260
Aktivitas Isolat Buah Mangifera casturi Kosterm. Sebagai
Imunomodulator Secara In-Vitro
(
The Isolate Activity of Mangifera casturi Kosterm Fruits As In-Vitro
Immunomodulator
)
Sutomo
1*; Subagus Wahyuono
2; & Erna Prawita S.
2; & A. Yuswanto
3 1Program Studi Famasi Universitas Lambung Mangkurat Banjarmasin
2Bagian Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
3
Bagian Kimia Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
*Corresponding email: suto_farm@yahoo.co.id
ABSTRAK
Tumbuhan M. casturi merupakan salah satu tumbuhan endemik Kalimantan yang keberadaannya sudah mulai langka. Eksplorasi senyawa aktif dari buah M. casturi masih belum banyak dilakukan, termasuk uji aktivitasnya sebagai imunomodulator. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi senyawa dari buah M. casturi dan uji aktivitasnya sebagai imunomodulator. Uji aktivitas imunomodulator dari senyawa hasil isolasi dilakukan secara in-vitro sesuai dengan metode Leijh dkk. Parameter aktivitas imunomodulator didasarkan pada kemampuan makrofag memfagositosis latex beads melalui hitungan rasio fagositosis dan index fagosistosis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rasio fagositosis isolat dari buah M. casturi pada konsentrasi (12,5; 25,0; dan 50,0)µg/mL signifikan terhadap kontrol negatifnya (P<0.05). Analisis terhadap index fagositosis menunjukkan bahwa isolat buah M. casturi pada konsentrasi 12,5 µg/mL sigifikan terhadap kontrol negatif (P<0.05). Isolat buah M. casturi bersifat imunostimulan.
Kata Kunci: Mangifera casturi, isolat, imunomodulator, makrofag, in-vitro
PENDAHULUAN
World Health Organization (WHO) memperkirakan penggunaan obat bahan alam mencapai 80% dari jumlah penduduk di dunia. Menurut Charles Saerang (Ketua Asosiasi Gabungan Pengusaha Obat Tradisional), tahun 2009 omset industri jamu mencapai Rp. 8,5 triliun dan Tahun 2010 meningkat hingga Rp. 10 triliun. Omset industri jamu per Januari sampai Juni 2011 mencapai Rp. 5,6 triliun, meningkat 10% dibandingkan periode sebelumnya, yaitu Rp. 5 triliun. Persentase pertumbuhan obat herbal Tahun 2003 sebesar Rp. 2 triliun, Tahun
2005 sebesar Rp. 2,9 triliun, Tahun 2009 sebesar Rp. 5,2 triliun, dan pada Tahun 2010 mencapai Rp. 7,2 triliun. Amerika Serikat menjadi pemasok terbesar obat di pasar domestik, disusul oleh Malaysia, Korea Selatan, dan China (Kusdriana, 2012).
Indonesia mempunyai keanekaragaman komparatif terhadap tumbuhan yang sebagian bersifat endemik dan dapat dimanfaatkan sebagai bahan obat. Salah satu tumbuhan
endemik dan menjadi tumbuhan khas
Masyarakat Kalimantan adalah kasturi
261
meskipun sudah mulai langka, tetapi dapat tumbuh baik di beberapa daerah di Kalimantan. Buah kasturi diolah oleh masyarakat menjadi jus, dan secara ilmiah telah dibuktikan sebagai antioksidan (Edyson, et al., 2008, Sutomo, et al., 2014). Ekstrak metanol daun kasturi dilaporkan memiliki aktivitas sebagai anti inflamasi (Sanjaya, et al., 2009). Walaupun belum banyak penelitian terhadap buah kasturi, tetapi beberapa famili anacardiaceae memiliki manfaat sebagai obat. Kim, et al., (2010) melaporkan adanya efek dari ekstrak etanol daging buah dan kulit Mangifera indica sebagai antioksidan dan antiproliferatif. Ekstrak dekok Mangifera indica dosis 50 – 250 mg/kgBB dapat menghambat aktivitas makrofag (mengurangi jumlah makrofag pada eksudat peritoneal) (Garcia, et al., 2002).
