31 BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini menggunakan jenis penelitian true experimental dan rancangan penelitian yang digunakan adalah post test only control group design.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
4.2.1 Lokasi penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Universitas Brawijaya Malang.
4.2.2 Waktu penelitian
Penelitian dilaksanakan dari tanggal 27 Mei 2021 sampai 17 Juni 2021.
4.3 Populasi dan Sampel
4.3.1 Populasi
Populasi yang digunakan oleh peneliti adalah tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar) dengan jenis kelamin jantan.
4.3.2 Sampel
Sampel diambil dari populasi tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar) dengan jenis kelamin jantan yang memenuhi kriteria inklusi.
4.3.3 Besar sampel
Menggunakan replikasi jumlah sampel menggunakan Rumus Frederer, yaitu: (r-1)(t-1) ≥ 15 (r-1)(4-1) ≥ 15 (r-1) ≥ 15/3 r ≥ 5+1 r ≥ 6 Keterangan:
r: jumlah replikasi tiap kelompok
t: jumlah kelompok perlakuan
Berdasarkan rumus diatas, didapatkan jumlah replikasi tiap kelompok adalah enam. Sebagai antisipasi adanya drop out pada proses adaptasi, ditambahkan 25% sebagai cadangan (satu ekor tikus) untuk tiap kelompok perlakuan, sehingga dalam penelitian ini digunakan 28 ekor tikus. 28 ekor tikus ini akan masuk bersamaan pada proses adaptasi. Setelah proses adaptasi selesai, dilakukan pengambilan sampel sebanyak 24 ekor tikus yang akan dibagi menjadi empat kelompok, sehingga masing-masing kelompok terdiri dari enam ekor tikus. empat ekor tikus yang telah melewati proses adaptasi tetapi tidak masuk ke dalam sampel, akan dipelihara hingga
penelitian selesai dan tidak mendapat perlakuan untuk meminimalkan penggunaan tikus dalam penelitian ini.
4.3.4 Teknik pengambilan sampel
Pengambilan sampel yang dilakukan peneliti menggunakan teknik simple random sampling.
4.3.5 Karakteristik sampel penelitian a. Kriteria Inklusi
Tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar) berjenis kelamin jantan, berumur 2-3 bulan pada saat pemilihan sampel dengan berat badan 180-200 gram, gerak aktif, mata jernih, dan dalam kondisi sehat.
b. Kriteria Eksklusi
Tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar) jenis kelamin jantan: • Cacat sebelum perlakuan.
• Sakit sebelum penelitian. c. Kriteria Drop Out
Tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar) yang sakit selama proses penelitian atau mati selama proses penelitian.
4.4 Variabel Penelitian a. Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian minuman ringan pada tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar) berjenis kelamin jantan yang memenuhi kriteria inklusi.
b. Variabel Terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah perubahan tekanan darah tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar).
4.5 Definisi Operasional
No. Variabel Definisi Operasional
Instrumen dan Kriteria Hasil Ukur Skala 1 Pemberian minuman ringan Pemberian minuman ringan dengan merk dagang Coca-Cola®
Diberikan menggunakan spuit 1 ml secara per oral menggunakan sonde setiap hari selama 30 hari. Setiap dosis diberikan tiga kali pemberian dengan jarak antar pemberian 10 menit. Hasil ukur: 1. Dosis I: 1/2 x 6 ml/200grBB/hari = 3 ml/200grBB/hari 2. Dosis II: 1 x 6 ml/200grBB/hari = 6 ml/200grBB/hari 3. Dosis III: 2 x 6 ml/200grBB/hari = 12 ml/200grBB/hari Kategorik (ordinal) 2 Perubahan tekanan darah tikus putih (Rattus novergicus strain wistar) berjenis kelamin jantan Melihat perubahan tekanan darah akibat pemberian minuman ringan dengan merk dagang Coca-Cola®
Perubahan tekanan darah diamati dengan menggunakan alat pengukur tekanan darah CODA®, setiap pengukuran dilakukan 15 kali pengulangan untuk masing-masing hewan coba yang kemudian diambil rata-ratanya. Pengukuran tekanan darah mengukur enam parameter darah secara bersamaan yaitu tekanan darah sistolik, tekanan darah diastolik, tekanan arteri rata-rata, denyut jantung, volume darah, dan aliran darah pada ekor.
