2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Deskripsi dan Klasifikasi Ikan Bandeng
Ikan bandeng merupakan salah satu ikan laut yang memiliki potensi untuk dibudidayakan di tambak. Jenis ikan ini mampu mentolerir salinitas perairan yang luas (0-158 ppt) sehingga digolongkan sebagai ikan euryhaline. Ikan bandeng mampu beradaptasi terhadap perubahan lingkungan, seperti suhu, pH, dan kekeruhan air serta tahan terhadap serangan penyakit (Ghufron dan Kardi 1997).
Ikan ini memiliki karakteristik badan langsing, sisik seperti kaca, serta daging berwarna putih. Ikan bandeng mendapat julukan ikan milkfish karena mempunyai daging berwarna putih, seperti susu dan rasanya pulen. Ikan ini memiliki keunikan mulutnya tidak bergigi dan makanannya tumbuh-tumbuhan di dasar laut. Selain itu, panjang usus ikan bandeng sembilan kali dari panjang tubuhnya (Murtidjo 1989). Klasifikasi ikan bandeng menurut Saanin (1984) adalah sebagai berikut :
Phylum : Chordata Sub phylum : Vertebrata Kelas : Pisces Sub kelas :Teleostei Ordo : Malacopterigii Famili : Chanidae Genus :Chanos
Spesies :Chanos chanos
Ikan bandeng mempunyai ciri-ciri morfologi dengan bentuk tubuh ramping, badannya tertutup oleh sisik, jari-jari semuanya lunak dan jumlah sirip punggung antara 14-16, pada sirip dubur antara 10-11, pada sirip dada antara 16-17 dan pada sirip perut antara 11-12. Sirip ekor panjang dan bercagak. Mata diselimuti lendir dan tidak ada skut pada bagian perut (Djuhanda 1981). Morfologi ikan bandeng dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Ikan bandeng (Chanos chanos) (Anonim 2010).
Jumlah sisik pada gurat sisi ada 75-80 keping. Mulutnya berukuran sedang dan nono protractile, yaitu posisi mulut satu garis dengan sisi bawah bola mata, bentuk tubuhnya, seperti panah (Djuhanda 1981).
2.2 Kemunduran Mutu Ikan Bandeng
Setelah ikan mati, ikan segera mengalami proses kemunduran mutu. Kemunduran mutu pada ikan bisa disebabkan karena proses yang terjadi pada tubuh ikan atau karena lingkungan. Proses kemunduran mutu ikan terjadi karena aktivitas enzim, mikroorganisme, dan kimiawi (Ilyas 1993). Ketiga hal tersebut menyebabkan tingkat kesegaran ikan menurun. Proses perubahan ikan setelah mati terdiri dari empat tahap, yaitu prerigor, rigor mortis, post rigor, dan busuk. 2.2.1 Fase prerigor
Fase prerigormerupakan tahap pertama dari postmortem. Tahap ini ditandai dengan peristiwa terlepasnya lendir dari kelenjar di bawah permukaan kulit. Lendir yang dikeluarkan ini sebagian besar terdiri dari glukoprotein dan musin yang merupakan media yang cocok bagi pertumbuhan bakteri (Junianto 2003).
Peristiwa ini terjadi ketika jaringan otot yang mulai lembut dan lentur yang disebabkan karena proses biokimia, yaitu penurunan tingkat ATP dan keratin fosfat serta adanya proses glikolisis aktif. Glikolisis merupakan suatu proses konversi glikogen menjadi asam laktat yang menyebabkan pH turun. Tingkat perubahan pH bervariasi antara satu spesies dengan spesies yang lain seperti juga diantara otot yang berbeda. Namun, hewan dalam keadaan kenyang dan istirahat mempunyai cadangan glikogen yang besar, sehingga dalam keadaan post mortem daging yang dihasilkan memiliki pH lebih rendah dibandingkan dengan daging hewan yang dihasilkan dalam keadaan lapar atau stres pada saat disembelih (Eskin 1990).
2.2.2 Fase rigormortis
Fase rigormortis merupakan akibat dari suatu rangkaian perubahan kimia yang kompleks di dalam otot ikan sesudah kematiannya. Setelah ikan mati, sirkulasi darah terhenti dan suplai oksigen berkurang sehingga terjadi perubahan glikogen menjadi asam laktat. Perubahan ini menyebabkan pH tubuh ikan menurun, diikuti dengan penurunan jumlah ATP dan ketidakmampuan mempertahankan kekenyalan oleh jaringan otot. Tinggi rendahnya pH awal ikan sangat tergantung pada jumlah glikogen yang ada dan kekuatan penyangga pada daging ikan. Pada fase ini, pH tubuh ikan menjadi 6,2-6,6 dari pH semula 6,9-7,2 (Junianto 2003). Hal ini menstimulasi enzim-enzim yang menghidrolisis fosfat organik. Fosfat yang pertama kali terurai adalah fosfat keratin dengan membentuk keratin dan asam fosfat, kemudian diikuti oleh terurainya adenosin trifosfat (ATP) membentuk adenosin difosfat (ADP) dan asam fosfat (Irianto dan Giyatmi 2009). Pada fase ini belum terjadi aktivitas bakteri yang berarti, pH ikan masih turun dikarenakan penumpukan asam laktat sehingga bakteri belum bisa tumbuh dengan baik (Adawyah 2007).
