Optimasi komposisi etanol dan air dalam proses maserasi daun singkong (Manihotis folium) dengan aplikasi simplex lattice design - USD Repository

(1)

OPTIMASI KOMPOSISI ETANOL DAN AIR DALAM PROSES MASERASI DAUN SINGKONG (Manihotis Folium) DENGAN APLIKASI

SIMPLEX LATTICE DESIGN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Veronika Yuni Candra Sari NIM : 068114051

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

(2)

ii

OPTIMASI KOMPOSISI ETANOL DAN AIR DALAM PROSES MASERASI DAUN SINGKONG (Manihotis Folium) DENGAN APLIKASI

SIMPLEX LATTICE DESIGN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Veronika Yuni Candra Sari NIM : 068114051

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

(3)

(4)

(5)

v

Aku persembahkan kepada:

(6)

vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Unversitas Sanata Dharma : Nama : Veronika Yuni Candra Sari

NIM : 068114051

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

OPTIMASI KOMPOSISI ETANOL DAN AIR DALAM PROSES MASERASI DAUN SINGKONG (Manihotis Folium)

DENGAN APLIKASI SIMPLEX LATTICE DESIGN

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 21 April 2010

Yang menyatakan

(7)

vii

KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “ Optimasi Komposisi Etanol dan Air dalam Proses Maserasi Daun Singkong (Manihotis Folium) dengan Aplikasi Simplex Lattice Design” sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar sarjana pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian ”Optimasi Formula dan Kontrol Kualitas Sediaan Tablet Effervescent Ekstrak Centelae asiatica Herba dan Manihotis Folium” yang dibiayai Hibah Bersaing Dikti tahun 2009. Dalam

penulisan skripsi ini, penulis mendapatkan bantuan dari banyak pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan penghargaan dan ucapan terima kasih kepada :

1. Bapak Albertus Budi Yuwono dan Ibu Christina Sri Rahayu yang selalu menyertai saya dengan kasih sayang, doa, restu, dan dukungannya yang menguatkan saya.

2. Rita Suhadi, M.Si. Apt., selaku dekan Fakultas Farmasi yang telah mendukung penelitian ini.

3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen pembimbing atas bimbingan dan pengarahannya baik selama penelitian maupun penyusunan skripsi ini. 4. Agatha Budi Susiana Lestari, M.Si., Apt selaku dosen Ketua Penelitian ini

(8)

viii

5. Reny Kusumastuti, M.P., atas bimbingan dan masukan yang telah diberikan kepada para peneliti.

6. Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen penguji yang telah memberikan banyak masukan kepada peneliti.

5. Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Andri, dan Mas Sarwanto, Mas Kunto, Mas Bimo, Mas Parlan, Mas Kayat, Pak Iswandi, Mas Ottok, Mas Agung, dan seluruh laboran atas bantuannya selama peneliti bekerja di laboratorium Fakultas Farmasi.

6. Laurensia Utami Susanti, Bernadeta Ardy Puspitarini, Alvonsus Rudianto, atas kerjasamanya dalam penelitian ini, suka dan duka yang telah kita lalui bersama.

7. Valentina Vevi Yuwana Sari, Cornelius Fivtria Yuwana Putra, Cornelia Omega Pravita Sari, dan Laurensia Vicky Yuwana Sari, atas dukungan, doa dan semangatnya.

8. Elfrieda Ignatine, Danie ”Nduty”, Antonius Tri Kresmianto yang dengan setia mendengarkan keluhan saya dan memberikan masukan serta dukungan yang membangun kembali semangat saya.

9. Maria Yolanda, Gayatri Kusuma Wardani, Pius Perwita, Aditya Eka Prasetya, Robertus Satrio, Oktavianus Rico, dan teman-teman FST 06, yang selalu saling mendukung untuk mengerjakan skripsi dan terus berjuang untuk mengejar cita-cita. Bersama kita bisa kawan. God bless us...

(9)

ix

11. Kakak Emil, Sekar, Siska, Dewati, Nisa, Nita, teman-teman KKNku yang selalu mendukung dan menyemangati untuk mengerjakan skripsi ini.

12. Segenap rekan dan pihak-pihak yang telah membantu dan mendukung saya, namun tidak dapat disebutkan satu persatu. Terima kasih.

Akhir kata penulis menyadari bahwa karya penulisan skripsi ini jauh dari sempurna mengingat keterbatasan kemampuan dan pengalaman yang dimiliki. Oleh karena itu, saran dan kritik yang sifatnya membangun sangat diperlukan oleh penulis demi kesempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat memberikan sumbangsih yang bermanfaat pada perkembangan ilmu pendidikan.

Yogyakarta, April 2010

(10)

x

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana karya ilmiah.

Yogyakarta, April 2010

(11)

xi INTISARI

Pada penelitian ini dilakukan optimasi komposisi etanol dan air sebagai penyari dalam proses maserasi Manihotis utillissima. Metode optimasi yang digunakan adalah Simplex Lattice Design. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui perbandingan pelarut antara etanol 96% dengan air yang optimum untuk mendapatkan ekstrak dengan kadar rutin yang tertinggi dan apakah suhu pada proses maserasi berpengaruh dalam mendapatkan kadar rutin yang tertinggi.

Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan menggunakan aplikasi Simplex Lattice Design yang menggunakan dua faktor yaitu perbandingan etanol dan air. Penelitian ini diawali dengan melakukan determinasi tanaman, pembuatan simplisia, pembuatan serbuk, penyarian dengan cara maserasi pada tiga suhu yang berbeda, yaitu 30oC, 40oC, dan 50oC. Analisa kualitatif dilakukan dengan menggunakan KLT lempeng selulosa dengan fase gerak butanol:asam asetat:air (4:1:5) v/v, dan deteksi bercak menggunakan uap amonia dan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm. Penetapan kadar rutin dengan menentukan luas area bawah kurva (AUC) menggunakan program Image J.

Hasil analisa menunjukkan bahwa komposisi etanol pelarut yang menghasilkan kadar rutin tertinggi adalah 100% etanol 96% tanpa ditambah dengan air, dengan rata-rata kadar rutin 5,9664µg/µl ± 2.4718. Suhu yang menghasilkan rata-rata kadar rutin tertinggi adalah suhu 30oC.

(12)

xii ABSTRACT

The research is going to see the composition of ethanol and water as a solvent in the process of Manihotis Folium maseration. Optimation method that used simplex lattice design. The aim of the research is going to find out the optimum ratio between ethanol and water in order to obtain the extract with the highest of rutin concentratrion and to see whether the temperatur of the maseration process may cause getting the highest level of rutin concentration.

The research was a pure experimental research using simplex lattice design application. Simplex lattice design application used two factors of ethanol and water ratio. The research began by plants determination, making of simplisia, making of powder, extration of maserasi on the three level of different temperatur, they were 30 celcius degree, 40 celcius degree, and 50 celcius degree. Qualitative analyze used cellulose TLC plat with mobile phase of butanol, acetic acid, water (4:1:5 ), and spot detection used amonia fume and UV light on wave length of 254 nm. Determination of rutin concentration by determining AUC used Image J program.

The result showed that solvent composition produce the highest rutin concentration was 100 % ethanol, with the means of rutin concentration was 5.9664/µl ± 2.4718. The temperature on maseration was procude higher means of the rutin concentration is 30 celcius degree.

(13)

xiii DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL ... i

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

HALAMAN PENGESAHAN ... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ... v

HALAMAN PENYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ... vi

PRAKATA ... vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... . x

INTISARI ... xi

ABSTRAK ... xii

DAFTAR ISI ………... xiii

DAFTAR TABEL ………xvi

DAFTAR GAMBAR ………..xvii

DAFTAR LAMPIRAN ………..xix

BAB I PENDAHULUAN ... 1

A. Latar Belakang ... 1

1. Perumusan Masalah ... 4

2. Keaslian Penelitian ... 4

3. Manfaat Penelitian ... 4

B. Tujuan Penelitian ... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6

A.Tanaman Singkong ……… ... 6

1. Keterangan botani ... 6

2. Nama Daerah ... 7

3. Kandungan Kimia ... 7

B.Rutin ... 7

(14)