Rasio
4.6 Alat dan Bahan Penelitian
4.6.1 Alat penelitian
b. Kandang tikus c. Sonde
d. Alat tekanan darah non invasif (CODA® , Kent Scientific, USA) e. Occlusion cuff f. VPR cuff g. Animal holder h. Warming pad i. Laptop 4.6.2 Bahan penelitian
a. Makanan dan minuman standard (BR1) hewan percobaan
b. Tikus putih (Rattus norvegicus strain wistar) berjenis kelamin jantan c. Minuman ringan dengan merk dagang Coca-Cola® dengan dosis 3, 6,
dan 12 ml/tikus/hari
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Proses adaptasi
Tikus diadaptasikan di dalam kandang yang diletakkan di Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang selama 7 hari agar tikus dapat menyesuaikan diri dengan lingkungan baru.
4.7.2 Penentuan dosis
Penentuan dosis minuman ringan dilakukan berdasarkan dosis manusia dengan berat badan 70 kg dikoversikan pada tikus (200 gram) menggunakan tabel konversi dengan faktor konversi 0,018. Jika dosis
takaran saji minuman ringan dalam satu kemasan adalah 330 ml yang diperkirakan dikonsumsi manusia, dengan perkiraan berat badan tikus 200 gram, maka konversi dosis minuman ringan yang diberikan pada tikus adalah 0,018 x 330 ml/200g/hari = 5,9 ml/200grBB/hari dibulatkan menjadi 6 ml/200grBB/hari.
Konsumsi harian rata-rata seekor tikus dewasa adalah 15-25 gram makanan dan 30-50 ml cairan. Volume cairan yang dapat diberikan peroral pada tikus yang aman adalah 3-5 ml. Waktu pengosongan cairan pada lambung tikus ialah sekitar 10 menit, sehingga pada penelitian pemberian minuman ringan kepada tikus akan dibagi menjadi tiga dosis (Hatton et al., 2015).
Pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Raj et al. (2009)menunjukkan tikus yang diberi minuman ringan 3 ml (0,3mg kafein) dapat meningkatkan kadar triasil gliserol, glukosa, ALT dan ALP serum, TBARS di hati dan ginjal, triasil gliserol, kolesterol total di ginjal, dan menurunkan kadar albumin serum. Pemberian minuman ringan meningkatkan kolesterol total melalui penurunan kadar HDL.
Konversi dosis yang digunakan dalam penelitian ini untuk tikus Rattus novergicus strain wistar adalah sebagai berikut:
• Dosis I: 1/2 x 6 ml/200grBB/hari = 3 ml/200grBB/hari • Dosis II: 1 x 6 ml/200grBB/hari = 6 ml/200grBB/hari • Dosis III: 2 x 6 ml/200grBB/hari = 12 ml/200grBB/hari
4.7.3 Pemberian dosis
Dosis diberikan setiap hari selama 30 hari pukul 10.00 - 13.00 WIB melalui peroral menggunakan sonde. Setiap dosis dibagi menjadi tiga kali pemberian dengan jarak antar pemberian 10 menit.
4.7.4 Penentuan kelompok
Pada penelitian ini, 24 ekor tikus dibagi menjadi empat kelompok dan masing-masing kelompok diisi oleh enam ekor tikus.
• Kelompok K1: Kelompok yang diberi aquades menggunakan sonde dan tidak diberi minuman ringan, digunakan sebagai kontrol negatif sebagai pembanding untuk kelompok perlakuan di statistik.
• Kelompok P1: Kelompok yang diberi dosis minuman ringan 3 ml/200grBB/hari.
• Kelompok P2 : Kelompok yang diberi dosis minuman ringan 6 ml/200grBB/hari.
