Bab
III
Metodologi
Penelitian
3.1 Bahan
Sampel yang digunakan pada penelitian ini
adalah karotenoid yang diisolasi dari wortel (Daucus
carota) dan tomat (Lycopersican esculentum). Bahan
yang digunakan antara lain madu, aseton, metanol,
dietil eter, heksana dan gas nitrogen.
3.2
Metode
Ekstraksi
Karotenoid
pada
Wortel dan Tomat
Sebanyak 0.25 kg sampel wortel dan tomat,
masing-masing dibersihkan dari kotoran kemudian
dihaluskan dengan menggunakan blender dan
ditambahkan CaCO3 sebagai agen penetral. Pelarut yang digunakan adalah aseton : metanol dengan
perbandingan 7 : 3 v/v. Sampel kemudian diaduk
selama beberapa menit sampai pigmen terangkat
kemudian disaring. Hasil penyaringan kemudian
dipartisi dengan dietil eter dan campuran air dan NaCl
pekat. Hipofase (air dan pelarut) kemudian dibuang dan
epifase (pigmen) ditampung. Epifase kemudian
kemudian ditambah dengan Na2SO4 anhidrat, disaring kemudian diuapkan. Ekstrak yang diperoleh disimpan
3.2.1 Kromatografi Kolom
Pigmen yang diperoleh dari hasil ekstraksi
kemudian diproses ke tahap berikutnya.
Kromatografi kolom bertujuan untuk memisahkan
campuran berdasarkan perbedaan kecepatan
rambat antar komponen dalam suatu medium
tertentu. Pelarut yang digunakan adalah heksan,
eter dan aseton dengan perbandingan 6 : 3 : 2. Fase
diam yang digunakan adalah silika, sedangkan fase
gerak yang digunakan adalah pelarut. Pigmen hasil
kromatografi kolom kemudian disimpan dalam botol
dan dikeringkan dengan gas nitrogen.
3.2.2 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk
memisahkan substansi campuran menjadi
substansi-substansi penyusunnya. Pigmen yang
diperoleh kemudian dilarutkan dalam aseton.
Sebanyak 10 µl larutan tersebut ditotolkan pada
pelat silika gel 60 F254 (Merck) kemudian dielusi menggunakan fase gerak aseton : eter : heksana
dengan perbandingan 2 : 3 : 6. Pola pemisahan
3.2.3 Spektroskopi UV tampak
Pigmen kering dilarutkan dalam aseton 100%,
kemudian dianalisis pola spektranya menggunakan
spektrofotometer UV tampak berkas rangkap Varian
Cary 50 pada panjang gelombang 350-1100 nm.
3.3
Metode
Penent uan
Fotostabilitas
Karotenoid
dalam
Campuran
Karotenoid dengan Madu
3.3.1 Preparasi Larutan Uji
Pelarut yang digunakan adalah aseton.
Konsentrasi karotenoid dan madu yang digunakan
adalah 1 molar. Campuran karotenoid dan madu
memiliki perbandingan konsentrasi molar 1 : 1.
3.3.2 Uji Fotostabilitas
Larutan karotenoid dan campuran karotenoid
dengan madu dalam pelarut aseton diaduk dengan
magnetik stirer dalam kuvet terbuka dan diiradiasi
menggunakan lampu halogen 1800 lux. Untuk
proses iradiasi diperlukan suatu alat yang lebih
efektif untuk fotoradiasi pigmen yang akan
dimasukkan didalam petri dish. Gambar berikut
adalah alat yang telah dibuat khusus untuk
mendapatkan suatu proses iridiasi yang lebih
Gb.3.2.1 Diagram alat penyinaran sampel
Keterangan
1. Sumber tengangan / power supply 2. Lampu halogen
3. Metal casing. Menggunakan plat aluminium dicat berwarna hitam.
4. Cermin datar, dipasang pada sudut 45°
5. Kaca setebal 1 cm 6. Fan
Alat tersebut menggunakan cermin untuk
memantulkan sinar, dan dua buah kaca setebal
1 cm. Kedua hal tersebut mempunyai tujuan
yang sama yaitu untuk mencegah panas dari
lampu langsung mengenai sampel. Sudut untuk
cermin dibuat 450, hal tersebut bertujuan untuk mendapatkan sinat pantul yang tegak lurus (900) terhadap arah sinar asal. Tujuan penelitian ini
adalah pengukuran fotostabilitas, oleh karena
itu, pengaruh panas harus diminimalisasi.
Panas akan berpengaruh terhadap stabilitas
pigmen, oleh karena itulah alat ini dilengkapi
meminimalisasi transfer panas dari sistem ke
dalam sampel. Pada percobaan ini sumber
tengangan yang digunakan adalah 12 V dan arus
sebesar 4,5 Ampere untuk mendapatkan
intensitas cahaya sebesar 1800 lux. Pengukuran
intensitas cahaya dilakukan dengan
menggunakan luxmeter.
3.3.3 Spektroskopi Near-Infrared
Beberapa sampel disiapkan untuk
kemudian diukur spektrum nya dengan
menggunakan Büchi NIRFlex N-500 Solid.
Sampel yang diukur meliputi petri kosong;
pelarut; pigmen; madu; campuran pigmen dan
pelarut; campuran madu dan pelarut. Sampel
diletakkan pada petri dish dan ditutupi dengan
penutup transflektan. Sampel mempunyai tebal
sekitar 0,3 mm dari dasar petri dish dan
permukaannya sebagai reflektor. Setiap spektrum
diiukur dengan mode reflektan, jumlah scan 32
dan dalam jangkauan panjang gelombang
4000-10000 cm-1. Pengulangan dilakukan sebanyak 3 kali yang kemudian dirata-rata untuk
3.4 Analisa Data
Data yang diperoleh dari 3 kali pengulangan
dianalisa menggunakan statistika deskriptif dan
program Matlab 6.5. Selain matlab, spektrum juga
diolah dengan spectra manager for window 95/NT.
Secara garis besar analisa spektrum sampel dilakukan
sebagai berikut :
Spektrum mentah (yang didapat dari spektrometer NIR)
Mencari nilai rata-rata dari spektrum untuk masing-masing perlakuan
Proses penyiapan awal spektrum untuk kemudian diproses dengan spektral manager meliputi pengubahan reflektan
menjadi absoban, pembuatan head of file dengan excel, konversi data ke txt,
interpolasi spektrum.
Subtraksi spektrum
Pencarian turunan kedua dengan matlab