xiv

D.Ekstrak ……….. 10

E.Kromatografi Lapis Tipis ... 11

F. Image J ... 14

G.Simplex Lattice Design ... 14

H.Landasan Teori ... 16

I. Hipotesis ... 17

BAB III METODE PENELITIAN... 18

A.Jenis dan Rancangan Penelitian ... 18

B.Variabel Penelitian ... 18

C.Definisi Operasional ... 18

D.Bahan Penelitian ... 19

E.Alat Penelitian ... 19

F. Tata Cara Penelitian ... 20

1. Determinasi tanaman Manihotis escullenta Crantz ... 20

2. Pengumpulan daun singkong ... 20

3. Pembuatan simplisia Manihotis Folium ... 20

4. Pengumpulan serbuk Manihotis Folium ... 20

5. Pembuatan ekstrak Manihotis Folium ... 20

6. Validasi metode ... 21

7. Analisis kualitatif ekstrak ... 22

8. Analisis kuantitatif ekstrak. ... 23

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi tanaman ... 25

B. Pengumpulan daun singkong ... 26

C. Pembuatan simplisia ... 26

D. Pembuatan serbuk ... 27

E. Pembuatan ekstrak ... 27

F. Validasi metode ... 29

(15)

xv

H. Analisis kualitas ekstrak ... 36

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 43

A.Kesimpulan ... 43

B.Saran ... 43

DAFTAR PUSTAKA ... 44

Lampiran ... 46

(16)

xvi

DAFTAR TABEL

Tabel I. Perbandingan pelarut maserasi ... 21

Tabel II. Seri kurva baku ... 30

Tabel III. Nilai recovery ... 32

Tabel IV. Nilai presisi ... 33

Tabel V. Harga Rf dan warna bercak baku rutin dan sampel ekstrak rutin di deteksi dengan uap ammonia ... 36

Tabel VI. Kadar rutin dari tiap replikasi dari tiga peringkat suhu proses maserasi ... 37

(17)

xvii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Tanaman singkong ... 6

Gambar 2. Struktur rutin... 8

Gambar 3. Serbuk Manihotis Folium ... 27

Gambar 4. Ekstrak kental Manihotis Folium ... 29

Gambar 5. Kurva baku 1 ... 31

Gambar 8. Kromatogram baku rutin dan sampel ekstrak rutin dideteksi dengan uap ammonia... 35

Gambar 9. Kurva validitas persamaan SLD suhu 30oC ... 40

(18)

xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat determinasi simplisia ... 46

Lampiran 2. Penetapan bobot konstan ekstrak Manihotis Folium ... 47

Lampiran 3. Penimbangan ekstrak Manihotis Folium ... 54

Lampiran 4. Penimbangan standar rutin ... 56

Lampiran 5. Validasi metode ... 57

Lampiran 6. Penetapan kadar rutin dengan Image J ... 59

Lampiran 7. Rendemen kadar rutin terhadap berat ekstrak ... 68

Lampiran 8. Analisis persamaan SLD ... 72

Lampiran 9. Uji validitas persamaan SLD ... 75

(19)

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Saat ini penyakit degeneratif menjadi salah satu penyakit yang berbahaya, karena berimbas pada kualitas dan produktivitas seseorang. Jika penyakit tidak ditangani dengan tepat dapat menyebabkan kondisi komplikatif yang lebih parah. Maka dibutuhkan tindakan preventif maupun pengobatan sejak dini.

Penyakit degeneratif biasanya muncul karena pola makan dan gaya hidup yang tidak sehat. Penurunan kondisi kesehatan ini sering ditandai dengan munculnya berbagai gejala awal yang apabila tidak segera ditangani dengan benar dapat memicu ke kondisi yang lebih parah. Gejala dari penyakit degeneratif seperti menurunnya daya ingat, mudah stress, sulit tidur, penuaan dini, dan meningkatnya tekanan darah.

(20)

Bahan alam yang digunakan sebagai food supplement biasanya berasal dari tanaman yang ada disekitar kita. Salah satunya adalah daun singkong yang biasanya dikenal oleh masyarakat sebagai sayuran ternyata mempunyai kandungan glikosida flavonoid yaitu rutin, yang berkhasiat sebagai antioksidan. Menurut Wijayakusuma (2008), efek farmakologis dari singkong adalah sebagai antioksidan, antikanker, antitumor, dan menambah nafsu makan. Bagian yang umum digunakan oleh masyarakat pada singkong adalah daun dan umbi. Selain sebagai makanan, tanaman singkong memiliki berbagai khasiat sebagai obat, seperti obat rematik, sakit kepala, demam, luka, diare, cacingan, disentri, rabun senja, beri-beri, dan bisa meningkatkan stamina. Selain itu daun singkong (Manihotis Folium) juga mengandung vitamin A, B1 dan C, kalsium, kalori, fosfor, protein, lemak, hidrat arang, dan zat besi (Anonim, 2008).

Rutin selain sebagai antioksidan juga mempunyai efek menghambat terjadinya penggumpalan trombosit, sehingga darah lebih encer dan sirkulasi darah lancar, serta menjaga elastisitas kapiler pembuluh darah. Rutin yang terdapat dalam daun singkong tersebut disari dengan menggunakan metode maserasi, dengan pelarut etanol 96% dan air. Digunakan pelarut etanol 96% dan air karena rutin mempunyai kelarutan yang baik terhadap etanol dan air (Anonim, 2007), sehingga dari campuran pelarut tersebut dapat mengoptimalkan tersarinya rutin dari serbuk Manihotis Folium. Bila pelarut yang digunakan seluruhnya etanol 96% maka

(21)

Proses ekstraksi yang digunakan maserasi karena maserasi merupakan proses ekstraksi yang paling mudah dan sederhana. Peredaman dan penggojogan dalam proses maserasi menyebabkan adanya perbedaan konsentrasi rutin di dalam serbuk Manihotis Folium dengan di pelarut, maka rutin yang larut dalan pelarut akan berdifusi keluar ke pelarutnya.

Optimasi komposisi pelarut campuran ini dilakukan karena sampai saat ini belum diketahui komposisi etanol dan air yang menghasilkan kadar rutin tertinggi pada proses maserasi Manihotis Folium. Komposisi optimum pelarut campuran etanol dan air dapat diketahui dengan aplikasi Simplex Lattice Design, untuk mengurangi trial and error. Berdasarkan metode aplikasi Simplex Lattice Design, akan diperoleh lima perbandingan pelarut campuran yang akan menghasilkan ekstrak dengan kenampakan fisik dan kandungan rutin yang berbeda. Ekstrak yang dihasilkan dari kelima perbandingan tersebut ditetapkan kadar rutin secara KLT dengan analisis Image J. Dari hasil penetapan kadar tersebut akan diketahui komposisi pelarut yang bisa menghasilkan kadar rutin tertinggi.

(22)

1. Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang, masalah yang muncul dapat dirumuskan sebagai berikut:

a. Berapakah kadar rutin di masing-masing peringkat suhu yang digunakan dalam proses maserasi yaitu suhu 30oC, 40 oC, dan 50 oC?

b. Berapakah komposisi optimum antara etanol 96% dengan air, untuk mendapatkan kadar rutin yang tertinggi?

2. Keaslian Penelitian

Sejauh penelusuran pustaka yang dilakukan oleh penulis, penelitian tentang optimasi komposisi etanol dan air pada proses maserasi dengan 3 peringkat suhu 30oC, 40 oC, dan 50 oC dari daun singkong untuk mendapatkan kadar rutin yang tertinggi dengan aplikasi Simplex Lattice Design belum pernah dilakukan.

3. Manfaat Penelitian a. Manfaat Teoritis

(23)

b. Manfaat Praktis

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan data mengenai pengaruh komposisi etanol dan air dalam proses maserasi daun singkong serta komposisi cairan penyari etanol 96% dan air paling optimal untuk mendapatkan ekstrak dengan kadar rutin tertinggi.

B. Tujuan

1. Mengetahui suhu maserasi yang dapat menghasilkan kadar rutin tertinggi dari peringkat suhu yang digunakan dalam proses maserasi yaitu 30oC, 40 oC, dan 50 oC.

(24)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Tanaman Singkong 1. Keterangan Botani

Gambar 1. Tanaman Singkong

Tanaman singkong (Manihot utillissima Pohl, familia Euphorbiaceae) berasal dari Brazilia. Tanaman ini termasuk jenis perdu yang mempunyai karakteristik bergetah dan bunganya berwarna putih (Steenis, 1992).

(25)

2. Nama daerah tanaman singkong

Sumatera : ketela, ubi kayu, gadung hau of garung kau Jawa : ubi singkong, bodin, bolet, kasawe, kaspa Sulawesi : batata kayu

Maluku : ubi prancis

Kalimantan : peti kayu

Irian : nota, amberphone, timuria 3. Kandungan kimiawi tanaman singkong

Jaringan floem tanaman singkong mengandung asam fenolat dan tiga glikosida flavonoid utama yaitu rutin dan dua isomer mengandung kemferol. Juga terkandung glukosida sianogen (linamarin dan lautostralin) dalam jumlah besar, hampir lima kali lipat kadar total asam amino (Leru dan Calatayud, 1994).

