STAT5, Ki67, Hes1 and cytokeratin 20. Acceleration in mucosal damage improvement was shown best on preventive group (day4), with signifcant markers of SEM, Ki67 and cytokeratin20.

Mucosal repair acceleration mechanism was determined by pathway analysis. Pathway analysis of group KN and KL showed mechanism of natural regeneration. Pathways used were through Hsp27, Lgr5, Lgr5-ERK, Ki67, Hes1 dan cytokeratin20.

There was a negative pathway coefficient from Hsp 27 to Lgr5. This might occur because of inadequate expression of Hsp27 to create positive response. Analysis pathway for KL and KL-Pr showed regeneration mechanism used in curative group. Active pathway was through Lgr5-β catenin, Lgr-ERK, Bmi-βcatenin and Bmi-ERK. No pathway was shown to activate proliferation. In curative group, regeneration was statistically significant to be accelerated compared to KL group. This indicated that curative group might utilize other pathway to accelerate the regeneration process. In preventive group, active pathway in natural regeneration group was being re-activated by every positive coefficient pathway. Preventive group had the most accelerated regenerative process by utilizing natural and alternative pathways.

(15)

xvi ABSTRACT

Mechanism of activation , proliferation and maturation of intestinal stem cells by

Lactobacillus plantarum IS-10506 to accelerate regeneration of intestinal mucosa

(an experimental study on mucosal damage on Sprague-Dawley rats due to

LypopolisaccharideEscherichia coli O55:B5)

Alpha Fardah Athiyyah Background:

Mucosal damage is a result of gastrointestinal tract infection. Mechanism of regeneration mucosa after probiotic administration still poorly understood. Lactobacillus plantarum IS-10506 is a native Indonesian probiotic fermented milk originating from Sumatra.

Objective:

To explain the mechanism of activation, proliferation and maturation of intestinal stem cells by LIS-10506 IS, either as a preventive or curative to accelerate regeneration intestinal mucosal damage caused by LPS E. coli O55:B5.

Method:

Sixty-four Sprague-Dawley rats were divided into 4 groups: control group (KN); received LPS Escherichia coli O55:B5 group (KL);received LPS Escherichia coli O55:B5 then probiotics (KL-Pr) as curative group; and group received probiotics 6 days before LPS Escherichia coli O55:B5 and continued probiotics back (KPr-7L) as preventive group. Probiotics used were LIS-10506. Necropsy was done on days 3,4,6 and 7 with ileum as unit analysis. Scanning Electron Microscope examination was conducted to evaluate structure of intestinal mucosa and expression of Hsp27, IL-10, Stat5, Lgr5, Bmi1, ERK, β-catenin, Ki67, Hes1 and cytokeratin20 were evaluate with immunohistochemistry examination. The statistical analysis used was ANOVA, Kruskal Wallis A, Brown-Forsythe, Mann-Whitney and pathway analysis.

Results:

A significant increase is seen in LIS-10506 receiving groups on Lgr5, Bmi1, Hsp27, IL-10, intestinal stem cells activation (Stat5, ERK, β-catenin), proliferation (Ki67) and maturation (Hes1, cytokeratin20). SEM examination, Ki67 and cytokeratin20 showed that KPr-7L group showed the fastest mucosal regeneration on day 4.Pathway analysis showed that mechanism of acceleration regeneration intestinal mucosa used different pathway on curative group compared with natural pathway and preventive group used natural and alternative pathway.

Conclusion:

(16)

xvii

Penetapan Panitia Penguji v vi

UCAPAN TERIMA KASIH

BAB 1 PENDAHULUAN xxvii

1.1 Latar Belakang Masalah 1

2.1.1 Epidemiologi Diare 7

2.1.2 Kerusakan Mukosa Usus Akibat Infeksi 9

2.1.3 Kerusakan Mukosa Intestinal Akibat Diare Persisten dan Malnutrisi 12 2.1.4 Lipopolisakarida Sebagai Model Penyebab Kerusakan Mukosa 14

