Metode Penelitian Pengukuran MDA
Konsentrasi MDA dalam material biologi telah digunakan secara luas sebagai indikator dan kerusakan oksidatif pada lemak tak jenuh sekaligus merupakan indikator keberadaan radikal bebas ( Zakaria, 1996 ). Analisis MDA merupakan analisis radikal bebas secara tidak langsung dan mudah dalam menentukan jumlah radikal bebas yang terbentuk. Analisis radikal bebas secara langsung sangat sulit dilakukan karena senyawa radikal sangat tidak stabil dan bersifat elektrofil dan reaksinya pun berlangsung cepat (Halliwel and Gutteridge, 1989).
Pengukuran MDA dapat dilakukan dengan pereaksi thiobarbituric acid ( TBA) dengan melalui reaksi dengan penambahan nukleofilik membentuk senyawa MDA – TBA ( Conti et al., 1991). Senyawa ini berwarna merah jambu yang dapat diukur intensitasnya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm. Senyawa 1,1,3,3-tetraetoksipropana atau malondialdehyde tetrebutylammonium salt digunakan dalam pembuatan kurva standard karena 1,1,3,3-tetraetoksipropana dapat dioksidasi dalam suasana asam menjadi senyawa aldehid yang dapat bereaksi dengan TBA ( Conti et al., 1991). Walaupun metoda ini tidak spesifik namun metoda ini diterima sebagai petanda ( marker) peroksidasi lemak dari banyak peneliti ( Finand, 2006)
Prosedur pemeriksaan MDA:
1. Timbang 0.25 gram sampel.
2. Selanjutnya ditambah 4.5 ml larutan PBS dingin, lalu digerus. 3. Disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. 4. Setelah itu diambil 4 ml supernatan
5. Kemudian supernatan tersebut ditambah 1 ml larutan TCA 15% 6. Selanjutnya diberikan 1 ml larutan TBA 0,37% dalam HCl 0,25 N 7. Setelah itu dipanaskan dalam waterbath 80o C selama 15 menit.
8. Kemudian didinginkan pada suhu ruang selama 60 menit.
9. Setelah didinginkan disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. 10. Kemudian mengukur absorbansi supernatan MDA sampel pada spektrofotometer
dengan λ = 532 nm.