Duke (1999) menyampaikan bahwa daun singkong yang masih muda mengandung cukup banyak vitamin B sehingga bagus untuk pengobatan beri-beri. Metabolit sekunder lain yang ada antara lain beta-carotene equivalent (0,16 mg/100 g).

B. Rutin

(26)

Gambar 2. Struktur Rutin

(Anonim, 2007).

Rutin mempunyai aktivitas antioksidan, antiinflamasi, antikanker, antitrombotik, sitoprotektif, dan vasoprotektif (Anonim, 2007). Rutin yang juga terdapat di dalam daun singkong, dapat menekan tumor yang mengarah pada kanker usus dan menunda perkembangan hiperkolesterinemia dan sindrom peroksidasi, juga pada atherosclerosis aorta. Bioflavonoid memiliki efek antibakteri dan meningkatkan sirkulasi, memacu produksi empedu dan mencegah katarak. Konsumsi bioflavonoid bersama vitamin C dapat pula mengurangi gejala pada herpes oral. Daun singkong juga mengandung vitamin C dan A dalam jumlah besar. Kekurangan konsumsi bioflavonoid dapat mengakibatkan kerapuhan kapiler, gusi berdarah, dan memar (Anonim, 2007).

(27)

C. Maserasi

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana dan digunakan untuk simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia atau daun segar dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan di luar sel, maka larutan yang pekat akan terdesak keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi kesetimbangan konsentrasi antara larutan di luar dan di dalam sel (Anonim, 1986).

Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengojogan atau pengadukan pada suhu ruangan (kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang terus-menerus. Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya (Anonim, 2000).

(28)

berulang-ulang ini memungkinkan pelarut masuk ke seluruh permukaan dari bahan serbuk simplisia (Ansel, 1990).

Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan, dan peralatan yang digunakan sederhana, dan mudah dilakukan. Adapun kerugian cara maserasi adalah waktu pengerjaan yang lama dan penyarian kurang sempurna. Cara maserasi ini dapat dipercepat dengan menggunakan mesin pengaduk yang terus-menerus berputar sehingga mempersingkat waktu maserasi menjadi 6-24 jam (Anonim, 1986).

D. Ekstrak

Ekstrak merupakan sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, di luar pengaruh cahaya matahari langsung. Ekstrak kering harus mudah digerus menjadi serbuk. Sebagai cairan penyari digunakan air, eter, atau campuran etanol dan air. Penyarian simplisia dengan air dilakukan dengan cara maserasi, perkolasi, atau penyeduhan dengan air mendidih. Penyarian dengan campuran etanol dan air dilakukan dengan cara maserasi atau perkolasi. Penyarian dengan eter dilakukan dengan cara perkolasi (Anonim, 1979).

(29)

Berdasarkan sifatnya, ekstrak dibagi menjadi: 1. Ekstrak kental

Ekstrak kental merupakan hasil penguapan ekstrak cair pada tekanan rendah dan suhu tidak lebih dari 50oC hingga konsistensi yang dikehendaki (Anonim, 1986). Menurut Voigt (1994) ekstrak ini liat dalam keadaan dingin dan tidak dapat dituang. Kandungan airnya berjumlah hingga 30%.

2. Ekstrak kering

Ekstrak kering memiliki konsistensi kering. Melalui penguapan cairan pengekstraksi dan pengeringan sisanya akan terbentuk suatu produk, yang sebaiknya memiliki kandungan lembab tidak lebih dari 5% (Voigt, 1994) 3. Ekstrak cair

Sediaan cair simplisia nabati, yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet. Jika tidak dinyatakan lain pada pada masing-masimg monografi setiap 1 ml ekstrak mengandung bahan aktif dari 1 gram simplisia yang memuhi syarat. Ekstrak cair cenderung membentuk endapan yang dapat diendapkan dan disaring (Anonim, 1995).

E. Kromatografi Lapis Tipis

(30)

berfluoresensi. Adapun cara kimia yaitu dilakukan penyemprotan dengan substansi kimia yang akan memberikan noda atau bercak baik yang terlihat pada cahaya tampak ataupun sebagai noda yang tampak pada lampu ultraviolet (Hardjono, 1983).

Menurut Stahl (1985) zat yang akan dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis biasanya berupa larutan dan ditotolkan pada fase diam menjadi sebuah bercak. Fase diam dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk KLT yang biasanya ditopang dengan logam atau kaca. Panjang lapisan tersebut 200 mm dengan lebar 200 atau 100 mm. Untuk analisis, tebalnya 0,1-0,3 mm, biasanya 0,2 mm. Sebelum digunakan, lapisan disimpan dalam lingkungan yang tidak lembab atau bebas dari uap. Silika gel merupakan fase diam yang paling banyak digunakan dalam KLT. Material ini dapat langsung digunakan atau dicampur dengan pengikat misalnya kalsium sulfat untuk membuat lapisan yang lebih kohesif. Bila digunakan pengikat CaSO4 maka pada namanya diberi tanda G, misalnya silika gel G, dan bila dicampur dengan indikator fluoresensi diberi tanda F, misalnya silika gel GF (Stahl,1985).

Fase gerak ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Pelarut bergerak di dalam fase diam yang berupa lapisan berpori karena ada gaya kapiler. Kecepatan perambatan tergantung viskositas pelarut dan struktur lapisan. Fase gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran pelarut (Stahl, 1985).

(31)

sederhana adalah campuran pelarut organik yang dipakai untuk memisahkan molekul yang mempunyai satu dan atau dua gugus fungsi. Faktor yang harus diingat dalam mencampur pelarut untuk membuat larutan pengembang (fase gerak) adalah pelarut yang mempunyai kepolaran yang serupa yang dapat dicampur dimana kepolaran campuran tidak merupakan fungsi linier dari susunan campuran tetapi merupakan fungsi logaritma (Gritter, Bobit, Scharting, 1991).

Penotolan dimulai 1,5 cm dari tepi lempeng bagian bawah, jarak antara 2 totolan 1cm dan diameter totolan 2-5mm. Sampel ditotolkan pada lempeng yang sudah dilapisi dengan menggunakan mikropipet atau syringe dengan volume penotolan 1-5µl (Gritter et al., 1991).

Menurut (Gritter et al., 1991) proses pengembangan merupakan proses pemisahan campuran cuplikan karena larutan pengembang merambat naik dalam lapisan. Jarak pengembangan normal yaitu jarak antara mulai penotolan dan hingga batas perambatan adalah 10 cm.

Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan penyerapan di daerah UV gelombang pendek (radiasi utama kira-kira 254 nm) atau jika senyawa ini dapat dieksitasi ke fluoresensi radiasi UV gelombang pendek dan atau gelombang panjang (365 nm). Jika dengan kedua cara ini senyawa tidak dapat dideteksi maka harus dicoba dengan reaksi kimia. Pertama tanpa pemanasan lalu bila perlu dengan pemanasan (Stahl, 1985).

(32)

Angka Rf berjarak antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. hRf ialah angka Rf dikalikan faktor 100 (Stahl, 1985).

F. Image J

Image J adalah suatu software java yang digunakan untuk memproses dan

menganalisa suatu gambar, seperti gambar sel secara 3 dimensi, rambar radiological, atau system multi gambar perbandingan system hemologi. Image J

dirancang dan dibuat menjadi program yang lebih mudah dipahami dan digunakan untuk proses mempelajari suatu gambar. Image J dapat digunakan untuk menghitung area, statistic, nilai pixel, dan intesitas dari suatu obyek gambar, seperti penggunaan KLT-densitometer (Anonim, 2008). Lempeng KLT yang telah dielusi kemudian dihitung intensitas bercaknya menggunakan program Image J (Zeligz and Bradlow, 2006).

G. Simplex Lattice Design

Formula yang optimal seringkali dapat diperoleh dengan penerapan Simplex Lattice Design. Penerapan Simplex Lattice Design digunakan untuk

(33)

Simplex Lattice Design adalah penelitian dasar terdiri dari berbagai kelarutan zat

pada pelarut A saja (100% - 1 bagian), pada pelarut B saja (100% - 1 bagian, dan campuran pelarut A dan B masing-masing 50% (masing-masing 0,5 bagian). Dalam pendekatan yang sederhana akan dihasilkan persamaan sebagai berikut:

Y = a (A) + b (B) + ab (A)(B), Dengan keterangan sebagai berikut: Y = respon (hasil penelitian) (A) = kadar proporsi komponen A (B) = kadar proporsi komponen B

a, b, ab = koefisien yang dihitung dari pengamatan penelitian

Untuk mendapatkan persamaan di atas diperlukan tiga formula. ketiga formula tersebut adalah I menggunakan 100% pelarut A, II menggunakan 100% pelarut B, dan III menggunakan 50% pelarut A dan 50% pelarut B. Contoh penerapan Simplex Lattice Design adalah sebagai berikut, misalnya:

F I = Percobaan yang menggunakan pelarut 100% A, dari hasil percobaan dapat melarutkan zat 10 mg/ml.