Fase rigormortis ini biasanya berlangsung sekitar 5 jam. Selama berada dalam tahap rigormortis ini, ikan masih dalam keadaan sangat segar. Ini berarti bahwa apabila rigormortis dapat dipertahankan lebih lama maka proses pembusukan dapat ditekan (Irianto dan Giyatmi 2009).
2.2.3 Fase postrigor
Fase postrigor ditandai dengan melunaknya daging. Proses ini diawali terjadinya proses autolisis. Proses autolisis tidak dapat dihentikan walaupun pada suhu yang rendah. Nilai pH yang semakin turun menyebabkan enzim-enzim dalam jaringan otot menjadi aktif. Katepsin, yaitu enzim proteolitik yang berfungsi menguraikan protein menjadi senyawa sederhana, merombak struktur jaringan protein otot menjadi lebih longgar sehingga rentan terhadap serangan bakteri. Demikian pula enzim lain yang ada dalam organ tubuh ikan, misalnya perut, melakukan aktivitas yang sama. Hal ini mengakibatkan daging ikan menjadi agak lunak. Fase perombakan jaringan oleh enzim dalam tubuh ikan ini disebut dengan autolisis. Ikan dalam fase autolisis ini sering masih dianggap
cukup segar dan layak dimakan. Meskipun demikian, fase ini merupakan fase transisi antara segar dan busuk (Irianto dan Giyatmi 2009).
Penguraian protein menghasilkan senyawa amonia yang terjadi pada fase ini. Hal ini akan berpengaruh terhadap kondisi pH yang semakin naik dengan semakin banyaknya senyawa volatil yang dihasilkan. Biasanya proses autolisis akan selalu diikuti dengan meningkatnya jumlah bakteri (Junianto 2003).
2.2.4 Fase busuk
Fase busuk merupakan fase akhir dari kemunduran mutu pada ikan dan ikan sudah tidak dapat dikonsumsi. Mikroorganisme dominan yang berperan penting di dalam proses penurunan kesegaran ikan adalah bakteri. Dekomposisi berjalan intensif, khususnya setelah ikan melewati fase rigormortis, pada saat jaringan otot longgar dan jarak antar serta diisi oleh cairan. Bakteri mengeluarkan getah pencernaan, enzim yang merusak dan menghancurkan jaringan. Bakteri pada daging menyebabkan perubahan bau dan rasa, perubahan tampilan dan ciri fisik lendir, serta warna kulit ikan hilang dan menjadi tampak pucat dan pudar. Lapisan perut menjadi pucat dan hampir lepas dari dinding bagian dalam tubuh (Irianto dan Giyatmi 2009).
2.3 Anatomi Usus
Usus ikan bandeng panjang dan sempit dengan banyak pyloric caeca di daerah anterior dan mempunyai mukosa yang berfungsi untuk pencernaan dan penyerapan dengan konsentrasi yang tinggi (Lee et al. 1986). Usus ikan bandeng tidak bisa dibedakan antara duodenum dan ileum. Bagian tersebut berhubungan dengan caeca usus yang berjumlah kurang lebih 120 hingga 150 unit. Caeca usus berbentuk sederhana dan bercabang, seperti organ jari dengan panjang berbeda-beda. Bentuknya kompak dan terletak antara pyloric stomach dan lekukan usus (George dan Chandy 1959). Panjang usus bergantung pada jenis makanannya, usus ikan berupa tabung sederhana yang berukuran sama dari lambung sampai dubur. Bentuknya dapat lurus seperti pada ikan betutu dan lele atau melingkar-lingkar seperti ikan nila, mas, dan gurame bergantung pada bentuk rongga perut. Usus mempunyai lapisan epitel kolumnar sederhana, sel lendir melapisi lapisan submukosa yang berisi sel eosinofilik bergranula, berbatasan dengan mukosa muskularis lapisan usus (Kusrini 2007).
Bagian lumen pada usus dikelilingi oleh empat lapisan, yaitu serosa, muskularis, submukosa, dan mukosa. Serosa adalah membran yang lembut yang menyelimuti lapisan muskularis. Muskularis terdiri dari longitudinal luar dan lapisan sirkular dalam. Submukosa merupakan lapisan tipis yang bercabang ke dalam mukosa. Sel darah, tipe leukosit berserak atau banyak terdapat dalam submukosa. Mukosa merupakan lapisan yang terlihat, seperti epitelium berbentuk kubus yang ciri-cirinya sederhana atau bercabang dengan vili panjang. Sel epitel sempit dan panjang dengan dasar nukleus dan tersusun kompak. Sel mukosa luas dengan berbagai tahap aktivitas yang seluruhnya terjadi pada lekukan usus. Caeca usus merupakan perpanjangan pada usus. Kelenjar mukosa banyak terdapat pada caeca (George dan Chandy 1959).