2.2 Homeostasis Regenerasi Epitel Usus Halus 18

2.2.1 Struktur Epitel Usus Halus 18

2.2.2 Proses Regenerasi Epitel Usus Halus 20

2.2.3 Sel Punca Intestinal 23

2.2.4 Niche Sel Punca Intestinal 27

2.2.5 Sinyal Sel Punca Intestinal 31

2.2.5.1 Jalur Sinyal Wnt 31

2.2.5.1.1 Sinyal Wnt dan Proliferasi Sel Punca Intestinal 31 2.2.5.1.2 Sinyal Wnt terhadap Regulasi Migrasi Sel Intestinal 35 2.2.5.1.3 Diferensiasi Sel Intestinal oleh Jalur Sinyal Wnt 35

2.2.5.1.4 Hubungan Jalur Sinyal Wnt dan Notch 36

2.2.5.2 Jalur Sinyal BMP 38

2.2.5.3 Jalur Sinyal Notch 38

(17)

xviii

2.2.5.4.1 Sinyal EGFR dan JAK/STAT Bekerjasama dalam Proliferasi Sel

Punca 44

2.2.6 Perbaikan Mukosa Setelah Terjadi Kerusakan/ Infeksi Epitel 45 2.2.6.1 Aktivasi Janus Kinase/Signal Tranducer and Activator of

Transcription (JAK/STAT) Setelah Kerusakan dan Infeksi Epitel 47 2.2.6.2 Aktivasi Jalur EGFR Bersama Jalur JAK/STAT Setelah Kerusakan/

Infeksi Epitel 49

2.2.6.3 Signaling Wnt dan Notch terhadap Regenerasi Intestinal Paska

Kerusakan DNA 51

2.2.6.4 Mekanisme Sitoproteksi Heat shock protein (Hsp) terhadap Jejas serta Pengaruh Hsp dalam Menjaga Homeostasis Sel Intestinal 52

2.3 Probiotik 54

2.3.1 Definisi probiotik 54

2.3.2 Peran Probiotik untuk Kesehatan 56

2.3.3 Lactobacillus plantarum IS 10506 58

2.3.4 Probiotik dan Sel Punca Intestinal 69

2.3.4.1 Komponen Dinding Sel Probiotik 69

2.3.4.2 Peran Probiotik pada Mukosa Intestin 72

2.3.4.2.1 Sekresi Protein Ekstraselular oleh Bakteri Probiotik 73

2.3.4.3 P40 dan P75 Mengaktifkan Jalur EGFR 75

2.3.4.4 IL-10 Menginduksi Aktivasi JAK/STAT 79

2.3.4.5 Mikrobiota Usus Mengaktifkan Jalur JAK/STAT 83 BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL

3.1

3.2 Kerangka Konseptual Hipotesis Penelitian 86 89 BAB 4 MATERI DAN METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian 91

4.2 Waktu dan Tempat Penelitian 93

4.3 Subyek Penelitian 94

4.3.1 Sampel Penelitian 94

4.3.2 Kriteria Inklusi 94

4.3.3 Kriteria Eksklusi 94

4.3.4 Estimasi Sesar Sampel 95

4.3.5 Teknik Randomisasi 96

4.3.6 Prosedur Eksperimen dan Pengamatan 96

(18)

xix

4.7 Pemeriksaan Histokimia 106

4.8 Penyajian Data 111

4.9 Analisis Statistik 111

BAB 5 HASIL DAN ANALISIS

5.1 Scanning Electron Microscope (SEM) 113

5.2 Hsp 27 117

Analisis Jalur Hubungan Berbagai Variabel Analisis Jalur Perbandingan Kelompok KN dan KL

Analisis Jalur Perbandingan Kelompok KL dan KL-Pr

Analisis Jalur Perbandingan Kelompok KL dan KPr-7,L

161 162 166 170 BAB 6 PEMBAHASAN

6.1 Kontak Probiotik dengan Sel Epitel Usus 175

6.2 Pengaruh Probiotik pada Sel Punca Intestinal 180

6.3 Pengaruh Probiotik pada Mekanisme Signaling Sel Punca Intestinal 183

6.4 Pengaruh Probiotik pada Proses Proliferasi Sel Punca 192

6.5 Pengaruh Probiotik pada Diferensiasi Sel Punca 194

6.6 Pengaruh Probiotik pada Perbaikan Mukosa Usus 197

6.7

6.8 Mekanisme Percepatan Perbaikan Mukosa Usus oleh Probiotik Temuan Baru 198 203

BAB 7 KESIMPULAN

7.1 Kesimpulan 205

7.2 Saran 206

DAFTAR PUSTAKA 208

(19)

xx

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Manfaat bakteri probiotik pada host 56

