LAMPIRAN 7 :
Prosedur pemeriksaan kadar TNF-α serum. Prinsip Pengujian
Uji ini bekerja dengan teknik penyisipan enzim immunoassay secara kuantitatif. Antibodi monoklonal yang spesifik untuk TNF-α telah dilapisi atas microplate. Standar dan sampel dimasukkan kedalam dan TNF-α yang muncul terikat dengan antibodi yang immobile. Setelah membuang substansi yang tidak terikat,
enzyme-linked polyclonal antibody yang spesifik untuk TNF α ditambahkan. Kemudian, ditambahkan larutan substrat dan dilakukan pewarnaan. Pewarnaan dihentikan dengan mempertimbangkan intensitasnya.
Batasan pemeriksaan :
Hanya untuk penelitian, tidak digunakan untuk prosedur diagnostik.
Kit tidak boleh digunakan bila telah melewati tanggal kadaluarsa yang tertera pada label.
Jangan mencampur reagen dengan bahan dari sumber yang lain.
Penting untuk menggunakan alat kalibrasi pengencer sebagai kurva standar, agar konsisten terhadap sampel yang akan diuji.
Jika nilai sampel secara umum lebih tinggi dari standar, lakukan pengenceran dengan alat kalibrasi yang sesuai dan ulangi pengujian.
Standar pengencer, operator, pipetting technique, teknik pencucian, masa inkubasi/temperatur dan umur kit dapat mempengaruhi variasi pengikatan.
diuji dengan Quantikine Immunoassay, kemungkinan dari percampuran belum bisa dieksklusikan.
Reagen : TNF α microplate TNF α Conjugate TNF α Standard Assay diluent RD1F Calibrator Diluent RD6-35 Wash Buffer Concentrate Color Reagent A melebihi tanggal kadaluarsa
KIT yang sudah terbuka
Diluted wash buffer Bisa disimpan sampai 1 bulan dalam suhu 2- 8C ͦ
Stop solution
Calbrator diluent RD6-35
Assay diluent RD 1F
Conjugate
Unmixed Color reagent A
Unmixed Color reagent B
Standard
Microplate wells Kembalikan
tabung yang tidak terpakai kedalam kantung foil.
Perlengkapan Lain Yang Dibutuhkan Microplate reader
Pipet Air suling
Squirt bottle, manifold dispenser atau automated microplate
washer
100 ml dan 500 ml graduated cylinders
Human TNF α controls
Tindakan Pencegahan
Calibrator diluent RD 6-35 terdiri atas sodium azide yang akan
bereaksi dengan timah dan tembaga, dapat membentuk azides metalik yang bersifat eksplosif. Siram dengan air bervolume banyak selama pembuangan.
Stop solution pada Kit ini berasal dari cairan asam. Gunakan
pelindung mata, tangan wajah & baju pelindung saat menggunakan material tersebut.
Pengumpulan Dan Penyimpanan Sampel
Cell Culture Supernates : hilangkan partikulat dengan sentrifugasi
dan uji secepatnya dan simpan sampel pada suhu ≤ - 20 C. Hindari pengulangan freeze-thaw cycles.
Serum : gunakan serum separator tube (SST) dan biarkan sampel membeku selama 30 menit sebelum sentrifugasi selama 10 menit sekitar 10000 x g. Angkat serum dan uji secepatnya dan simpan sampel pada suhu ≤ - 20 C. Hindari pengulangan freeze-thaw cycles.
Peringatan : jika menggunakan citrate atau tabung heparin, pastikan bebas pyrogen untuk menghindari produksi TNF α yang endogenus.
Persiapan Reagen
Simpan semua reagen dalam suhu kamar sebelum digunakan. Wash-buffer : Jika terjadi pembentukan kristal, hangatkan pada
suhu kamar dan aduk perlahan hingga kristal larut.
Diluted Calibrator Diluent RD6-35 : tambahkan 20 ml Calibrator
Diluted RD6-35 dengan 80 ml air suling hingga menghasilkan 100
ml Diluted Calibrator Diluent RD6-35.
Substrate Solution : Color reagent A & B harus dicampur dengan
volume yang berimbang selama 15 menit. Hindari dari cahaya, 200 uL campuran hasil reaksi wajib per tabung.
TNF α Standard : Susun kembali TNF α Standard dengan 1.0 ml air suling. Prosedur penyusunan kembali ini menghasilkan 10.000 pg/ml persediaan solution. Biarkan standard tersebut selama 15 menit agar membentuk pengenceran.