F II = Percobaan yang menggunakan pelarut 100% B, dari hasil percobaan dapat melarutkan zat 15 mg/ml.

F III = Percobaan yang menggunakan pelarut campuran 50% A dan 50% B dari hasil percobaan dapat melarutkan zat 20 mg/ml.

(34)

tersebut dapat secara teoritis diketahui diprediksi campuran pelarut A dan beberapa bagian pelarut B yang dapat menghasilkan jumlah zat yang terlarut secara optimum. Hasil teoritis ini perlu dicek dengan percobaan (Bolton, 1997).

H. Landasan Teori

Berdasarkan literatur, ekstraksi rutin dari Manihotis Folium menggunakan metode maserasi. Ekstraksi dengan metode maserasi biasanya menggunakan pelarut campuran etanol dan air. Perbandingan antara jumlah etanol dan air yang digunakan tergantung dari pada bahan yang akan diekstraksi.

Keuntungan metode maserasi dibandingkan metode ekstraksi yang lain adalah alatnya sederhana, mudah dilakukan, dan murah. Adanya proses perendaman dan penggojogan akan meningkatkan ekstraksi rutin dari Manihotis Folium karena adanya perbedaan konsentrasi antara di dalam sel dan di luar sel,

sehingga rutin akan terekstrak karena larut dalam pelarut.

Rutin merupakan senyawa golongan flavonoid glikosida yang menjadi kandungan dari Manihotis Folium. Rutin adalah senyawa flavonoid yang larut dalam etanol dan air.

(35)

Suhu menjadi salah satu faktor yang perlu diperhatikan dalam proses maserasi. Berdasarkan Hukum Arrhenius bahwa adanya kenaikan suhu 10oC akan meningkatkan kecepatan reaksi dua kali lebih besar, maka adanya kenaikan suhu dalam proses maserasi akan meningkatkan ekstraksi rutin dari Manihotis Folium.

I. Hipotesis

1. Dari peringkat suhu maserasi yang digunakan yaitu 30oC, 40oC, dan 50oC, diperoleh suhu maserasi yang menghasilkan kadar rutin yang tertinggi, yaitu pada suhu 50oC.

(36)

BAB III

METODELOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk dalam penelitian eksperimental murni karena adanya intervensi atau perlakuan terhadap subjek uji, dengan rancangan penelitian secara Simplex Lattice Design.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas

Komposisi etanol dan air yang dibuat berdasarkan formula dari metode Simplex Lattice Design dan suhu shaker untuk penyarian diatur pada 30, 40, dan 50 oC.

2. Variabel Tergantung

Kadar rutin yang tersari dari Manihotis Folium.

C. Definisi Operasional

a. Maserasi dalam penelitian ini menggunakan perbandingan volume etanol 96% dan akuades dengan maserator yang bisa diatur suhunya, yaitu 30oC, 40oC, dan 50oC.

(37)

c. Ekstrak kental adalah ekstrak dengan kadar air kurang dari 30%. d. Etanol yang dimaksud dalam penelitian ini adalah etanol 96%. e. Air yang dimaksud dalam penelitian ini adalah akuades.

f. Respon dalam penelitian ini adalah kadar rata-rata rutin dari tiga replikasi. g. Komposisi optimum adalah komposisi pelarut etanol dan air yang

menghasilkan rata-rata rutin tertinggi.

h. Penetapan kadar rutin dengan menghitung luas area bawah kurva (AUC) yang dianalisa dengan menggunakan Image J.

D. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: simplisia Manihotis Folium dan lempeng KLT selulosa p.a. Merck. Bahan kimia kualitas teknis berupa

etanol 96%, air, dan ammonia 25%. Bahan kimia kualitas analitik meliputi asam asetat p.a, butanol p.a, standar rutin p.a, methanol p.a, etanol p.a.

E. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa Grinder, Shaker Inkubator Zhicheng ZHWY-100C, TLC set, neraca elektrik (Mettler Toledo GB 3002), vaccum rotary evaporator (Buchi Rotavapor No.105108, Switzerland), Waterbath

(38)

F. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Singkong

Determinasi tanaman singkong dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma berdasarkan Steenis (1992).

2. Pengumpulan daun singkong

Daun singkong muda dipetik dari tanaman singkong yang berumur delapan bulan dan dipisahkan dari batangnya sehingga hanya daunnya saja.

3. Pembuatan Simplisia

Daun singkong yang telah dipisahkan dari batangnya, dikeringkan. Pengeringan tidak langsung di bawah sinar matahari, tetapi cukup diangin-anginkan saja. Setelah cukup kering kemudian dijemur di bawah matahari langsung dengan ditutup menggunakan kain hitam sampai kering. Pengeringan dilanjutkan di dalam oven pada suhu 36oC sampai dapat dihancurkan dengan tangan.

4. Pembuatan serbuk simplisia daun singkong

Daun singkong yang sudah kering diserbuk menggunakan mesin serbuk dengan menggunakan ayakan nomor mesh 50.

5. Pembuatan ekstrak daun singkong

(39)

dan 50oC selama 2 X 24 jam. Maserat ditampung, dan serbuk di maserasi ulang dengan pelarut campuran yang baru. Setelah diperoleh maserat, pelarut diuapkan dengan alat vacuum rotary evaporator sampai volume ekstrak kurang lebih 10 ml. Dilanjutkan dengan proses penguapan sampai seluruh pelarutnya menguap di atas waterbath pada suhu 50oC. Dimasukkan dalam oven pada suhu 50oC untuk mendapatkan berat ekstrak yang konstan, yaitu selisih penimbangan tiap jamnya tidak lebih dari 0,25%. Timbang ekstrak kering yang diperoleh.

Tabel I. Perbandingan pelarut maserasi Volume pelarut (ml)

Pelarut Formula 1 Formula 2 Formula 3 Formula 4 Formula 5

Etanol 96% 50 37.5 25 12.5 0

Air 0 12.5 25 37.5 50

6. Validasi Metode

a. Pembuatan larutan baku rutin

Lima miligram standar rutin ditimbang lebih kurang seksama, dan dilarutkan dengan 5 mililiter metanol p.a, sehingga diperoleh larutan baku rutin dengan kadar 1 mg/ml.

b. Pembuatan seri kurva baku rutin

(40)

pengembangan 10 cm. Bercak yang telah diperoleh dideteksi dengan sinar UV 254 nm dan dimasukkan dalam bejana yang jenuh dengan uap ammonia. Scan plat dan kemudian gambar ktomatogram dikur nilai areanya dengan menggunakan program Image J.

c. Penetapan nilai recovery

Dibuat tiga seri volume penotolan yaitu 1.5 µl; 3,5 µl; dan 5.5µl ditotolkan pada lempeng selulosa yang telah diaktifkan sebelumnya pada oven dengan suhu 60oC selama 30 menit. Penotolan dilakukan secara triplo. Lalu dikembangkan pada chamber yang telah jenuh dengan fase gerak butanol : asam asetat : air (4:1:5) v/v, dengan jarak pengembangan 10 cm. Bercak yang telah diperoleh dideteksi dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan dimasukkan dalam bejana yang jenuh dengan uap ammonia. Ukur nilai area dengan menggunakan program Image J. Hitung kadar terukur menggunakan persamaan kurva baku. Recovery dihitung dari kadar terukur pada kurva baku dibandingkan dengan kadar yang telah diketahui dikalikan dengan 100%. Kemudian dilanjutkan dengan penetapan nilai presisi.

7. Pemeriksaan kualitatif ekstrak Manihotis Folium

(41)

dengan panjang gelombang 254 nm dan dimasukkan dalam bejana yang jenuh dengan uap ammonia. Hitung nilai Rf.