Tabel 2.2 Berbagai penelitian ilmiah secara in vitro, in vivo, dan penelitian secara klinis pada manusia terhadap Lb. plantarum IS-10506 68

Tabel 5.1 Gambaran dasar subyek penelitian 112

Tabel 5.2 Jumlah sel yang mengekspresikan Hsp 27 120

Tabel 5.3 Jumlah sel yang mengekspresikan IL-10 124

Tabel 5.4 Jumlah sel yang mengekspresikan Stat5 127

Tabel 5.5 Jumlah sel yang mengekspresikan Lgr5+ 131

Tabel 5.6 Jumlah sel yang mengekspresikan Bmi1 135

Tabel 5.7 Jumlah sel yang mengekspresikan Lgr5 -ERK 139 Tabel 5.8 Jumlah sel yang mengekspresikan Bmi1 -ERK 142 Tabel 5.9 Jumlah sel yang mengekspresikan Lgr5 - β catenin 146 Tabel 5.10 Jumlah sel yang mengekspresikan Bmi1 - β catenin 150

Tabel 5.11 Jumlah sel yang mengekspresikan Ki67 153

Tabel 5.12 Jumlah sel yang mengekspresikan Hes1 156

Tabel 5.13 Jumlah sel yang mengekspresikan Cytokeratin 20 160 Tabel 5.14 Angka koefisien jalur dan kemaknaan variabel – variabel

Kelompok KN dan KL

163 Tabel 5.15 Angka koefisien jalur dan kemaknaan variabel – variabel

Kelompok KL dan KL-Pr

167 Tabel 5.16 Angka koefisien jalur dan kemaknaan variabel – variabel

Kelompok KL dan KPr-7,L

(20)

xxi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Kerusakan mikrovilli usus halus akibat infeksi oleh wild-type

EPEC dan mutan Δbfp 11

Gambar 2.2 Gambaran jejunum pasien dengan diare persisten dengan

menggunakan mikroskop elektron. 13

Gambar 2.3 Struktur dari LPS 15

Gambar 2.4 Pemberian LPS intrakolon menyebabkan inflamasi pada usus

halus 17

Gambar 2.5 Potongan melintang mukosa usus 18

Gambar 2.6 Distribusi tipe sel epitel pada usus halus mamalia 22

Gambar 2.7 Dua model sel punca intestinal. 24

Gambar 2.8 Ekspresi Lgr5 pada sel CBC cycling pada usus halus 25

Gambar 2.9 Organoid Vili-Kripte 29

Gambar 2.10 A Molekul yang dihasilkan oleh sel punca dan sel Paneth 30 B Sel punca (berwarna hijau) terdistribusi di sekitar sel Paneth

(berwarna merah)

C Sel punca intestinal (bar berwarna hijau) memiliki kontak permukaan erat dengan sel Paneth (bar berwarna merah) D Sel punca membentuk organoid serta domain kripta (

crypt-like domain). Sel punca LGR5+-GFP (berwarna hijau) berkembang di sekitar sel Paneth (berwarna hitam, ditunjukkan oleh anak panah)

Gambar 2.11 Tiga sinyal Wnt, Notch, EGF dibutuhkan untuk proliferasi sel

punca, sedangkan BMP menghmbat proliferasi sel punca 32

Gambar 2.12 Jalur sinyal sel punca intestinal 34

Gambar 2.13 A Aktivitas jalur Wnt terpadat didapatkan pada dasar kripte 36 B Ekspresi Eph/Ephrin pada sel intestinal matur didapatkan

pada daerah junctional antara kripte-villi

C Diferensiasi sel punca menjadi sel absorptif (enterosit) maupun sel sekretori

Gambar 2.14 Diagram Jalur Sinyal Notch 40

Gambar 2.15 Penurunan Sel Punca CBC dengan pemberian inhibitor Notch 41 Gambar 2.16 Proses homeostatis dan regenerasi pada Midgut Drosophila 45 Gambar 2.17 Jalur JAK/STAT dalam keadaan homeostatis dan regenerasi 48 Gambar 2.18 Ekspresi gen jalur EGRF dan JAK/STAT setelah pemberian

