Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Saiw; dm£ Teklwlagi Menuju Era 1Ynggal Laudas
Baudung, 8-10 Oktober 1991 PPTN - BATAN
STANDAR THYROID STIMULATING HORMONE UNTUK
IMMUNORADIOMETRIC
ASSAY
Misyetti, Rukmini Iljas, Entit Susihiwati
Pusat Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional AHSTRAK
STANDARTHYROID STIMULATING HORMONE UNTUK IMMUNORADIOMETRIC ASSAY.Preparasi suatu standar ditentukan oleh penggunaan standar itu sendiri. Pada tahun
1924 perserikatan beberapa negara sudah menentukan preparasi standar untuk bioassay. Pada tahun 1968 WHO Expert Committee on Biological Stand8rdization mengatakan bahwa standar untuk bioassay tidak sesuai digunakan untuk radioimmunoassay. Oleh karena itu sebelum pembuatan suatu standar perIu diketahui untuk apa standar itu akan digunakan. Dalam pembuatan suatu standar perIu diperhatikan pelarut,larutan pengencer serta bahan material yang digunakan. Dalam percobaan ini pe buatan standar TSH untuk IRMA dicoba menggunakan serum kuda sebagai pengencer. Untuk uji kualitas dan standardisasi diguna-kan produk Netria sebagai pembanding. Hasilnya dievaluasi dari perbandingan kurva stan-dar dan hasil penentuan terhadap beberapa cuplikan. Untuk menentukan kondisi penyim-panan, dilakukan pengujian dengan menyimpan standar tersebut pada beberapa kondisi yaitu dalam bentuk padat dan cair pada temperatur kamal', _20°C,4 °c dan 37°C. Kestabilan dari setiap kondisi penyimpanan tersebut ditentukan setiap dua bulan dengan menggunakan metode IRMA. Hasil percobaan menunjukkan bahwa standar yang dibuat memberikan hasil penentuan yang sesuai dengan standar Netria yang berarti bahwa serum kuda dapat digunakan sebagai pengencer. Dari uji kestabilan, kondisi penyimpanan yang baik adalah pada 4 °c meliputi kedua bentuk tersebut yaitu padat dan cair, sehingga sampai satu tahun masih memberikan hasil penentuan yang baik.
AHSRACT
STANDARD FOR THYROID STIMULATING HORMONE IN IMMUNORADIO METRIC ASSAY.Preparation ofstandards depend on their intended use.In 1924 a committee representing a number of countries established standard preparation for bioassay. In 19G8the WHO Expert Committee on Biological Standardization stated that standards for bioassay are not suitable for purposes of radioimmunoassay. In the preparation of stand aI'S due attention should be paid to the types of solvent, diluent and materials used. In the present study TSH standards for IRMA were prepared by using horse serum as diluent and standardized against Netria products. The parameters compared were those of the standard curves and assay values for quality control samples. Stability studies were carried out in the solid as well as liquid phase under several storage conditions i.e at room temperature, _20°C, 4 °c and 37°C. The standard were retested after 2 month interval using IRMA. Experimental results showed that the standards are very similar to those obtained from Netria, implying that horse serum is a suitable diluent. Both the liquid and solid from were found to be stable for one year when stored at 4°C.
PENDAHULUAN
Standar adalah materi pembanding yang mempunyai sifat yang sarna dengan cuplikan. Secara teoritis bahan yang digunakan untuk pembuatan standar harus mempunyai kesta-bilan dan kemurnian yang tinggi, dan mempu-nyai struktur yang tertentu (1,2). Syarat ini hanya dapat terpenuhi pada senyawa yang cia-pat disintesis.
Sifat yang berbeda alum ditemui pada se-nyawa biologis seperti thyroid stimulating Iwr-mone (TSI-I),follicle stimulating hormone (FSH)
dan luteinizing hormone (LH).