Ambil 900 uL calibrator Diluent RD6-35 atau encerkan calibrator Diluent RD6-35 menjadi 1000 pg/ml. Ambil 500 ml dari Calibrator
diluent yang sesuai ke tabung yang tersisa. Gunakan larutan
persediaan untuk menghasilkan serial pengencer. Aduk setiap tabung sebelum dipindahkan ketabung berikutnya. 1000 pg/ml standard merupakan standard tertinggi. Calibrator diluent yang sesuai merupakan standard nol (0 pg/ml).
Prosedur Pengujian
Simpan semua reagen dan sampel dalam suhu kamar sebelum digunakan. Direkomendasikan untuk membuat duplikat pada semua sampel, standar dan kontrol yang akan diuji.
Buka microplate strips dari plate frame, masukkan kedalam foil yang berisi paket pengering.
Tambahkan 50 ml Assay Diluent RD1F pada setiap tabung. Assay diluent RD1F dapat menyebabkan pengendapan. Aduk tabung
sebelum dan selama penggunaan.
Tambahkan 200 uL Standard, sampel atau control pada setiap tabung. Bungkus dengan adhesive strips yang tersedia. Lakukan inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar. Plate layout disediakan untuk merekam standard dan sampel yang sudah diuji.
Aspirasi setiap tabung dan cuci, ulangi proses sebanyak tiga kali dengan total empat kali pencucian. Cuci dengan menambahkan Wash Buffer (400 uL) pada setiap tabung dengan menggunakan
squirt bottle, manifold dispenser atau autowasher. Setelah
pencucian yang terakhir, bersihkan semua sisa wash buffer dengan aspirasi atau decanting ?. Balikkan plate dan keringkan dengan kertas handuk yang bersih.
Tambahkan 200 uL TNF α Conjugate pada setiap tabung. Bungkus dengan adhesive strip yang baru. Untuk serum plasma sampel : inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar dan untuk cell culture supernate sampel : inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar.
Ulangi aspirasi/pencucian seperti pada langkah di atas.
Tambahkan 200 uL substrate solution pada setiap tabung. Inkubasi selama 20 menit pada suhu kamar. Hindari dari cahaya.
Tambahkan 50 uL stop solution pada setiap tabung. Warna harus berubah dari biru menjadi kuning. Jika warnanya hijau atau tidak terjadi perubahan warna, ketuk perlahan plate nya untuk memastikan percampuran sepenuhnya.
Pastikan densitas optikal pada setiap tabung dengan menggunakan microplate reader yang diatur pada 45 nm. Jika koreksi panjang
dikoreksi dengan optical imperfection pada plate. Pembacaan secara langsung pada 450 nm tanpa melakukan koreksi, akan menghasilkan akurasi yang lebih tinggi atau lebih rendah.
Kesimpulan Prosedur Pengujian
Persiapkan semua reagen dan sampel seperti yang sudah dijelaskan
Tambahkan 50 uL assay diluent RD 1F pada setiap tabung
Tambahkan 200uL standar, kontrol atau sampel pada setiap tabung, inkubasi selama 2 jam
Aspirasi dan bilas sebanyak 4 kali
Tambahkan 200 uL conjugate pada setiap tabung Aspirasi dan bilas sebanyak 4 kali
Tambahkan 200 uL substrate solution pada setiap tabung. Hindari dari cahaya
Tambahkan 50 uL stop solution pada setiap tabung. Baca pada 450 nm selama 30 menit. Λ correction pada 540 atau 570 nm
Kalkulasi Hasil
Rata-ratakan pembacaan hasil duplikasi pada setiap standar, kontrol dan sampel dan kurangi dengan rata-rata standar nol dari optical density.
Buat kurva standar dengan mengurangi data menggunakan software komputer yang mampu menghasilkan four parameter
logistic (4-PL) curve fit. Sebagai alternatif, buat kurva standar
Jika sampel sudah dilakukan pengenceran, konsentrasinya pembacaan dari kurva standar harus dikalikan dengan faktor pengencer.
Petunjuk Teknik
Saat mencampur protein solution, hindari pembentukan busa
Substrate solution harus tetap tanpa warna sebelum dimasukkan
kedalam plate. Jauhkan substrate solution dari cahaya. Substrate solution harus berubah warna menjadi biru.
Stop solution harus dimasukkan kedalam plate berurutan dengan
substrate solution. Warna akan berubah dari biru menjadi kuning
saat dicampur dengan stop solution. Warna hijau merupakan indikasi jika stop solution tidak tercampur sepenuhnya dengan substrate solution.
Untuk menghindari kontaminasi, ganti pipet saat menambahkan setiap level standard, penambahan sampel dan saat memasukkan reagen. Gunakan reservoir yang berbeda setiap reagen.