8. Pemeriksaan kualitas ekstrak Manihotis Folium a. Pemeriksaan organoleptis

Pemeriksaan organoleptis meliputi warna, bau, rasa, dan konsistensi ekstrak daun singkong.

b. Preparasi sampel

Ekstrak kental Manihotis Folium dengan lima formula perbandingan pelarut etanol dan air masing-masing ditimbang lebih kurang seksama 0,1 gram, dan dimasukkan dalam flakon dan dilarutkan dengan 1 ml metanol p.a.

c. Penetapan kadar rutin

Sebanyak 0,5 µl untuk ekstrak formula 1, 2, 3, dan 1µl untuk ekstrak formula 4 dan 5 ditotolkan pada lempeng selulosa yang telah diaktifkan sebelumnya pada oven dengan suhu 60oC selama 30 menit. Bercak yang telah diperoleh dideteksi dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan dimasukkan dalam bejana yang jenuh dengan uap ammonia. Scan plat dan kemudian gambar ktomatogram dikur nilai areanya dengan menggunakan program Image J. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali untuk masing-masing suhu maserasi.

d. Cara analisis

(42)

(43)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman bertujuan untuk mendapatkan kepastian akan kebenaran tanaman yang diselidiki sesuai dengan yang dimaksud dalam penelitian. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan ciri-ciri yang terdapat pada tanaman sesuai dengan kunci determinasi yang terdapat pada buku acuan. Determinasi tanaman singkong ini dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma menurut Steenis (1992).

Berdasarkan hasil dari determinasi ketahui bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Manihot utillissima Pohl (Lampiran I).

B. Pengumpulan daun

(44)

digunakan daun singkong yang masih muda untuk mendapatkan kadar rutin yang tinggi.

C. Pembuatan simplisia

Simplisia dibuat dari daun singkong yang diangin-anginkan terlebih dahulu, kemudian dikeringkan di bawah matahari dengan ditutup kain hitam. Tujuan penutupan kain ini juga untuk menghindari kontaminasi dari luar, baik berupa debu dan kerikil. Selain itu supaya panas matahari merata di seluruh permukaan daun singkong dan tidak merusak rutin. Pengeringan dilanjutkan di dalam oven pada suhu 400C–500C sampai daun benar-benar kering dan bisa dihancurkan dengan tangan, dengan asumsi bahwa kadar air yang ada di dalam simplisia kurang dari 10%. Simplisia dengan kadar air lebih dari 10% bisa mengalami reaksi enzimatis yang dapat menguraikan zat aktif, yang akan menyebabkan rusaknya simplisia dan penurunan mutu dari simplisia. Simplisa yang rusak dan pengalami penurunan mutu akan diketahui pada saat penetapan kadar zat aktifnya yang tidak sesuai dengan standar yang sudah ada. Suhu pengeringan simplisia berdasarkan Anonim (1985) berkisar antara 30-90oC, tetapi lebih baik pada suhu kurang dari 60oC, maka dalam penelitian ini suhu pengeringan di dalam oven berkisar antara 40-50oC.

(45)

D. Pembuatan serbuk

Simplisia daun singkong yang sudah kering diserbuk menggunakan mesin penyerbuk. Tujuan penyerbukan ini untuk mendapatkan luas permukaan total yang besar sehingga kontak dengan pelarutnya akan semakin besar sehingga proses ekstraksi akan bertambah baik dan dan kadar rutin yang diperoleh juga akan semakin besar.

Serbuk yang dihasilkan adalah serbuk halus yang berwarna hijau. Serbuk yang halus mempunyai keuntungan bisa meningkatkan kadar rutin yang terekstraksi karena luasnya area kontak pelarut dengan serbuk, tetapi dalam penyimpanan serbuk ini mudah menyerap lembab, maka selama penyimpanan ditambahkan silika gel untuk menyerap lembab.

Gambar 3. Serbuk daun singkong

E. Pembuatan ekstrak

(46)

pelarut ini bertujuan untuk mendapatkan perbandingan pelarut yang menghasilkan kadar rutin paling besar. Kemudian di maserasi pada shaker inkubator pada suhu 30oC, 40oC, dan 50oC. Perbedaaan suhu ini untuk mengetahui perbedaan kadar rutin pada masing-masing suhu tersebut. Berdasarkan hukum Arrhenius, setiap peningkatan suhu 10oC akan meningkatkan kecepatan reaksi dua kali lebih besar (Petruci dan Suminar, 1985). Rentang suhu pada proses maserasi yang digunakan berada di bawah 60oC karena rutin rusak pada suhu di atas 60oC.

(47)

akan merusak ekstrak yang akan ditetapkan kadar rutinnya. Penetapan bobot konstan ini merupakan salah satu tahap standarisasi ekstrak, yaitu susut pengeringan karena menghilangkan kandungan air yang ada di dalam ekstrak dan bisa menetapkan kadar airnya.

Gambar 4. Ekstrak Manihotis Folium Keterangan gambar:

T1 = pelarut 100% etanol 96%

T2 = pelarut 75% etanol 96% dan 25% air T3 = pelarut 50% etanol 96% dan 50% air T4 = pelarut 25% etanol 96% dan 75% air T5 = pelarut 100% air

F. Validasi metode a. Pembuatan kurva baku rutin

(48)

Tabel II. Pembuatan Kurva baku

Kurva baku 1 Kurva baku 2 Kurva baku 3

Volume

totolan (µl) AUC

Volume

totolan (µl) AUC

Volume

totolan (µl) AUC 1.5

27102.05 1.5 15562.6 1.5 26001.2

2.5

41606.51 2.5 24546.3 2.5 37012.1

3.5

49238.86 3.5 33224.7 3.5 38070.7

4.5

43686.28 4.5 36493.8 4.5 39413.8

5.5

43330.11 5.5 35951 5.5 38491.5

A = 28905.2005 B = 3320.7587

Persamaan kurva baku: y = 28905.2005x +

3320.7587

A = 10702.1750 B = 5069.6442

10702.1750

A = 26214.055 B = 26329.9135

26214.055

r = 0.6597 r = 0.9283 r = 0.7809

(49)

Gambar 5. Kurva baku 1

(50)

Gambar 7. Kurva baku 3

Berdasarkan gambar 5, 6, dan 7 diketahui bahwa semakin besar volume totolan maka area yang diperoleh juga semakin besar.

b. Penetapan nilai recovery

Perolehan kembali kadar merupakan parameter yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya, akurasi dari suatu metode.

Tabel III. Nilai recovery Variabel Massa

sebenarnya (µg) Massa terukur (µg) Recovery (%) Rata-rata recovery (%) Volume totolan 1.5µl

1.56 3.2349 207.3654 154.0897

1.56 0.9587 61.4551

1.56 3.0178 193.4487 Volume

totolan 3.5µl

3.64 6.1232 168.2199 146.1932 3.64 4.4426 122.0495

3.64 5.3985 148.3104 Volume

totolan 5.5µl

5.72 6.4361 112.5192 98.4732

5.72 4.9804 87.0699

(51)

Nilai recovery yang baik pada kurva baku adalah 98-102% (Mulja dan Hanwar, 2003), maka berdasarkan nilai tersebut hanya larutan uji konsentrasi 3 (5.5 µl) yang memenuhi persyaratan akurasi.

Presisi merupakan parameter yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individu dan rata-rata dari campuran yang homogen. Diukur dengan nilai coefisien of variancy (CV) dengan nilai CV yang baik adalah < 2 % (Mulja dan Hanwar, 2003).

Tabel IV. Nilai presisi Variabel

Rata-rata massa terukur (µg)

SD SE KV

(%) Volume totolan

1.5µl

2.4038 1.2562 0.7253 30.1717 Volume totolan

3.5µl

5.3214 0.8429 0.4866 9.1451

Volume totolan 5.5µl

5.6327 0.7395 0.4269 7.5799

Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada volume totolan yang memenuhi persyaratan presisi kurang dari 2%. Berdasarkan analisis tersebut, bisa dikatakan bahwa metode ini tidak menghasilkan presisi yang memenuhi syarat.

G. Analisis kualitatif ekstrak Manihotis Folium

Analisis kualitatif yang dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Analisis kualitatif ini untuk memastikan bahwa ekstrak yang dihasilkan benar mengandung rutin.

(52)

gel berdasarkan dari hasil orientasi. Berdasarkan hasil orientasi, pemisahan senyawa rutin menggunakan silika gel menghasilkan bercak yang tidak memisah dan mengekor.

Fase gerak yang digunakan diperoleh dari hasil orientasi dengan mendapatkan bercak yang terpisah baik dari ekstrak yang ditotolan dan tidak mengekor. Fase gerak yang digunakan adalah butanol:asam asetat:air (4:1:5) v/v. Butanol dan asam asetat yang bersifat non polar akan menurunkan kepolaran dari air sehingga perambatan dari fase gerak menjadi lambat dan bisa memisahkan rutin dari zat-zat lain yang terdapat dalam ekstrak Manihotis Folium. Jika hanya menggunakan air maka perambatan dari fase gerak akan sangat cepat dan tidak memisahkan rutin dari senyawa lain yang terdapat dalam ekstrak Manihotis Folium.

