Microbial Biotechnology BIO-512 (ATW)

Microbial Biotechnology

BIO-512 (ATW)

•

Plant Growth Promoting Rhizobacteria

o Symbiotic PGPR (Rhizobia)

o Non-symbiotic PGPR

•

Microbial Insecticide (Bt)

•

Genetic Engineering of Plant

•

Therapeutic Agent and Vaccin

•

Molecular Diagnosis

Plant Growth-Promoting Rhizobacteria

(PGPR): Rhizobia

Dr. Aris Tri Wahyudi

Department of Biology FMIPA

Bogor Agricultural University

Biological N

₂

-Fixation

~Approximately 80 % is free N

₂

~It can not be used by microbes, directly

~It must be converted to N2-fixed:

Nitrogen Fixation

~Microbe : Symbiotic; Non-Symbiotic

~Enzyme: Nitrogenase

Biological Nitrogen Fixation

N₂ (~80 %) N2 Fixation

NH

3 N-Compound Amino Acid Cell Activity To Plant

Symbiotic

Air

Carbohydrate

Non-Symbiotic

Root Nodule Bacterium : N2 Fixation

Nitrogen Fixation

N₂+8H+_+8e-_{+16MgATP 2NH}

3+H2+16 MgADP+16Pi

Nitrogenase

Symbiotic:

Bradyrhizobium

,

Rhizobium,

Azorhizobium,

etc

Symbiotic N

₂

Fixing Bacteria:

(Form Root Nodule)

1. Azorhizobium

2. Bradyrhizobium

3. Rhizobium

Azorhizobium :

Form root nodule and stem nodule

Stem Nodule : Sesbania rostrata

Metabolism and Translocation

Hasil fiksasi N₂ yaitu NH₃, diekskresikan sel Rhizobium atau

Bradyrhizobium masuk ke bintil (nodul) NH₃ dlm bintil diproses menjadi :

Temperate Tropik glutamin 11% 9%

Asparagin 81% 88% ureide Asam amino 8% 3%

ditranslokasikan ke tanaman bagian atas lewat xylem.

Bakteri bintil akar memperoleh sumber energi (karbohidrat) dari hasil fotosintesis tanaman (fotosintat) dari tanaman bagian atas ke akar lewat phloem.

Rhizobium

Tumbuh cepat (3-5 hari) diatas YMA, 2-4 mm diameter

Menghasilkan asam DNA : 59-64% G+C

Membentuk bintil pada pepolongan subtropis Waktu generasi ~ 4 jam

Bradyrhizobium

Tumbuh lambat (5-7 hari) di atas YMA, diameter < sama dgn 1 mm

Menghasilkan basa DNA : 61-65% G+C

Membentuk bintil pada pepolongan tropis Waktu generasi ~ > 8jam

Bradyrhizobium japonicum

Bacterial root nodule of

soybean

Gram negative

Fix N

₂

molecular

Slow growing

Fig. Root Nodule Formation of Siratro by Bradyrhizobium japonicum

Fig. Physical map of the complete sequence of

Nitrogen (N

₂

) Fixation

Nitrogenase:

1. Komponen I : Mo-Fe-protein = dinitrogenase

2. Komponen II : Fe-protein = dinitrogenase reduktase

Nitrogenase dikontrol oleh gen nif

K. pneumoniae : > 20 gen nif teridentifikasi

Gen-gen nif H D K

nif H---sintesis dinitrogenase reduktase nif D, nif K---sintesis dinitrogenase

Nitrogenase sensitif terhadap oksigen (O₂)

Bakteri aerob : punya mekanisme khusus untuk mem-pertahankan O₂ intraseluler tetap rendah

Bakteri anaerobik fakultatif :

Fiksasi N₂ pada ada O₂ atau tanpa O₂ Bakteri anaerob : tanpa O₂

Gen-gen nif pertama kali dipelajari pada K. pneumoniae ~dekat dengan E. coli

~model yang paling baik

Fe-protein : terdiri dari 2 unit (dimer) disandikan oleh gen nifH 60 kDa

Mo-Fe protein : tdr 4 subunit (tetradimer) : nifDK

Gen-gen nif terletak pada plasmid (Rhizobium) dan pada kromosom (Bradyrhizobium)

Penyusunan gen-gen nif sangat bervariasi :