Senyawa-senya-wa seperti ini belurn dapat disintesis clan
bia-sanya diperoleh clari hasil ekstraksi bahan sum-bernya, seperti urine, plasma clan sebagainya. Struktur kimia clari senyawa biologis ini sulit diketahui seCal'a pasti. Bahkan senyawa yang sama, tapi diperoleh dari sumber yang berbeda, misalnya hasil ekstraksi dari plasma clan dari urine, akan menunjukkan struktur yang berbe-da. Biasanya yang satu merupakan isomer clari yang lain (1). Oleh karena itu pembuatan stan-dar clari senyawa biologis jauh lebih sukar cli-bandingkan dengan senyawa hasil sintesis.
Satuan untuk senyawa yang bukan hasil sintesis clitentukan oleh efek biologisnya,
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sains dan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas
biasanya dalam bentuk unit. Standar ini harus dikalibrasi dengan standar lain.
Preparasi suatu standar juga ditentukan untuk apa standar itu akan digunakan. Pada tahun 1924 perserikatan beberapa negara su-dah menentukan preparasi standar untuk
bio-assay. Pada tahun 1968 WHO Expert
Commit-tee on Biological Standardization mengatakan bahwa standar untuk bioassay tidak sesuai un-tuk radioimmunoassay (1).
Keandalan suatu standar merupakan tanggung jawab dari laboratorium yang mem-buatnya. Untuk standar immunoassay harus diperhatikan beberapa faktor a.l : kehomogen-an, stabilitas dan kemiripan matriks dengan material yang akan ditentukan dan harus dika-librasi dengan benar.
TATAKERJA
Bahan dan perala/an
Bahan yang digunakan untuk pembuatan standar TSH adalah :TSH, serum kuda, standar pembanding (Netria), solid phase anti TSH (Netria), anti TSH monoklonal bertanda 1-125 (PPTN) dan dapar fosfat.
Peralatan yang diperlukan antara lain : mikro pipet ependorf, pengering beku (Lab Conco), sentrifuga IEC Centra-7R, alat penca-cahymini assay type 6-20.
Preparasi larutan pengencer
Sebagai pengencer digunakan serum kuda yang diperoleh dari pemrosesan darah kuda. Serum kuda ini disaring dan ditentukan kadar TSH yang dikandungnya dengan metode
immu-noradiomericassay. Prosedur kerja adalah sbb:
ke dalam tabung polietilen dimasukkan ber-turut-turut : 50 !!l standar TSH, 50 !!l mono-klonal TSHI-125, 50 !!l solid phase
anti-TSH, 300 !!ldapar fosfat pH 7,5 ,diinkubasi satu
malam, dicuci dengan 2x2 ml dapar fosfat, di-sentrifugasi dan endapan dicacah .
Preparasi standar
TSH dilarutkan dalam dapar fosfat pH 7,5 kemudian ditentukan dengan metode IRMAun-tuk menenIRMAun-tukan konsentrasinya. Larutan ini diencerkan sampai 100 lUlL dengan dapar fos-fat ( dijadikan larutan induk ). Dari larutan induk ini dibuat larutan standar konsentrasi 0 - 60 mlUIL dengan menggunakan pengencer serum kuda di atas. Standar ini dibagi-bagi dalam vial kecil masing - masing 0,5 ml. Sebagi-an dikeringkSebagi-an dengSebagi-an pengering beku dSebagi-an sebagian dibiarkan dalam bentuk cairo
Bandung, 8 -10 Oktober 1991 PPTN - BATAN
Uji kualilas Standar
Kualitas standar yang dibuat selalu diuji dengan metode IRMA menggunakan prosedur kerja seperti pada uji kualitas pelarut. Uji kua .. litas ini dilakukan beberapa kali yaitu sebelum dibagi-bagi pada vial kecil,sebelum dan sesudah pengeringan.
Penentuan Kondisi Penyimpanan
Untuk menentukan kondisi penyimpanan yang baik dicoba beberapa macam variasi tern-· peratur dalam bentuk padat dan cair yaitu pada. temperatur kamar, -20 °C, 4 °C dan 37 °C.Untuk setiap macam kondisi penyimpanan ini dilaku .. kan uji kualitas setiap dua bulan secara teratur selama kira-kira satu tahun.
HASILDAN DISKUSI.
Standar sangat menentukan akurasi hasil penelitian. Oleh karena itu dalam pembuatan standar penting sekali diperhatikan ketelitian yang tinggi, baik dari segi pengeIjaan, maupun material dan peralatan yang digunakan.