• Kelompok P3 : Kelompok yang diberi dosis minuman ringan 12 ml/200grBB/hari.
4.7.5 Pengukuran tekanan darah
1. Pengamatan hewan coba dilakukan dengan pengukuran tekanan darah tanpa anestesi menggunakan metode tail-cuff auto-pickup.
2. Pengukuran dilakukan pada hari ke 30 menggunakan alat pengukur tekanan darah non invasif CODA®.
3. Metode pengukuran tekanan darah non invasif dilakukan dengan manset ekor yang dinamakan cuff terdapat Volume Pressure Recorder (VPR) cuff dan occlusion cuff.
4. Restrain tikus dilakukan di tempat khusus menggunakan animal holders 5. Tikus terlebih dahulu dihangatkan dengan suhu 37°C pada warming pad
sampai suhu tikus mencapai suhu optimum.
6. Occlusion cuff dipasang menggunakan karet disposibel pada ekor tikus, kemudian diikuti dengan VPR cuff sebagai detektor denyut.
7. Cuff secara otomatis akan mengembang menekan ekor tikus yang dialiri darah dan denyut aliran darah akan terdeteksi. Denyut yang terukur merupakan tekanan darah sistolik tikus.
8. Setiap pengukuran dilakukan 15 kali pengulangan untuk masing-masing hewan coba yang kemudian diambil rata-ratanya.
9. Pengukuran tekanan darah mengukur enam parameter darah secara bersamaan yaitu tekanan darah sistolik, tekanan darah diastolik, tekanan arteri rata-rata, denyut jantung, volume darah, dan aliran darah pada ekor.
4.7.6 Perlakuan setelah tindakan pada hewan coba
1. Setelah tekanan darah tikus diukur, tikus di-euthanasia pada tempat yang terpisah dari keberadaan hewan lain.
2. Tikus yang telah mati dikumpulkan (tidak dibungkus)
3. Tikus dimasukkan kedalam lubang pada tanah yang kering dengan kedalaman 1 meter dan dengan jarak minimal 250 meter dari sumber air
4. Masing-masing lubang berisi tidak lebih dari sepuluh ekor tikus.
4.8 Analisis Data
Pada penelitian ini, diawali dengan menggunakan uji normalitas dan ujihomogenitas. Apabila sebaran data normal digunakan uji One Way Anova, lalu uji Post Hoc Bonferroni jika varian data sama. Pertama hasil penelitian dianalisis apakah data terdistribusi normal atau tidak secara statistik dengan uji normalitas. Untuk mengukur normalitas, uji yang bisa dilakukan yaitu uji Kolmogorov-Smirnov atau Shapiro-Wilk. Karena pada penelitian ini jumlah sampel ≤50 maka uji yang dilakukan adalah uji Shaphiro-Wilk. Setelah uji normalitas data, dan didapatkan data terdistribusi normal, untuk mengetahui apakah dua atau lebih kelompok data memiliki varian yang sama atau tidak maka dilakukan uji Levene. Apabila didapatkan data yang terdistribusi normal dan homogen maka dilanjutkan dengan uji parametrik one way ANOVA. Namun bila tidak memenuhi syarat untuk dilakukan uji parametrik, pengujian akan menggunakan uji non-parametrik yaitu Kruskal-Wallis, hipotesis dapat dikatakan diterima ketika nilai p<0,05. Selanjutnya dilakukan analisis post-hoc Bonferroni jika varian data sama.
4.9 Alur Penelitian
Persiapan penelitian
Pemeriksaan kriteria inklusi dan ekslusi
P 3 Kelompok perlakuan hewan
coba Aklamatisasi hewan coba P 2 P 1 K 1 Diberikan minuman ringan dosis 12 ml/200grB B/hari Diberikan minuman ringan dosis 6 ml/200grB B/hari Diberikan minuman ringan dosis 3 ml/200grB B/hari Diberikan aquades sebagai kontrol
Intervensi selama 30 hari, lalu dilakukan pengukuran tekanan darah pada hewan coba