R. meliloti : nif HDK berdampingan

B. japonicum : nif H terpisah dari nif DK+ 17 kb nif E, N, S, B terletak diantaranya K. pneumoniae: nif HDK berdampingan

Ekspresi gen nif dipengaruhi oleh faktor lingkungan:

Structure of Symbiotic Genes in

Bradyrhizobium japonicum

nodVW nifDKE N X nifS nifB fixA nifH fixBCX Nod-2

nodYABCSUIJ Orf123 nodZ fixR nifA fixA nodD D1 nolA ? 70 kb Lokus III II I Cluster I Cluster II

Nitrogenase Complex

„

Nitrogenase reductase is a 60 kDa homodimer

with a single 4Fe-4S cluster

„

Very oxygen-sensitive

„

Binds MgATP

„

4ATP required per pair of electrons transferred

„

Reduction of N

₂

to 2NH

₃

+ H

₂

requires 4 pairs of

electrons, so

16 ATP are consumed per N

₂

Two protein components: nitrogenase reductase

and nitrogenase

Why should nitrogenase

need ATP?

„

N

₂

reduction to ammonia is

thermodyna-mically favorable

„

However, the activation barrier for breaking

the N-N triple bond is enormous

Symbiotic Genes in

Bradyrhizobium

Gene Species function

nifA B. japonicum transcriptional regulator of

B. sp (Parasponia) nif & fix expression

nifH B. japonicum structural gene for

dinitro-B. sp (cowpea) genase reductase B. sp (Parasponia)

nifDK B. japonicum structural genes for

dinitro-B. sp (cowpea) genase B. sp (Parasponia)

nifB B. japonicum Fe MoCo synthesis

B. sp (Parasponia)

nifE B. japonicum Fe MoCo synthesis

nifN Fe Moco synthesis

nifS B. japonicum Maturation of nitrogenase

fixA B. japonicum Electron transport to nitrogenase

fixBC B. japonicum Electron transport to nitrogenase

B. sp (Parasponia)

fixIJ B. japonicum Sequence similarity to family of two-component regulatory

proteins

fixR B. japonicum Function unknown : sequence similarity to dehydrogenases

Symbiotic Genes in

Bradyrhizobium

(Continued)

Hydrogen Uptake (HUP)

Penambatan N₂ NH₃, selalu dibebaskan H₂ Gen hup+ (hidrogen uptake) menyandikan :

hidrogenase, meningkatkan fiksasi N₂ simbiotik

Beberapa Alasan :

1. Oksidasi H₂, memungkinkan pengambilan kembali ATP yang digunakan oleh nitrogenase

2. Oksidasi H₂ mengurangi resiko penghambatan nitrogenase oleh H₂

3. Penggunaan O₂ untuk mengoksidasi H₂ dapat melindungi nitrogenase terhadap O₂. nitrogenase sensitif thd O₂.

Energi

Komplek

Nitrogenase

ATP ADP Hidrogenase ATP Generation Electron Carrier H₂ 2NH₃ N₂ H+

Rhizobium leguminosarum

-Nodulation

A. Tahap-tahap pembentukan bintil akar

1. Pengenalan thd pasangan yg benar pd tanaman dan pelekatan bakteri ke rambut akar

2. Penyerbuan rambut akar oleh bakteri melalui pembentukan benang infeksi (infection threat)

3. Perjalanan bakteri ke akar utama lewat benang infeksi 4. Pembentukan bakteroid dlm sel tanaman

5. Pembelahan sel tanaman dan bakteri yg terus menerus, meng-hasilkan bintil akar dewasa

Akar tanaman pepolongan mengeluarkan bahan organik untuk menarik mikroorganisme di sekitar perakaran (termasuk BBA)

Pelekatan BBA dgn akar pepolongan tergantung dari makromolekul pd permukaan rambut akar yg berinteraksi dgn polisakarida BBA

makromolekul : lektin

polisakarida : 2-deoksiglukosa (R. trifolii)

Rambut akar selanjutnya melengkung, lalu bakteri masuk membentuk benang infeksi.

Sel-sel akar yg berdekatan menjadi terinfeksi BBA Sel yg terinfeksi, terangsang membelah (Sitokinin).