Untuk memastikan hasil yang akurat, kelayakan adhesion plate selama tahap inkubasi adalah penting.
Ketelitian
Intra-assay Precision
Tiga sampel yang konsentrasinya sudah diketahui diuji sebanyak 20 kali pada satu plate untuk menilai ketelitian intra-assay.
Inter-assay Precision
Tiga sampel yang konsentrasinya sudah diketahui diuji sebanyak 20 kali secara terpisah untuk menilai ketelitian inter-assay.
Linearitas
Kalibrasi
Immunoasaay ini dikalibrasi terhadap highly purifired E coli-expressed recombinant human TNF α yang dihasilkan pada sistem R&D.
Standar internasional pertama NIBSC/WHO 87/650 dievaluasi pada kit ini. Kurva respon dosis dari standar internasional pertama ini sejajar dengan kurva standard dari Quantikine. Untuk merubah nilai sampel diperoleh dari Quantikine TNFα yang setara dengan NIBSC 87/650 internasional unit.
Nilai equivalent NIBSC (IU/mL) = 0.026 X nilai Quantikine TNFα (pg/mL)
Nilai Sampel
Serum/Plasma : empatpuluh serum dan plasma sampel telah dievaluasi dalam uji ini. Semua sampel terukur dengan hasil dibawah nilai standard 15.6 pg/mL
Cell Cultured Supernates : mononuklear sel dikultur di RPMI,
ditambahkan dengan 10% fetal calf serum, 50uL β -mercaptoethanol, 2mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin dan 100 ug/mL streptomycin sulfate. Sel tersebut distimulasi pada hari ke 1, 3 dan 5. Alikuot dari culture supernate dipisahkan pada hari ke 1, 3 dan 5dan diuji untuk natural TNF-α.
Sensitifitas
Duapuluh lima uji yang telah dievaluasi dan range minimum detectable dose (MDD) dari TNF-α dari 0,5-5,5 pg/mL. Rata-rata MDDnya adalah 1,6 pg/mL.
Spesifisitas
Uji ini mengenal kedua natural dan rekombinan TNF α. Faktor-faktor yang terdapat dibawah disiapkan sebanyak 50uL/ml di Calibrator Diluent RD6-35 dan diuji reaktifitasnya. Tidak ada reaktifitas yang
LAMPIRAN 8 :
Prosedur pemeriksaan kadar IL-1 serum. Pengumpulan Sampel Dan Penyimpanan
Sel Kultur Supernates : Buang partikulat melalui sentrifugasi dan periksa segera dan simpan pada suhu -200
Serum :
C. Hindari pembekuan ulang.
Menggunakan serum separator tube (SST) dan biarkan sampel menggumpal selama 30 menit sebelum disentrifugasi selama 10 menit. Buang serum dan periksa segera dan simpan pada suhu -200
Plasma : Plasma dikumpul menggunakan antikoagulan EDTA atau sitrat. Disentrifuge selama 30 menit. Pengukuran dilakukan segera dan disimpan pada suhu -20
C. Hindari pembekuan ulang.
0C. Hindari pembekuan yang
berulang.
Prosedur Pemeriksaan :
1. Persiapkan semua reagen dan standar
2. Untuk serum dan plasma : tambahkan 50 µL diluen RD1C Untuk sel kultur supernate : dimulai pada langkah no.3
3. Tambahkan 200 µL standar atau sampel. Inkubasi selama 2 jam. 4. Aspirasi dan cuci 3 kali
5. Tambahkan 200 µL konjugasi pada masing-masing tabung. Serum/plasma : inkubasi 2 jam
Sel kultur supernate : inkubasi 1 jam 6.. Aspirasi dan cuci 3 kali
7.. Tambahkan 200 µL cairan substrat. Inkubasi 20 menit. Lindungi dari cahaya.
Sensitifitas
Kadar minimum IL-1α yang terdeteksi adalah kurang dari 1,0 pg/mL.
Spesifisitas
Alat ini mengenali IL-1α baik yang alami (dari manusia) maupun rekombinan.
IL-1 beta
Interleukin 1 (IL-1) terbagi atas dua protein, yaitu IL-1α dan IL-1β, yang berperan penting dalam inflamasi akut dan kronik, baik secara lokal maupun sistemik. IL-1β manusia disintesa sebagai 269 asam amino dan 31 kDa protein prekursor.