Penelitian ini akan melakukan isolasi senyawa dari buah M. casturi dan uji aktivitasnya sebagai imunomodulator. Dari studi pustaka dilaporkan bahwa senyawa yang terindikasi sebagai antioksidan ternyata juga memiliki aktivitas sebagai imunomodulator. Senyawa-senyawa tersebut diantaranya adalah apigenin (golongan flavonoid) (Romanova, et al., 2001 dan Kumar, et al., 2011), sinomenine (golongan alkaloid) (Kumar, et al., 2011 dan Li, et al., 2009), andrographolide (golongan terpenoid) (Trivedi, at al., 2007, Wang, et al., 2010, Vasu, 2010, dan Kumar, 2011). Diperlukan eksplorasi senyawa kimia dalam buah M. casturi untuk memastikan jennis senyawa yang dikandungnya..
METODE PENELITIAN
Bahan Tumbuhan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah M.casturi) masak yang diperoleh dari Kalimantan Selatan. Daging bersama kulit buah
M. casturi dipotong-potong kecil, dikeringkan
oven (suhu 500C). Simplisia kering diserbukkan sesuai dengan derajad halus yang ditetapkan selanjutnya dilakukan ekstraksi.
Bahan Kimia dan Pendukung
Bahan yang digunakan meliputi : etanol
(p.a), metanol (pa), asam asetat anhidrida (p.a), H2SO4, kloroform (p.a), n-heksana (p.a), etilasetat (p.a), Amonium hidroksida, HCl, serium sulfat, kalium bromida, FeCl3, silika gel 60 for column chromatography (Merck), silika gel 60 GF254 for thin layer chromatrography (Merck), silika gel 60 PF254 for preparative layer chromatography (Merck), akuades, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), latex beads diameter 3 μm (sigma chem.Co.), Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma), Phosphate buffered saline (PBS), plat kromatografi lapis tipis (KLT), aquadest, giemsa 20% b/v.
Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit galur Balb/C berumur 2-4 bulan, berat badan 20-25 g. Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, semua mencit diadaptasikan terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu untuk penyesuaian lingkungan, mengontrol kesehatan dan berat badan serta menyeragamkan makanannya.
Alat
Alat yang digunakan meliputi : neraca analitik, blender, seperangkat alat maserasi, erlenmeyer, rotary vakum evaporasi, pipet ukur, labu ukur, corong pisah, alat-alat gelas, seperangkat alat KLT, kromatografi vakum cair (KVC), seperangkat alat kromatografi lapis tipis
262
preparatif (KLTP), seperangkat alat
kromatografi kolom, Freezer, lemari asam, Oven, kapiler, lampu ultra violet 254 nm dan 366 nm, inkubator 5% CO2, sumuran, mikroskop, FT-IR,
microplate, sentrifuga, mikropipet,
hemositometer, mikroskop cahaya, laminary flow hood.
Ekstraksi
Dua kilogram serbuk simplisia buah M.
casturi diekstraksi menggunakan metode
maserasi. Pelarut yang digunakan adalah metanol pa hingga semua zat tersari. Ekstrak dipekatkan dengan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental di pindahkan dalam cawan porselin dan sisa metanol diuapkan dengan suhu terkontrol hingga pelarut dinyatakan habis.
Isolasi dan Identifikasi
Isolasi dilakukan terhadap salah satu senyawa dari ekstrak buah M. casturi menggunakan kromatografi cair vakum (KCV), kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP). dan kromatografi kolom (KK). Identifikasi struktur kimia menggunakan spektroskopi FT-IR, NMR, DEPT, dan LCMS.