Bakteri dlm sel tanaman membelah, berganda, menggembung mem-bentuk sel yg tdk beraturan dan bercabang : bakteroid

Dikelilingi membran sel tanaman (peribacteroid membrane)

Root Nodule Formation

1. Pengenalan thd pasangan dan pelekatan bakteri ke rambut akar

2. Ekskresi nod faktor yang menyebabkan pelengkungan rambut-rambut akar

3. Penyerbuan rambut akar oleh bakteri dan pembentukan benang infeksi (infection threat)

4. Perjalanan bakteri ke akar utama

5. Pembentukan bakteroid dlm sel tanaman

6. Pembelahan sel tanaman dan bakteri yg terus menerus, menghasilkan bintil akar dewasa

Tanaman Dinodulasi Kec Tumbuh Pea R. leguminosarum cepat Bean R. phaseoli cepat Clover R. trifolii cepat Alfalfa R. meliloti cepat

Soybean B. japonicum lambat

Siratro B. japonicum lambat

Lupinus B. lupini lambat

Parasponia B. parasponiae lambat

B. Pembentukan bintil akar : nodulasi

1. Sintesis polisakarida

- B-1,2 glukan EPS --- proses infeksi

- Eksopolisakarida (EPS) --- perkembangan nodul - Lipopolisakarida (LPS) --- pembentukan nodul Mempunyai peranan penting utk nodulasi

R. meliloti mutan (B-1,2 glukan) dpt membentuk bintil tapi

tdk berisi bakteri (pseudonodul)

-Mutan Rhizobium EPS : tidak mampu membentuk nodul Mampu membentuk nodul, tapi tdk mampu menambat N₂ -Efek mutasi, bergantung pada inang

-R. leguminosarum bv. phaseoli (EPS) : bintil normal

-R. leguminosarum bv. viciae (EPS) : tdk membentuk bintil -Mutan R. leguminosarum bv. phaseoli (LPS) :

2. Gen-gen untuk nodulasi (nod)

-Banyak dipelajari pd R. meliloti, R. leguminosarum bv. trifolii, R. leguminosarum bv. viciae

-Pada plasmid pSym : gen-gen nod berada pd fragmen 20 kb Transfer pSym ke spesies lain (resipien), resipien mampu membentuk bintil penambat N2

-Transfer pSym ke Agrobacterium menyebabkan nodul abnormal, fix

-Plasmid pSym pRL1JI dari R. leguminosarum bv. viciae

-Dua kelompok gen nod :

nod ABCIJ : nod umum

nod EFGH : penentu spektrum inang

Nodulation Genes in

Bradyrhizobium

Gene Species function

nodABC B. japonicum Synthesis of essential factor

B. sp (Parasponia) for hair curling & cell div.

nodD1 B. japonicum Positive transcriptional

re-B. sp (Parasponia) gulation for gene expression

nodD2 B. japonicum Unknown function: mutation

B. sp (Parasponia) caused nod

-nodI B. japonicum Unknown function: ATP

de-B. sp (Parasponia) pendent transport protein nodJ B. japonicum Unknown function:

Mem-B. sp (Parasponia) brane location

Nadulation Genes in

Bradyrhizobium

(Continued)

Gene Species Function

nodLMN B. sp (Parasponia) Host range determination

nodSU B. japonicum Unknown function

nodV B. japonicum Host range determination

nodW B. japonicum Transcriptional regulation

nodY B. japonicum Unknown function

Structure of Nodulation Genes

Model for Regulation of

B. japonicum

Nodulation Genes

Isoflavon

NodD1 Protein

nodA nodY nodD1

nodM nodL nodE nodF nodD nodA nodB nodC nodI nodJ

Structure of nod Genes of R. leguminosarum

bv. viciae Sym Plasmid pRL1JI

Represi Aktivasi

3. Regulasi ekspresi gen nod

a. R. leguminosarum bv. viciae

nod ABCIJ, nod FE, dan nod D ditumbuhkan pada media penumbuhan yang normal --- hanya nod D yg ditranskripsi Jika eksudat akar (pea) ditambahkan pd media, nodFE dan nod ABCIJ aktif terekspresi, berarti eksudat akar tanaman inang dan gen nod D diperlukan untuk mengaktivasi operon nod.

b. Flavonoid merupakan suatu inducer

Flavon luteolin, menginduksi ekspresi gen nod R. meliloti 7,4-dihidroksi flavon, menginduksi ekspresi gen nod

R. meliloti flavon dan flavanon mengaktivasi gen nod R. leguminosarum bv. viciae.

Biotechnological

Application

Produksi inokulan untuk Tanaman Legum

Biofertilizer

Bioremediasi: Bioakumulasi Logam Berat

Inokulan pada Tanah Marginal & Netral