Ecc15 peroral pada Drosophila midgut 49

Gambar 2.19 Regulasi pembentukan epitel baru melalui jalur JAK/STAT dan

EGFR 50

Gambar 2.20 NF-kB berhubungan dengan jalur Wnt 53

Gambar 2.21 Persentase adhesi strain kuman patogen dan strain bakteri asam

laktat yang diisolasi dari dadih 63

Gambar 2.22 Kemampuan autoagregasi hidrokarbon strain bakteri asam laktat

yang diisolasi dari dadih 64

(21)

xxii laktat yang diisolasi dari dadih

Gambar 2.24 Kompetisi adhesi bakteri asam laktat dan kuman patogen 67 Gambar 2.25 Adhesi kuman patogen dengan keberadaan bakteri asam laktat 67 Gambar 2.26 Komponen dinding sel Lactobacillus plantarum str. WCFS1 72 Gambar 2.27 Mekanisme molekular protein ekstraselular Laktobasilus 75

Gambar 2.28 Aktivasi EGFR oleh P40 76

Gambar 2.29 Pemberian P40 dalam terapi colitis 78

Gambar 2.30 Peningkatan ekspresi STAT3- tyrosine705 dan p38 oleh

fosforilasi supernatan Lactobacillus Rhamnosus GR-1 dan LPS pada sel trophoblas plasenta

82

Gambar 2.31 Modulasi renewal epitel usus dengan bakteri pathogen dan

mikrobiota 84

Gambar 3.1 Kerangka konsep penelitian 86

Gambar 4.1 Gambar pengelompokan subyek penelitian 92

Gambar 4.2 Gambar alur penelitian 104

Gambar 5.1 Pemeriksaan SEM ileum tikus SD pada hari ke 3 114 Gambar 5.2 Pemeriksaan SEM ileum tikus SD pada hari ke 4 115 Gambar 5.3 Pemeriksaan SEM ileum tikus SD pada hari ke 6 116 Gambar 5.4 Pemeriksaan SEM ileum tikus SD pada hari ke 7 117 Gambar 5.5 Pengecatan imunohistokimia untuk Hsp27 118 Gambar 5.6 Grafik jumlah sel yang mengekspresikan Hsp 27 120 Gambar 5.7 Pengecatan imunohistokimia untuk IL-10 122 Gambar 5.8 Grafik jumlah sel yang mengekspresikan IL-10 124 Gambar 5.9 Pengecatan imunohistokimia untuk Stat5 125 Gambar 5.10 Grafik jumlah sel yang mengekspresikan Stat5 128 Gambar 5.11 Pengecatan imunohistokimia untuk Lgr5+ 129 Gambar 5.12 Grafik jumlah sel yang mengekspresikan Lgr5+ 132 Gambar 5.13 Pengecatan imunohistokimia untuk sel punca intestinal yang

mengekspresikan Bmi1 133

Gambar 5.14 Grafik jumlah sel yang mengekspresikan Bmi1 135 Gambar 5.15 Pengecatan imunohistokimia dengan double staining untuk

sel yang mengekspresikan Lgr5-ERK 137

Gambar 5.16 Grafik jumlah sel yang mengekspresikan Lgr5–ERK 139 Gambar 5.17 Pengecatan imunohistokimia dengan double staining untuk

sel yang mengekspresikan Bmi1-ERK 140

Gambar 5.18 Grafik jumlah sel yang mengekspresikan Bmi1– ERK 143 Gambar 5.19 Pengecatan imunohistokimia dengan double staining untuk

sel yang mengekspresikan Lgr5-β catenin 144 Gambar 5.20 Grafik jumlah sel yang mengekspresikan Lgr5-β catenin 147 Gambar 5.21 Pengecatan imunohistokimia dengan double staining untuk

sel yang mengekspresikan Bmi1-β catenin 148 Gambar 5.22 Grafik jumlah sel yang mengekspresikan Bmi1 - β catenin 150 Gambar 5.23