Linearitas Kurva Baku
Hewan uji (mencit) dianastesi
menggunakan kloroform untuk selanjutnya dilakukan pembedahan. Mencit ditelentangkan, kulit bagian perut dibuka dan dibersihkan selubung peritoneumnya degan alkohol 70% v/b, kemudian disuntikan 10 ml RPMI dingin ke rongga peritoneum, ditunggu 3 menit sambil diguling-gulingkan secara perlahan. Cairan peritoneal dikeluarkan dari rongga peritonium dengan cara menekan organ dalam dengan 2 jari, cairan di aspirasi dengan jarum suntik,
dipilih pada bagian yang tidak berlemak dan jauh dari usus. Jarum yang berisi bahan aspirasi diletakkan pada gelas becker yang berisi es, kemudian suspensi tersebut dimasukkan ke tabung sentrifugasi. Aspirat disentrifugasi pada 1.200 rpm 40C selama 10 menit. Supernatan dibuang, kemudian ditambahkan 3 ml medium komplit pada pellet yang didapat. Jumlah sel dihitung dengan hemositometer kemudian diresuspensikan dengan medium komplit sehingga didapat suspensi sel dengan kepadatan 2,5x106/ml. Suspensi sel yang telah dihitung dikultur pada plate 24 yang telah diberi coverslips bulat, setiap sumuran 200 μl (5x105 sel). Inkubasikan dalam inkubator CO2 5%, 370C selama 30 mnt, kemudian ditambahkan
medium komplit 1 ml/sumuran dan
diinkubasikan lagi selama 2 jam. Sel dicuci dg RPMI 2 x kemudian ditambhkan medium komplit 1 ml/sumuran dan inkubasi dilanjutkan hingga 24 jam.
Uji Fagositosis Makrofag Dengan Lateks Beads
Uji kemampuan fagositosis non spesifik dilakukan in-vitro dengan menggunakan lateks beads diameter 3 μm (sigma chem.Co.). Lateks beads disuspensikan dalam PBS sehingga didapat konsentrasi 2,2 x 107/ml. Isolat ditambahkan dalam media RPMI 400 μL dengan beberapa konsentrasi, yaitu 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, dan 200 μg/mL menggunakan kontrol media pelarut DMSO 0,0025%. Makrofag peritonium yang dikultur sehari sebelumnya dicuci 2 kali dengan RPMI, ditambahkan suspensi lateks 200 μl/sumuran dan diinkubasikan selama 60 menit pada 370C, CO2 5% . Sel kemudian dicuci dengan PBS 3 kali untuk menghilangkan partikel yang tidak difagositosis dan dikeringkan pada suhu
263
ruangan dan difiksasi dangan metanol absolud. Setelah kering coverslips dipulas dengan Giemsa 20% b/v selama 30 menit. Dicuci dengan air suling, diangkat dari sumuran kultur dan dikeringkan pada suhu kamar. Persentasi sel yang memfagositosis partikel lateks dihitung dari 100 sel yang diperiksa dengan mikroskop cahaya. Perlakuan dilakukan sebanyak 3 kali (Leijh, et al., 1986).
HASIL DAN DISKUSI
Serbuk simplisia buah M. casturi (2,0 kg) hasil maserasi didapatkan ekstrak sebanyak 0,76 kg (37,9%) berwarna hijau tua, rasa agak pahit dengan aroma yang khas. Uji kualitatif senyawa kimia dari ekstrak metanol dan senyawa hasil isolasi menggunakan KLT
didapatkan 8 bercak (gambar 1a). Hasil isolasi terhadap senyawa buah M. casturi didapatkan senyawa tunggal dengan nilai HRf 40 (gambar 1b).
Uji aktivitas imunomodulator dari isolat
menunjukkan adanya respon stimulasi
makrofag terhadap fagositasi latek beads. Pada konsentrasi 6,25 µg/mL dan 12,5 µg/mL isolat menunjukkan peningkatan stimulasi makrofag dalam memfagositasi latex tetapi menurun kembali setelah konsentrasi ditingkatkan menjadi 25,0; 50,0; dan 100,0 µg/mL (tabel 1 dan gambar 3). Stimulasi makrofag terhadap fagositasi latex bead ditandai dengan menempelnya atau tertelannya partikel latex beads kedalam sel makrofag (gambar 2).