Untuk memperoleh standar yang andal untuk immunoradiometricassay, perlu diper-ha tikan pelarut dan pengencer yang digunakan.
Pelarut dipilihyangdapat melarutkan ma· terial d::mganbaik, sedangkan pengencer haru!; mempunyai syarat-syarat sebagai berikut (3): 1. mengandung material yang mencegah ad·
sorbsi pada tabung/ gelas.
2. mengandung bahan pengemban yang juga dapat mencegah degradasi standar.
3. semirip mungkin dengan pelarut dimana cuplikan berada.
Larutan pengencer yang biasa digunakan untuk pembuatan standar TSH adalah serum yang bebas dari TSH. Ada beberapa cara yang dapat ditempuh untuk hal ini antara lain: 1. dari serum manusia dengan menarik TSH
dengan cara imunokromatografi. Prinsip da-ri metode ini yaitu melewatkan serum ke kolom yang sudah berisi anti TSH yang di-ikatkan dengan bahan penyangga seperti sellulosa, sehingga antibodi ini akan meng-ikat TSH yang ada dalam serum tsb. Serum yang keluar dari kolom sudah bebas dari TSH. Metode ini membutuhkan biaya yang tinggi sekali untuk pembuatan kolomnya. 2.serum manusia yang diinjeksi Ta dengan
do-sis 150 !!g/hari selama dua minggu (4). De-ngan cara ini, kadar Ta dalam darah akan meningkat ( hipertiroid ). Oleh karena kan-dungan Ta yang tinggi dalam darah, maka kelenjar hipofisa tidak akan mengeluarkan TSH, sehingga kadar TSH dalam darahjadi kecil dan mendekati nol. Pada saat ini darah
Gambar 1. Perbandingan kurva standar TSH yang baru dengan acuan.
Tabel1: Studi perbandingan standar TSH yang baru dibuat dengan standar acuan dievaluasi hasil penentuan beberapa cuplikan dengan metode IRMA.
bi!. Dari hasil percobaan ini maka standar tidak dibenarkan disimpan pada temperatur kamar, apalagi untuk daerah tropis seperti daerah pa-dang pasir, pengiriman standar harus dalam kondisi dingin ( dikemas dengan menyertai es kering)
Pada uji coba terhadap 382 cuplikan donor darah dari PMI cabang Bandung pada umumnya hasil yang diperoleh di bawah 4
cup-rep-Hasil assay TSH dalam cuplikan
lik-li- menggunakan standar an kat Netria baru konst. CV konst.CV (mIUjL) (mlU/L) A 6 0,85 ± 0,210,77 ± 0,220,250,28 B 6 5,81 ± 0,375,87 ± 0,390,120,07 C 6 16,92± 0,8816,66±0,050,970,06 D 6 0,340,26 ± 0,20±0,310,910,77 E 6 6,40 ± 0,916,45 ± 0,660,140,10 F 6 23,97 ± 2,6824,28 ± 2,370,110,10 Bandung, 8-10 Oktober 1991 PPTN - BATAN 30 , ,.,1 ~ , . 0' ;~. ;! " o• .' oj o•
.,
..
o{ .. :! ,': .0 :! 01 .. .' .. " ,j " 'r I • ., I •,.
i! ,' ,j '5 3Ji.1:In •• ntrni (mIU/L)
,0 I " !
i
I.
,1
"]!
volunter diambil dan serumnya dapat digu-nakan sebagai pengencer untuk pembuatan standar TSH. Menggunakan metode ini, volunter harus selalu dalam pengawasan dokter .
3. ada beberapa binatang yang kandungan TSH nya tidak mengalami reaksi silang dengan TSH manusia, diantaranya kuda. Hasil pengujian kandungan TSH dalam se-rum kuda dengan metode IRMA mengguna-kan anti-HTSH monoklonal yang diproduksi pada mencit, bertanda 1-125 tidak menun-jukkan adanya kandungan TSH dalam se-rum. Hal ini berarti bahwa TSH yang ada dalam serum kuda tidak bereaksi dengan
human anti-TSH. Oleh karena itu serum kuda dapa t digunakan sebagai larutan peng-encer untuk standar TSH seperti yang dila-kukan pada percobaan ini.