Gambar 5.24 Gambar 5.25

Gambar 5.26

Pengecatan imunohistokimia menunjukkan sel yang mengekspresikan Ki67

Jumlah sel yang mengekspresikan Ki67

Pengecatan imunohistokimia menunjukkan sel yang mengekspresikan Hes1

Grafik jumlah sel yang mengekspresikan Hes1

(22)

xxiii Gambar 5.27

Gambar 5.28 Gambar 5.29 Gambar 5.30 Gambar 5.31

Pengecatan imunohistokimia menunjukkan sel yang mengekspresikan Cytokeratin 20

Grafik jumlah sel yang mengekspresikan Cytokeratin 20 Analisis jalur perbandingan kelompok KN dan KL

Analisis jalur perbandingan kelompok KL dan KL-Pr

Analisis jalur perbandingan kelompok KL dan KPr-7,L

(23)

xxiv

DAFTAR SINGKATAN

Akt Disebut juga PKB (Protein Kinase B) AMP Adult midgut progenitor

APC Adenomatous polyposis coli ARV Anti Retroviral

BMP Bone morphogenetic proteins BrdU Bromodeoxyuridine

CBC Crypt base columnar CK Cytokeratins

Ck Casein kinase

CPS Capsular polysaccharide CSL CBF-1/RBP-Jκ, Su(H), Lag-1 DBZ Dibenzazepine

DEC Diarrheagenic Escherichia coli DLL Delta like

DSL Delta/Serrate/Lag-2 E Coli Escherichia coli EB Enteroblas EC Enterosit

ECC Erwiniacarotovoracarotovora EGF Epidermal Growth Factor

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor ENR EGF, Noggin, dan R-spondin EPEC Enteropathogenic Escherichia coli ERK Extracellular-signal-regulated kinase FABP Fatty Acid Binding Protein

FAK Focal adhesion kinase FBW Fractional bandwidth FZD Frizzled

GFP Green Fluorescent Protein GIT Gastrointestinal Track hBD Human b-defensin

Hes Hairy and enhancer of split

Hpo Hippo

Hse Heat Shock Element Hsf Heat Shock Factor Hsp Heat Shock Protein

(24)

xxv IGF Insulin Growth Factor IHH Indian Hedgehog IkB Inhibitory kappa B IL Interleukin

Jag Jagged

JAK Janus kinase

JNK c-Jun N-terminal kinases KLF Kruppel-like factor

Krn Keren

LEF Lymphoid enhancer factor LGG Lactobacillus rhamnosusGG LPS Lipopolisakarida

LRT Lipoprotein-related protein coreceptor LTA Lipoteichoic acid

MAMP Microorganism-associated molecular pattern MAPK Mitogen-activated protein kinase

MEKK Mitogen-activated protein kinase kinase MTG Myeloid translocation gene

mTOR Mammalian target of rapamycin NEC Necrotisingenterocolitis

NF-kB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells Ngn Neurogenin

NICD Notch Intracelluler Domain

NLR NOD-, LRR- danpyrin domain-containing OFUT O-fucosyltransferase

PI3K Phosphatidylionsitol 3 kinase PKC Protein Kinase C

PMN Polimorfonuklear

PRR Pattern Recognition Receptor PTEN Phosphatase and tensin homolog SBE STAT Binding Element

SEM Scanning electron microscope Serpin Serine protease inhibitor sFRP Secreted frizzled-related protein SH Scr homolog

SHH Sonic Hedgehog

SKRT SurveiKesehatanRumahTangga

Spi Spitz

STAT Signal tranducer and activator of transcription TCF T-Cell factor

(25)

xxvi

TMCH Transmissible murine colonic hyperplasia TNF Tumor Necrosis Factor

TTP Tristetraprolin UPD Unpaired like protein UTR Untranslated Region VM Visceral Muscle

Vn Vein

WTA Wall teicoic acid

Yki Yorkie

(26)

xxvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Laik Etik 224

Lampiran 2. Surat Keterangan Kesehatan Hewan 225