(53)

Gambar 8. Kromatogram baku rutin dan sampel ekstrak rutin di deteksi dengan uap amonia

Keterangan:

Konsentrasi baku rutin : 1,04 µg/µl Fase diam: selulosa

Fase gerak : n-butanol : asam asetat : air (4:1:5) % v/v Deteksi : uap amonia

Volume totolan:

a. Baku 1 (1.5 µl), massa rutin (1.56 µg) b. Baku 2 (2.5 µl), massa rutin (2.60 µg) c. Baku 3 (3.5 µl), massa rutin (3.64 µg) d. Baku 4 (4.5 µl), massa rutin (4.68 µg) e. Baku 5 (5.5 µl), massa rutin (5.72 µg)

(54)

Tabel V. Harga Rf dan warna bercak baku rutin dan rutin dalam sampel ekstrak di deteksi dengan uap amonia.

Baku Sampel

Bercak a B c D e f g h i j

Rf 0.60 0.59 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.61 0.61 0.61

Warna bercak kuni ng Kun ing kuni ng Kun ing Kun ing kuni ng kuni ng kuni ng kuni ng Kuni ng

Berdasarkan hasil yang diperoleh dari KLT (gambar 11 dan tabel V), diketahui bahwa sampel ekstrak mengandung rutin. Hal ini ditunjukkan dari kelima bercak sampel ekstrak yang mempunyai harga Rf mirip dengan Rf baku rutin yaitu 0.60 dan intensitas warna bercak yang menyerupai bercak baku.

H. Pemeriksaan kualitas ekstrak daun singkong a. Pemeriksaan organoleptis

Tujuan dari pemeriksaan organoleptis adalah untuk membantu identifikasi ekstrak dengan menggunakan pancaindera. Menurut Arifin, Anggraini, Handayani, Rasyid (2006), pemeriksaan organoleptis bertujuan untuk pengenalan awal secara sederhana dan subyektif. Hasil dari pemeriksaan organoleptis berupa bau yang ciri khas singkong, warna hitam, rasa agak pahit, dan konsistensi ekstrak yang liat.

b. Penetapan kadar rutin dalam ekstrak Manihotis Folium

Sampel yang akan ditetapkan kadar rutinnya dilarutkan menggunakan metanol p.a karena dari hasil percobaan kelarutan rutin lebih baik dalam metanol p.a

(55)

metanol p.a banyak rutin yang terlarut. Volume totolan untuk setiap formulanya berbeda karena pengaruh dari kekentalan ekstraknya berbeda dari tiap formula, campuran pelarut yang banyak mengandung etanol 96% memiliki sifat ekstrak yang semakin pekat sehingga saat dielusi tidak bisa terpisah sempurna. Lempeng yang digunakan adalah lempeng selulosa p.a yang bersifat nonpolar dengan fase gerak yang bersifat cenderung polar, sehingga bisa memisahkan rutin dari ekstrak karena rutin akan terelusi oleh fase gerak. Setelah mencapai batas pengembangan yaitu 10 cm dari titik penotolan lempeng dimasukkan dalam bejana yang telah jenuh dengan uap ammonia 25% untuk mendapatkan bercak rutin yang berwarna kekuning-kuningan. Penetapan nilai area diperoleh dari analisis menggunakan program Image J menggunakan gambar dari lempeng yang telah discan. Nilai area tersebut digunakan untuk mengetahui kadar rutin yang terdapat pada sampel ekstrak Manihotis Folium menggunakan persamaan kurva baku.

Tabel VI. Kadar rutin (µg/µl) dari tiap replikasi dari tiga peringkat suhu proses maserasi

Suhu 30oC Suhu 40oC Suhu 50oC

Sampel Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3 1 8.2777 8.5953 1.0261 7.8025 4.1364 1.2038 -0.3822 5.3142 -0.5367 2 3.2311 4.0761 1.3604 2.019 -0.0266 -2.1951 0.8525 7.0142 0.0401 3 2.4965 4.708 1.5168 5.1832 4.0329 -0.1369 0.7426 2.1789 -0.5367 4 2.545 2.6023 -0.2667 -5.0864 -4.2777 -1.6804 -1.5843 11.5653 -1.4151 5 -2.5538 1.9954 -0.4061 -7.67 -4.2926 -4.2594 -5.0700 -0.3170 -2.6271

Keterangan:

Sampel 1 = etanol 100%

(56)

Berdasarkan tabel VI, diketahui bahwa adanya kenaikan suhu maserasi tidak meningkatkan kadar rutin yang terekstraksi dari Manihotis Folium. Hukum Arrhenius menyatakan bahwa adanya kenaikan suhu 10oC akan meningkatkan kecepatan reaksi dua kali lebih besar, tetapi kelarutan rutin tertinggi pada suhu 30oC, ditunjukkan dengan kadar yang lebih tinggi di setiap replikasinya. Maka perlu dilakukan uji untuk mengetahui perbedaan kadar dari setiap suhu maserasi.

Tabel VII. Hasil analisis menggunakan Anova Sources of

Error

SS dF MS Fhitung Ftabel

Between _24.4018 2 12.2009

1.4037 3.68

Within _104.3043 12 8.69203

Total 128.7061

Berdasarkan tabel VII, diketahui bahwa kadar rutin dari setiap suhu maserasi, yaitu suhu 30oC, 40oC, 50oC berbeda tidak bermakna. Perbedaaan kadar rutin yang diperoleh pada masing-masing suhu maserasi tidak menunjukkan bahwa kadar rutin yang dihasilkan pada setiap suhunya berbeda.

(57)

terlarut dalam metanol sangat kecil, sehingga nilai area saat dianalisis dengan Image J sangat kecil dan kadarnya menjadi minus.

c. Analisis Kadar berdasarkan Simplex Lattice Design

Simplex Lattice Design adalah suatu metode aplikasi untuk mengetahui

komposisi terbaik dari suatu pelarut campuran untuk mendapatkan kadar rutin tertinggi. Berdasarkan metode Simplex Lattice Design diperoleh lima formula larutan penyari rutin yang akan diekstraksi pada tiga peringkat suhu yang digunakan untuk mengetahui kadar rutin dihasilkan dari masing-masing peringkat suhu, lalu dibandingkan bagaimana kadar rutin di setiap suhunya, suhu mana yang menghasilkan kadar rutin tertinggi. Suhu yang digunakan adalah 30oC, 40oC, dan 50oC. Dalam metode ini ada lima perbandingan campuran pelarut yang akan menghasilkan ekstrak dan akan diukur kadar rutinnya. Berdasarkan metode ini diharapkan mendapatkan perbandingan volume pelarut etanol 96% dan air yang paling optimum untuk mengekstraksi rutin dari Manihotis Folium dengan cara maserasi. Dari data yang diperoleh. maka dihasilkan persamaan SLD sebagai berikut:

Persamaan umum :

Y = a (X1) + b (X2) + ab (X1)(X2) Persamaan SLD suhu 30oC:

Y = 5.9664 (X1) - 0.3215 (X2) + 0.3386 (X1)(X2) Persamaan SLD suhu 40oC

Y = 3.5784 (X1) – 5.4073 (X2) + 15.7634 (X1)(X2) Persamaan SLD suhu 50oC

(58)

Berdasarkan hasil analisis, persamaan yang valid adalah persamaan suhu 30oC, sedangkan untuk suhu 40oC dan 50oC tidak valid.

Gambar 9. Kurva validitas persamaan SLD suhu 30oC

(59)

Gambar 11. Kurva validitas persamaan SLD suhu 50oC

Berdasarkan gambar 9, 10, dan 11 diketahui bahwa validitas persamaan ditunjukkan dengan kedekatan hasil percobaan dengan persamaan SLD. Suhu maserasi 30oC menunjukkan kadar rutin dari hasil percobaan yang terletak di daerah persamaan SLD. Menurut Bahrudin et al., (1990), rendemen rutin dari Manihotis Folium yang diperoleh dari proses maserasi adalah 0.71% (b/b), dari gambar 9 diketahui bahwa rendemen rutin tertinggi diperoleh dari suhu 30% pada formula 1 dengan nilai rendemen 0.7311% (b/b).

(60)

Gambar 12. Grafik kadar rutin dan rata-rata kadar rutin pada tiap replikasinya

(61)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Diantara kadar rutin yang dihasilkan pada peringkat suhu maserasi, suhu 300C menghasilkan kadar rutin yang paling tinggi dibandingkan 400C dan 500C. 2. Komposisi pelarut 100% etanol 96% menghasilkan kadar rutin tertinggi dari

ekstrak Manihotis Folium dengan proses maserasi.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang cara ekstraksi rutin yang lain dari Manihotis Folium untuk mendapatkan cara ekstraksi yang lebih tepat untuk ekstraksi rutin dan mendapatkan kadar rutin yang lebih tinggi.