Gambar 1. a) kromatogram ekstrak metanol dan b) kromatogram senyawa hasil isolasi
Gambar 2. a) Fagositasi makrofag terhadap latex bead (kontrol) dan b) Fagositasi makrofag terhadap latex bead (isolat)
264 Tabel 1. Persentase makrofag aktif yang memfagositasi latex setelah pemberian isolat
Konsentrasi (µg/mL) N Rasio Fagositasi (%) (mean ± SD) Indek Fagositasi (mean ± SD) 6,25 3 31,33 ± 3,52 48,00 ± 6,92 12,50 3 36,00 ± 12,00 58,50 ± 9,85 25,00 3 33,66 ± 4,09 50,00 ± 8,31 50,00 3 32,00 ± 1,00 48,66 ± 5,27 100,00 3 24,66 ± 1,33 30,66 ± 2,68 Kontrol (-) 3 13,33 ± 0,88 14,66 ± 0,93
Gambar 3. Boxplot hubungan antara konsentrasi dengan rasio fagositasi makrofag dan index fagositasi setelah pemberian isolat
Pemberian senyawa hasil isolasi dengan konsentrasi yang lebih besar secara invitro dapat menekan jumlah makrofag yang memfagosit latex. Terjadinya penurunan aktivitas makrofag dapat disebabkan karena sifat dari senyawa yang bersifat toksik terhadap sel makrofag setelah melampaui konsentrasi optimum dari sampel yang diberikan. Hasil analisis ANOVA pada kepercayaan 95% (P<0,05) diketahui bahwa isolat 2 yang diberikan dengan konsentrasi 12,5; 25,0; dan 50,0 µg/mL berdampak signifikan terhadap RF, tetapi untuk parameter IF efek yang signifikan terjadi pada konsentrasi 12,5 µg/mL. Uji aktivitas dari isolat menunjukkan bahwa efek optimun terjadi pada konsentrasi 12,5 µg/mL
yaitu efek meningkat setelah diberikan hingga konsentrasi tersebut selanjutnya menurun kembali setelah diberikan dengan konsentrasi yang lebih besar.
Interpretasi Spektrum Inframerah dan 13
C-NMR - DEPT
Isolat murni dianalisis menggunakan
spektroskopi FT-IR dalam pelet KBr.
Interpretasi spektrum FT-IR didasarkan pada pita-pita serapan gugus fungsi yang sangat spesifik pada bilangan gelombang (ṽ) tertentu. Spektrum infra merah dengan puncak pita serapan (vmax) yang luas pada 3427.45 cm-1 menunjukkan adanya gugus hidroksi (-OH). Serapan puncak pita yang kuat pada 2960.94,
265
2938.35, dan 2869.21cm-1 mengidikasikan adanya gugus C-H alifatik streching. Puncak pita
serapan dengan intensitas lemah yang muncul
pada daerah 1641.94 cm-1
menunjukkan adanya gugus C = C terisolasi. Puncak pita serapan (medium) yang muncul pada vmax 1464.34 cm-1 menunjukkan adanya kelompok gugus CH2 sedangkan puncak pita serapan pada 1056.99 cm-1 menunjukkan adanya gugus cycloalkane (Pateh, et al., 2009; Kamboj & Saluja, 2011).
Interpretasi spektrum 13C-NMR - DEPT dapat diketahui bahwa isolat mengandung 3 atom karbon quarterner (C), 9 atom metin (CH), 11 atom metilen (CH2), dan 6 atom metil (CH3) .Hasil analisis kualitatif, senyawa terisolasi merupakan golongan terpenoid.
KESIMPULAN
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil suatu kesimpulan antara lain :
1. Simplisia buah kasturi (Mangefera casturi Kosterm.) dapat diekstraksi dengan baik menggunakan pelarut metanol.
2. Senyawa terisolasi merupakan golongan terpenoid dengan memiliki gugus hidroksi (-OH), C-H alifatik streching, C = C terisolasi, CH2, dan cycloalkan dengan 3 atom karbon quarterner (C), 9 atom metin (CH), 11 atom metilen (CH2), dan 6 atom metil (CH3).
3. Isolat memiliki potensi sebagai imunomodulator dimana pada dosis 12,5; 25,0; dan 50,0 µg/mL secara in-vitro
menunjukkan efek yang signifikan
(P<0,05) dibandingkan dengan kontrol negatifnya.