IL-1β diproduksi terutama oleh monosit dan makrofag, selain itu juga astrosit, oligodendroglia, sel korteks adrenal, sel NK, sel endotel, keratinosit, megakariosit, trombosit, neutrofil, osteoblas, sel schwann, trofoblas, sel T, dan fibroblas. Fungsi utama dari IL-1β adalah inisiasi inflamasi. Endotoksin bakteri atau berbagai substansi inflamasi non bakterial akan meningkatkan produksi IL-1, yang mana akan dilepaskan pada daerah lokal. IL-1 menginduksi sel endotel kapiler untuk mensekresikan kemokin (misalnya MCP-1) dan meningkatkan ekspresi dari molekul sel adhesi (misalnya E-selektin, ICAM-1 dan VCAM-1). MCP-1 mengaktivasi mononuklear sel integrin, memfasilitasi infiltrasi mononuklear. Dengan adanya IL-12, IL-1 akan menginduksi sekresi IFN-γ oleh sel NK, sehingga akan mengaktifasi makrofag. Pada akhirnya, IL-1 menginduksi ekspresi matriks metaloproteinase (MMPs), sehingga menyebabkan degradasi matriks ekstraseluler dan migrasi monosit. Efek IL-1 tidak hanya terbatas pada inflamasi, melainkan juga pada pembentukan dan remodeling tulang, sekresi insulin, mengatur selera makan, mencetuskan demam, dan lainnya.
Sel Kultur Supernates : Buang partikulat melalui sentrifugasi dan periksa segera dan simpan pada suhu -200
Serum :
C. Hindari pembekuan ulang.
Menggunakan serum separator tube (SST) dan biarkan sampel menggumpal selama 30 menit sebelum disentrifugasi selama 15 menit. Buang serum dan periksa segera dan simpan pada suhu -200
Plasma : Plasma dikumpul menggunakan antikoagulan sitrat, EDTA atau heparin. Disentrifuge selama 15 menit dalam 30 menit pengumpulan. Pengukuran dilakukan segera dan disimpan pada suhu -20
C. Hindari pembekuan ulang.
0C. Hindari pembekuan yang berulang.
Sensitifitas
Kadar minimum IL-1β yang terdeteksi adalah kurang dari 1,0 pg/mL.
Spesifisitas
LAMPIRAN 9 :
Prosedur pemeriksaan kadar IL-6 serum. Sistem Amplifikasi
Rangkaian alat Quantikine HS Immunoassay menggunakan sistem amplifikasi dimana adanya reaksi alkalin fosfat akan menghasilkan kofaktor yang mengaktifkan siklus redoks yang pada akhirnya menghasilkan bahan yang berwarna. Pada sistem ini, alkalin fosfat akan mendefosfolarisasi NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) menjadi NADH (nicotinamide adenine dinucleotide). Komponen NADH selanjutnya akan
berperan sebagai kofaktor khusus yang mengaktivasi siklus redoks melalui sistem enzim sekunder yang terdiri dari alkohol dehidrogenase dan diaforase (amplifier). Reaksi yang dikatalisasi oleh diaforase, NADH akan memecah garam tetrazolium (INT-violet atau iodonitrotetrazolium violet) untuk menghasilkan colored formazan dye dan NAD+. Komponen NAD+ selanjutkan akan
dipecah oleh etanol, dalam suatu reaksi katalisasi alkohol dehidrogenase, yang menghasilkan NADH yang kemudian akan kembali masuk dalam siklus redoks. Kecepatan pemecahan garam tetrazolium dan selanjutnya bahan yang berwarna yang terbentuk secara langsung menunjukkan jumlah IL-6.
Pengumpulan Dan Penyimpanan Sampel Serum :
Menggunakan serum separator tube (SST) dan membiarkan sampel menggumpal selama 30 menit sebelum disentrifugasi selama 15 menit. Serum dibuang dan diukur segera atau disimpan dahulu pada suhu -200
Plasma :
C. Hindari pembekuan yang berulang.
berulang. Heparin tidak direkomendasikan digunakan sebagai antikoagulan.
Prosedur pemeriksaan :
1. Persiapkan semua reagen dan standar 2. Tambahkan 100 µL diluen RD1-75
3. Tambahkan 100 µL standar, sampel, atau kontrol. Inkubasi selama 2 jam.
4. Cuci 6 kali
5. Tambahkan 200 µL konjugasi. Inkubasi 2 jam. 6. Cuci 6 kali
7. Tambahkan 50 µL cairan substrat. Inkubasi 60 menit 8. Tambahkan 50 µL cairan Amplifier. Inkubasi 30 menit
9. Tambahkan 50 µL cairan Stop. Baca pada 490 nm dalam 30 menit. Koreksi λ 650 atau 690 nm.
Sensitifitas
Kadar minimum IL-6 yang terdeteksi (minimum detectable dose/MDD) adalah berkisar antara 0,016-0,110 pg/mL. Rata-rata
MDD adalah 0,039 pg/mL
Spesifisitas