(62)

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, edisi III, 9, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 1986, Sediaan Galenika, 5-20, Departemen Kesehatan RI, Jakarta

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 7 Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 2000, Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan 1, 1-12, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Indonesia

Anonim, 2004, Guidelines For The Validation of Analytical Methods For Active Constituent, Agricultural And Veterinary Chemical Products, http://www.apvma.gov.au, diakses tanggal 22 Maret 2010

Anonim, 2007, Supplement: Bioflavonoid, Wellfx,com, Inc

Anonim, 2008, Manfaat Singkong, http://cafepojok,org/forum/showthread,php, diakses tanggal 12 April 2009

Ansel, H., C,, 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, Edisi 4, 615, UI Press, Jakarta

Ansel, H., C,, 1990, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 407-408, Lea and Febiger Press, London

Arifin, H., Anggaraini, D., Handayani,. D., Rasyid, R., 2006, Standarisasi Ekstrak Etanol Daun Eugena cumini Merr., Jurnal Sains dan Teknologi Fakultas Farmasi, Universitas Andalas, Sumatra Barat

Bahruddin, S.M., Moedarsono, 1990, Pemeriksaan Kadar Rutin pada Daun Singkong (Manihot utilissima Pohl,) Muda, Tua, dan Kuning, Skripsi, ITB, Bandung

Bolton, S., 1997, Pharmaceutical Statistics: Practical and Clinical Application, 3rd, 611-614, Marcell Decker Inc, New York

(63)

Gritter, R,J., Bobit, J,M., Schwarting, A,E,, 1991, Introduction to Chromatography, Cetakan II, 107-155, Penerbit ITB, Bandung

Hardjono, 1983, Kromatografi, 32-54, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta Leru, B, and Calatayud, P,A., 1994, Interactions Between Cassava And Arthropod

Pests, African Crop Science Journal, Vol, 2, No,4, pp, 385-390, Uganda Mulja, H.M., Suharman, 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium Yang Baik,

Majalah Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya

Petruci, RH., dan Suminar, 1985, Kimia Dasar:Prinsip dan Terapan Modern, 166, Erlangga, Jakarta

Stahl, 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : a practical supplement to pharmacopeias, 205-207, ITB, Bandung

Steenis, C,G,G,J., 1992, Flora untuk Sekolah di Indonesia, 45, 47, 73, 258, 264, PT, Pradnya Paramita, Jakarta Pusat

Voigt, R., 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, 564, 565, 577, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta

Wijayakusuma, H., 2008, Efek Farmakologi Singkong,

http://anekaplanta,wordpress,org/2008/01/01/ubi-kayu-manihot-esculenta/, diakses tanggal 2 Februari 2010

Zeligs, Michael A., and H. Leon Bradlow, 2006, Diindolymethane (DIM), formed spontaneously from Indole-3-carbinol (I3C), is the dominant

antiproliferative indol in cell culture media after adding I3C,

(64)

(65)

(66)

II. Penetapan Bobot Konstan Ekstrak Manihotis Folium

a. suhu 30 oC

Replikasi 1

Bobot Formula 1 Formula 2 Formula 3 Formula 4 Formula 5 Kosong 16.3148 16.4829 20.0474 18.3996 25.4772

Awal 19.7049 27.3087 29.5333 29.3072 33.0781 1 Jam 17.8415 26.1942 28.0792 28.0562 32.3950 2 Jam 17.3485 24.7467 27.2335 26.9382 31.5548 3 Jam 17.1936 23.3297 26.3840 26.0704 30.7598 4 Jam 17.1464 21.8081 25.2642 24.6895 30.0970 5 Jam 17.1164 20.9943 24.5499 23.8255 29.2781 6 Jam 17.1015 19.7193 23.7500 22.4299 28.5325 7 Jam 17.0776 18.1874 22.8369 21.6030 27.7307

8 Jam 17.5682 22.0963 20.8969 26.7561

9 Jam 17.2474 21.1602 19.8960 26.2078

10 Jam 17.2025 20.9501 19.4817 26.1480

11 Jam 17.1883 20.9083 19.4166

12 Jam 19.3908

Replikasi 2

Bobot Formula 1

Formula

2 Formula 3 Formula 4 Formula 5 Kosong 17.9372 17.8586 19.5584 18.8865 24.8335 Awal 32.5896 20.0060 30.0739 25.7251 33.3449 1 Jam 31.6857 18.7958 28.6271 25.7040 32.5232

2 Jam 30.7068 18.4331 27.1774 31.6678

3 Jam 29.5705 18.3975 25.8683 30.9066

4 Jam 28.7628 25.1127 30.2690

5 Jam 27.6138 24.0028 29.4910

(67)

7 Jam 25.3881 21.7659 26.8644

8 Jam 23.9577 21.0963 26.0407

9 Jam 22.9929 20.5849 25.6571

10 Jam 22.0815 20.4478 25.3990

11 Jam 21.2395 20.4108 25.3513

12 Jam 20.4747

13 Jam 19.1002

14 Jam 18.9226

15 Jam 18.8692

16 Jam 18.8518

Replikasi 3

Bobot Formula 1

Formula

2 Formula 3 Formula 4 Formula 5 Kosong 17.9451 22.1989 16.9063 17.4876 17.9552

Awal 19.5729 33.5248 27.6494 25.9024 27.3613 1 Jam 19.0596 33.1225 27.2556 25.5147 26.6427 2 Jam 18.6697 32.6734 26.8491 25.0987 25.7600 3 Jam 18.5850 32.0731 26.4249 24.4810 24.9380 4 Jam 18.5543 31.2294 26.0178 24.2113 24.0158

5 Jam 30.7365 25.4559 23.7637 23.1284

6 Jam 30.2417 25.0531 23.3857 22.3491

7 Jam 29.7867 24.6707 23.0581 21.5674

8 Jam 28.9351 23.8603 22.1432 20.7177

9 Jam 28.0084 22.5043 21.0984 19.8984

10 Jam 27.0037 21.3485 20.1956 19.3469

11 Jam 26.0460 20.5463 19.5465 18.8161

12 Jam 25.1887 19.8119 18.9156 18.6087

13 Jam 24.3221 18.8965 18.4530 18.5827

14 Jam 23.4810 17.7961 18.2981

(68)

16 Jam 22.6978 17.5152 18.2433

17 Jam 22.6772

Nilai rendemen S

A M P E L

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Lama pengeringan

(jam)

Rendemen (%)

Lama pengeringan

(jam)

Rendemen (%)

Lama pengeringan

(jam)

Rendemen (%)

1 7 13.3334 16 42.1539 4 5.2041

2 11 37.0592 3 8.0401 17 32.3569

3 11 29.2043 11 4.8994 16 36.6525

4 12 33.8360 1 0.0820 16 29.5691

(69)

b. suhu 40 oC

Replikasi 1

Awal 18.5556 25.2573 23.4776 26.2127 29.418

1 Jam 18.5252 23.9341 22.3955 25.0491 28.5793

2 Jam 23.0936 21.5099 23.9175 27.9884

3 Jam 21.9673 20.8765 23.0788 26.733

4 Jam 21.3106 20.1084 21.7187 26.0625

5 Jam 19.9954 19.4521 20.869 25.4907

6 Jam 19.3897 19.28 20.3045 25.2795

7 Jam 18.8856 19.2273 19.2953 25.2354

8 Jam 18.76 19.2032 18.8459

9 Jam 18.7365 18.7801

10 Jam 18.7563

Replikasi 2

Bobot Formula 1 Formula 2 Formula 3 Formula 4 Formula 5

Kosong 18.228 24.3792 16.314 16.7569 17.9929

Awal 19.6296 29.9946 20.0518 20.6941 24.0813

1 Jam 19.3333 29.5516 19.5619 20.3472 23.6906 2 Jam 19.0754 29.1609 19.2008 20.0352 23.3865 3 Jam 18.9855 28.7238 18.7731 19.7443 233.0891 4 Jam 18.9398 28.2664 18.3763 19.4412 22.7199

5 Jam 27.9912 18.0265 19.1379 22.3317

6 Jam 27.4916 17.7568 18.8078 21.8475

7 Jam 26.987 17.4415 18.4481 21.3682

8 Jam 26.7163 17.2525 18.2535 20.9751

9 Jam 26.2523 17.1777 17.98 20.621

(70)