DAFTAR PUSTAKA
Edyson, Fujiyati, and Yasmina, A., (2008). Pengaruh Antioksidan Jus Daging Buah Kasturi (Mangifera
casturi) Terhadap Senyawa Karbonil Pada Tikus
Putih (Rattus novergicus) Galur Wistar Yang Diinduksi Radang, J. Kedokteran dan Kesehatan 1 (7), 45 – 51
Garcia, D., Delgado, R., Ubeira, F.M., and Leiro, J., (2002). Modulation of Rat Macrophage Function by the Mangifera indica L. Extracts Vimang and Mangiferin, International immunology, (2), 797-806. Kamboj, A., and Saluja, A.K., (2011). Isolation
stigmasterol and β-sitosterol from petroleum ether extract of aerial parts of Ageratum conyzoides (Asteraceae), International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 1 (3), 94-96. Kim, H., Moon, J.Y., Kim, H., Lee, D., Cho, M., Choi, K.,
Kim, Y.S., Mosadduk, A., and Cho, S.K., (2010). Antioxidant and Antiproliferative Activities of Mango (Mangifera indica L.) Flesh and Peel, Food Chemistry (121), 429-436.
Kumar, D., Arya, V., Kaur, R., and Bhat, Z.A., (2012). A review of immunomodulators in the Indian traditional health care system, J. Microbiology, Immunology and Infection , 45, 165–184.
Kusdriana, H.D., (2012). Daftar Peraturan Obat Tradisional Di Indonesia.
Li, X., Zhou, Y., Liu, Y., Guo, M., Zhu, Q., Xie, Y., and Fan, Z., (2009). Preparation and evaluation of sinomenine spray, J. Chinese Pharmaceutical Sciences, 18 (1), 43 – 48.
Leijh, P.C.J., Furth, R.V., and Swet, T.L.V., (1986). in vitro determination of phagocytosis and intracellular killing by polymorphonuclear and mononuclear phagocytes dalam Weir, D.M., Cellular immunology, Vol 2., backwell scientific publication, london. Pateh, U.U., Haruna, A.K., Garba, M., Iliya, I., Sule, I.M.,
Abubakar, M.S., and Ambi, A.A., (2009). Isolation of stigmasterol, β-sitosterol, and 2-hydroxyhexadecanoic acid methyl ester from the rhizomes of Stylochiton lancifolius Pyer and Kotchy (Araceae), Nigerian Journal of Pharmaceutical Sciences, 1 (7), 19-25
Romanová, D., Vachálková, A., Cipák, L., Ovesná, Z., and Rauko, P., (2001). Study of antioxidant effect of apigenin, luteolin and quercetin by DNA protective method, Neoplasma, 48 (2), 104 – 107.
Sanjaya, L, Sutomo, and Ratnapuri, P.H., (2009). Uji Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Metanol Daun Kasturi (Mangifera casturi) Terhadap Mencit (Mus musculus) Yang Diinduksi Karagenin, Laporan Penelitian, Universitas Lambung Mangkurat, Banjarmasin.
266
Sutomo, Wahyuono, S., Setyowati, E.P., Rianto, S., and Yuswanto, A., (2014). Antioxidant Activity Assay of Extracts and Active Fractions of Kasturi fruit (Mangifera casturi Kosterm.) Using 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Method. Journal of Natural Products. (7), 124-130
Trivedi, N.P., Rawal, U.M., and Patel, B.P., (2007). Hepatoprotective effect of Andrographolide Against Hexachlorocyclohexane-induced Oxidative Injuri,
diakses 25 Juni 2012,
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17761640>
Vasu, S., Palaniyappan, V., and Badami, S., (2010). A novel microwave-assisted extraction for the isolation of andrographolide from Andrographis paniculata and its in vitro antioxidant activity, Natural Product Research, 24, 1560 – 1567.
Wang, H.W., Liu, Y.Q., Wei, S.L., Yan, Z.J., and Lu, K., (2010). Comparison of Microwave-Assisted and Conventional Hydrodistillation in the Extraction of Essential Oils from Mango (Mangifera indica L.) Flowers. Molecules, 15, 7715-7723.