Material yang digunakan dalam pembu-atan standar ini adalah human pituitary TSH. Material ini sangat heterogen, di dalamnya ter-kandung FSH, LH, hCG dan prolaktin. Hor-mon-hormon ini mempunyai struktur yang mi-rip sehingga sulit dipisahkan satu sarna lain (6). Sesuai dengan kegunaan standar ini ada-lah untuk immunoradiometricassay, material ya.ng heterogen tersebut tidak mengurangi ke-andalan standar karena dalam sistem IRMA digunakan antibodi yang monoklonal, sehingga akan bereaksi spesifik hanya dengan TSH saja. Berbeda halnya bila standar ini digunakan un-tu k radioimmunoassay ( menggunakan antibodi poliklonal) material yang heterogen ini akan memberikan kesalahan yang sistematis.
Gambar 1 adalah hasil kurva standar, menggunakan standar Netria dan standar yang baru dibuat. Perbandingan kedua kurva terse-but menunjukkan bahwa diluen yang diguna-kan mempunyai matriks yang mirip dengan standar Netria.
Pengeringan dengan pengering beku sela-ma satu sela-malam tidak merusak TSH ataupun matriks dari pelarut. Hal ini terbukti dari hasil yang sarna sebelum dan sesudah pengeringan yang ditunjukkan pada Tabel1.
TSH tennasuk senya wa yang mudah rusak
(Ei). Oleh karena itu perlu dicari kondisi
pe-nyimpanan yang sesuai sehingga standar ini dapat stabil dalamjangka waktu yang panjang.
Hasil pengujian kondisi penyimpanan me-nunjukkan bahwa standar TSH cukup stabil pad a 4°C dan -20°C untukjangka waktu lebih dari satu tahun (Gambar 2), sedangkan pada temperatur kamar dan 37°C sangat tidak
sta-Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sains clan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sains dan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas
mUI/L. Populasinya ditunjukkan pada Gambar 3 '6;
,. J7° C cau
2. !olin" kama'
J. 37° . pad.1
••• ",hukamA' pada'
5. 0° C ,ai r 6. 4° C pad.1 1. 0° C p.d.t 8••• 0 C cair g, ~hlri.(,.u,ene.) Bandung, 8-10 Oktober 1991 PPTN - BATAN !'0 n
,,[
o ----1L- __IL 0_1 1-2 2 - 3 J-" 4- ~ Itadlu TSH(mIU/l) J;1 5-6Gambar 2. Uji kestabilan standar TSH dengan beberapa kondisi penyimpanan dilihat dari hasil a8say cuplikan ( A dan B ).
Kadar TSH yang normal dalam serum darah untuk orang dewasa adalah 6 mIU/L dan untuk bayi dan anak-anak <13 mIU/L (5)
DAFTAR PUS TAKA
Gambar 3. Kadar TSH yang diperoleh pada analisis serum darah 382 orang donor darah pada PMI cabang Bandung.
KESIMPUIAN
1.Serum kuda dapat digunakan sebagai larut-an pengencer pada pembuatlarut-an stlarut-andar TSH untuk analisis dengan metode immunora-diometric a8say.
2.Standar yang dibuat mempunyai matriks yang mirip dengan acuan.
3.Perbandingan hasil penentuan dari bebera-pa cuplikan tidak menunjukkan adanya per-bedaan yang nyata, baik menggunakan standar yang dibuat sendiri maupun stan-dar Netria.
4.Kondisi penyimpanan yang terbaik adalah 4
°c.