11 Jam 25.3092 17.644 19.6859

12 Jam 25.0867 17.6122 19.308

13 Jam 25.0585 19.0232

14 Jam 18.9262

15 Jam 18.8836

Replikasi 3

Awal 20.535 18.4952 21.715 20.3792 18.3836

1 Jam 20.4438 17.764 20.9976 19.3323 17.8865

2 Jam 20.4179 17.5668 20.3327 18.5311 17.7558

3 Jam 17.5236 20.1024 17.7853 17.6813

4 Jam 20.0475 17.6318 17.6435

5 Jam 20.0252 17.5837

6 Jam 17.5514

Nilai rendemen S A M P E L

Lama pengeringan (jam) Rendemen (%) Lama pengeringan (jam) Rendemen (%) Lama pengeringan (jam) Rendemen (%)

1 1 0.1638 4 3.5140 2 0.5702

2 9 25.8175 13 16.4566 3 5.2532

3 8 18.2063 10 14.4605 5 7.7817

4 10 28.4458 12 14.8927 6 13.8759

(71)

c. suhu 50 oC

Replikasi 1

Awal 20.9714 21.4896 22.3806 23.7959 21.0933

1 Jam 20.8919 20.6449 21.6701 22.7936 20.6277

2 Jam 20.8583 19.9016 20.3694 21.0757 20.486

3 Jam 19.2208 19.6947 22.4259 20.4284

4 Jam 19.1883 19.0289 22.0504 20.4085

5 Jam 19.1771 18.608 21.6571

6 Jam 19.1701 18.2826 21.2305

7 Jam 17.9874 20.8934

8 Jam 19.952 20.8665

9 Jam 20.857

Replikasi 2

Awal 20.4261 20.8843 20.4293 21.1109 19.6385

1 Jam 20.3306 20.8462 19.7858 21.0818 19.5845

2 Jam 20.3093 19.1305 21.0757 19.5653

3 Jam 18.8122

4 Jam 18.6041

5 Jam 18.5273

6 Jam 18.5022

Replikasi 3

Awal 20.1953 20.7964 20.1662 18.6604 21.2472

1 Jam 20.1858 20.7793 20.1174 18.5937 20.7133

(72)

3 Jam 20.3629

4 Jam 20.331

Nilai rendemen S

A M P E L

Lama pengeringan

(jam)

Rendemen (%)

Lama pengeringan

(jam)

Rendemen (%)

Lama pengeringan

(jam)

Rendemen (%)

1 2 0.5393 2 0.5718 1 0.0470

2 6 10.7936 1 0.1824 1 0.0822

3 8 10.8514 6 9.4330 1 0.2420

4 9 12.3504 2 0.1667 2 0.4754

(73)

III.Penimbangan Ekstrak Manihotis Folium a. suhu 30 oC

Replikasi 1

Berat formula 1 formula 2 formula 3 formula 4 formula 5 Cawan kosong 14.3954 13.5890 13.6303 14.2795 14.3957

cawan+zat 14.4959 13.6918 13.7375 14.3835 14.5065 cawan+sisa 14.3957 13.6015 13.6422 14.2832 14.3970

Zat 0.1002 0.0903 0.0953 0.1003 0.1093

Replikasi 2

Berat formula 1 formula 2 formula 3 formula 4 formula 5 cawan kosong 13.5892 13.6301 13.5893 14.2795 14.3393

Zat 0.0980 0.0533 0.1030 0.0922 0.0982

Replikasi 3

Zat 0.0948 0.0900 0.1056 0.0992 0.1012

b. suhu 40 oC

Replikasi 1

Zat 0.1119 0.1003 0.1154 0.1000 0.1025

Replikasi 2

(74)

cawan kosong 14.2794 13.6300 14.2797 13.6305 13.5894 cawan+zat 14.3907 13.7415 14.3866 13.7605 13.7454 cawan+sisa 14.2812 13.6352 14.2870 13.6581 13.3401

Zat 0.1095 0.1063 0.0996 0.1024 0.1053

Replikasi 3

Cawan+zat 13.7327 14.4077 13.7624 13.6954 14.6236 cawan+sisa 13.6314 14.2995 13.3622 13.5900 14.5110

Zat 0.1012 0.1082 0.1102 0.1054 0.1126

c. suhu 50 oC

replikasi 1

Zat 0.0980 0.1001 0.0981 0.0969 0.0998

Replikasi 2

Zat 0.1006 0.0997 0.0975 0.0992 0.1027

Replikasi 3

(75)

IV. Penimbangan kurva baku Penimbangan baku

Berat kertas kosong = 0.3640 gram Berat kertas + zat = 0.3698 gram Berat kertas + sisa = 0.3646 gram Berat zat = 0.0052 gram Konsentrasi baku = 0.0052 gram / 5 ml

(76)

V. Validasi Metode a. Uji linearitas

• Kurva Baku 1

Baku Jumlah totolan (µl) Jumlah rutin (µg) Area

1 1.5 1.56 27102.05

2 2.5 2.6 41606.51

3 3.5 3.64 49238.86

4 4.5 4.68 43686.28

5 5.5 5.72 43330.11

r = 0.6597; a= 28905.2005; b = 3320.5787 Y = 3320x + 28905.2005

• Kurva Baku 2

Baku Jumlah totolan (µl) Massa totolan (µg) Area

1 1.5 1.56 15562.6

2 2.5 2.6 24546.3

3 3.5 3.64 33224.7

4 4.5 4.68 36493.8

5 5.5 5.72 35951

r = 0.9283. a= 10702.1750. b = 5069.6442 Y = 5069.6442x + 10702.1750

• Kurva Baku 3

Baku Jumlah totolan (µl) Massa totolan (µg) Area

1 1.5 1.56 26001.2

2 2.5 2.6 37012.1

3 3.5 3.64 38070.7

4 4.5 4.68 39413.8

5 5.5 5.72 38491.5

(77)

b. Recovery Variabel Massa

sebenarnya (µg) Massa terukur (µg) Recovery (%) Rata-rata recovery (%) Volume totolan 1.5µl

1.56 3.2349 207.3654 154.0897

1.56 0.9587 61.4551

1.56 3.0178 193.4487 Volume

totolan 3.5µl

3.64 6.1232 168.2199 146.1932 3.64 4.4426 122.0495

3.64 5.3985 148.3104 Volume

totolan 5.5µl

5.72 6.4361 112.5192 98.4732

5.72 4.9804 87.0699

5.72 5.4815 95.8304

c. Presisi

Variabel

Rata-rata massa terukur (µg)

SD SE KV

(%) Volume totolan

1.5µl

2.4038 1.2562 0.7253 30.1717

5.3214 0.8429 0.4866 9.1451

5.6327 0.7395 0.4269 7.5799

SE = SD / √n

(78)

VI. Penetapan kadar rutin dengan Image J a. Suhu 30oC

• Replikasi 1

Kurva baku standar rutin Keterangan Volume totolan

(µl)

Jumlah totolan (µg) AUC

Baku 1 1.5 1.56 26977.87

Baku 2 2.5 2.6 36072.6

Baku 3 3.5 3.64 37027.21

Baku 4 4.5 4.68 38436.96

Baku 5 5.5 5.72 41491.15

r = 0.9117 a = 25014.336 b = 3018.3677

Persamaan kurva baku

y = 3018.3677x +25014.336

Penetapan kadar sampel ekstrak Manihotis Folium Formula Volume

totolan (µl)

Massa

totolan (µg) AUC Kadar rutin (µg)

Kadar rutin (µg/ µl)

1 0.5 50.1 74984.26 16.5553 8.2777

2 0.5 45.15 44519.17 6.4621 3.2311

3 0.5 47.65 40085.00 4.9930 2.4965

4 1 100.3 32696.12 2.5450 2.5450

(79)

• Replikasi 2

Kurva baku standar rutin Keterangan Volume totolan

(µl)

Jumlah totolan (µg)

AUC

Baku 1 1.5 1.56 16427.48

Baku 2 2.5 2.6 25669.09

Baku 3 3.5 3.64 28101.64

Baku 4 4.5 4.68 29147.46

Baku 5 5.5 5.72 31808.5

r = 0.9166 a = 14246.6905 b = 3292.3471

Persamaan kurva baku y= 3292.3471x +14246.6905

Penetapan kadar sampel ekstrak Manihotis Folium Formula Volume

totolan (µl)

Massa

totolan (µg) AUC Kadar rutin (µg)

Kadar rutin (µg/ µl)

1 0.5 49 70843.73 17.1905 8.5953

2 0.5 26.65 41086.14 8.1521 4.0761

3 0.5 51.5 4524