1. Cotes P.M., Standards and reference reagents for radioimmunoassay, IAEA-SM-124/57 2. Thorel J.I., Radioimmunoassay design and quality control, Pergamon Press, Paris (1982) 3. Thorel J.I and Larson S.M., Radioimmunoassay and Related Techniques, The C.V.Mosby
Company, Saint Louis (1978)
4. Heinz Breuer , Daisy Hamel and Hans Ludwig Kruskemper , Method of Hormoe Analysis, John Wiley and Sons, New York (1978)
5. Vining Ross. F., Hormone Assay Service Handbook, Garvan Institute of Medical Research, St Vincent's Hospital, Darlinghurst (1984)
6. Devlin Thomas M., Textbook of Biochemistry with Clinical Correlation, 2nd, John Wiley &
Sons, Singapore (1986)
Proceedings Seminar Reaktvr Nllklir dalum Penditian Suins ckm Teknolagi Menlljll Era Tinggal L(mda.~
DJSKUSI
Baudung, 8-10 Oktvber 1991 PPTN - BATAN
Rntnawati K.:
1. Apakah perbedaan standar bioassay dengan standar radioimmunoassay? 2. Apakah perbedaan standar IRMA dengan standar radioimmunoassay?
3. Pada RIA untuk menguji bahwa matriks standar sarna dengan cuplikan dilakukan tes
paralelism. Apakah tes paralelism ini dapat juga dilakukan untuk ~enguji matriks standar
IRMA?
Misyetti :
1. Bioassay bisa secara in vitro dan in vivo. Bila menggunakan secara in vivo, maka standar harus memenuhi syarat in vivo ( harus diperhatikan hal-hal yang mengganggu keselamatan binatang percobaan ). Hal ini tidak dibutuhkan untuk RIA dan IRMA. Secara in vitro metode
bioassay sangat bervariasi, termasuk RIA dan IRMA. Untuk metode RIA dan IRMA adanya
adsorbsi pada tabung sangat mempengaruhi hasil assay. Oleh karena itu standar untuk RIAdan IRMA harus diusahakan tidak mudah terserap oleh tabung. Hal ini tidak dibutuhkan untuk
bioassay yang lain. Metode RIA dan IRMA dipengaruhi oleh komposisi protein di dalam sistem,
oll~hkarena itu pelarut untuk standar RIA dan IRMA harus memperhatikan hal ini. Pelarut untuk standar RIA dan IRMA tidak bisa, misalnya hanya dengan menggunakan dapar saja, kecuali dengan penambahan sejumlah protein ke dalamnya. Untuk beberapa bioassay yang lain hal ini tidak dibutuhkan. Adajuga bioassay yang harus memperhatikan kejernihan, yang dalam RIA dan IRMA tidak diperlukan. Karena bioassay sangat bervariasi, maka persyaratan standarpun bermacam-macam. Oleh karena itu pada pembuatan standar harus diketahui terlebih dahulu untuk apa standar itu mau digunakan.
2. Persyaratan standar IRMA sarna dengan untuk RIA.
3. Dalam pembuatan standar IRMAperlu diadakan tes paralelism, tujuannya untuk menentukan matriks yang sesuai sebagaimana yang dilakukan untuk RIA. Uji keparalelan ini bisa dilakukan dengan cuplikan yang mempunyai kadar tinggi dan bisa juga terhadap standar pembanding. Dalam percobaan ini saya melakukan cara membandingkan dengan standar pembanding (Gambar 1).
Nanny Kartini H. :
Pada percobaan penentuan kestabilan dari standar dilakukan penyimpanan pada 37°C. Apakah itu perlu ?Karena kita mengetahui bahwa pada suhu itu senyawa biologis paling reaktifberarti paling tidak stabil. Jadi dasar pemikiran apakah sampai dilakukan percobaan pada 37°C?
Misyetti :
Penentuan stabilitas pada suhu tinggi perlu dilakukan. Hal ini sangat penting pada pengemasan sewaktu pengiriman. Terutama ke clan atau dari negara-negara tropis yang suhunya sangat tinggi, bahkan diatas 40°C. Pemikiran ini timbul dari pengalaman sewaktu menerima kit RIA dari Irak tanpa dikemas dalam kondisi dingin, dan sampai diterima di Lab. kami ( Bandung) sudah tidak mempunyai ikatan yang sesuai. Pemilihan suhu 37°C adalah untuk memudahkan percobaan, karena fasilitas disini, untuk suhu 37°C dapat kami pakai tanpa ada gangguan dan bersamaan dengan kebutuhan yang lain.