Gambar 2 Dinding usus dengan perbesaran 17x secara skematis dalam tiga dimensi (Genesser 1994).
2.4 Anatomi Ginjal
Organ ginjal pada ikan berfungsi sebagai alat ekskresi dan osmoregulasi. Ginjal mempunyai peranan penting dalam ekskresi sisa nitrogen dan mengatur keseimbangan kadar air dan garam (homeostasis) (Piska dan Naik 1992).
Gambar 3 Susunan histologik suatu korpuskel ginjal secara skematis dalam tiga dimensi (Genesser 1994).
Ginjal terdiri dari sejumlah besar tubulus nefron yang berkembang dari depan ke belakang. Struktur ginjal memanjang, berpasangan, dan terletak di atas saluran pencernaan dan dekat dengan tulang punggung. Ginjal ikan teleostei umumnya dibagi menjadi dua bagian, yaitu kepala dan batang ginjal. Batang ginjal terdiri dari sejumlah besar nefron, masing-masing terdiri dari sel darah ginjal atau badan Malphigi dan tubulus. Ruang intertubular penuh dari jaringan limfoid yang terdistribusikan tidak merata. Ginjal bagian kepala umumnya terdiri dari limfoid, hematopoietik, interrenal dan jaringan chromaffin (supra renal), serta tubulus. Bermacam-macam variasi dalam jumlah, bentuk, dan ukuran sel-sel ginjal. Sel-sel ginjal besar jarang ditemukan. Ginjal ikan laut sebagian besar memiliki glomerulus dan sel ginjal yang kurang berkembang dengan baik, dan mungkin non-fungsional (Piska dan Naik 1992).
2.5 Anatomi Hati
Hati merupakan organ dalam terbesar dari tubuh. Selain itu, hati juga merupakan jaringan terbesar kelenjar. Di dalam organ hati, nutrisi akan diserap oleh saluran pencernaan, diproses, dan kemudian disimpan untuk digunakan oleh bagian tubuh yang lain. Metabolisme memiliki berbagai fungsi
(misalnya sintesis protein, penyimpanan metabolit, sekresi empedu, detoksifikasi, dan inaktivasi) yang mempunyai peranan penting dalam mempertahankan hidup. Hati akan menerima darah melalui vena portal atau arteri hepatik. Sebagian dari darah (70-80%) berasal dari vena portal yang membawa darah mengandung nutrisi dan akan diserap di dalam usus. Arteri hati merupakan sebuah cabang dari sumbu celiac yang beroksigen di dalam hati (Akiyoshi dan Inoue 2004).
Hati terletak di sisi rongga tubuh dorsal, berdekatan dengan tulang punggung, dengan beberapa meluas ke dasar sirip dada dekat ginjal anterior. Hati dikelilingi oleh kapsula jaringan ikat yang tipis, yaitu kapsula glisson, yang ditutupi oleh serosa hampir pada seluruh permukaannya. Di dalam kapsula glisson terdapat beberapa pembuluh darah kecil. Jaringan ikat membagi parenkim hati menjadi lobus, unit struktural yang disebut jaringan ikat portal atau jaringan ikat interlobular. Jaringan ikat mengelilingi portal triad, yaitu gabungan tiga saluran berisi cabang arteri hepatika, vena porta, dan duktus biliaris (Genesser 1994).
Gambar 4 Histologi hati dengan pewarnaan HE perbesaran 75x (Genesser 1994).
Lobulus hati
Jaringan ikat portal
Vena sentralis
Gambar 5 Hati ikan normal, (*) hepatosit dengan sitoplasma granular, dan inti pusat yang berbentuk bulat (panah) skala bar 10 mm, H.E. (Camargo dan Martinez 2007).
Hati juga merupakan organ vital yang berfungsi sebagai detoksifikasi dan mensekresikan bahan kimia yang digunakan untuk proses pencernaan. Hati berperan penting dalam proses metabolisme dan transformasi bahan pencemar dari lingkungan. Dengan demikian hati merupakan organ yang paling banyak mengakumulasi zat toksik sehingga mudah terkena efek toksik. Sebagian zat toksik yang masuk ke dalam tubuh setelah diserap oleh sel akan dibawa ke hati oleh vena porta hati sehingga hati berpotensi mengalami kerusakan. Adanya zat toksik akan mempengaruhi struktur histologi hati sehingga dapat mengakibatkan patologis hati seperti pembengkakan sel, rangkaian nekrosis atau bridging necrosis, degenarasi intralobular dan fokal nekrosis, fibrosis, serta cirrhosis (Camargo dan Martinez 2007).
2.6 Histologi
Histologi berasal dari bahasa Yunani yaitu histos yang berarti jaringan dan logos yang berarti ilmu. Jadi histologi berarti suatu ilmu yang menguraikan struktur dari hewan secara terperinci dan hubungan antara struktur pengorganisasian sel dan jaringan serta fungsi-fungsinya. Jaringan merupakan sekumpulan sel yang tersimpan dalam suatu kerangka struktur atau matriks yang mempunyai suatu kesatuan organisasi yang mampu mempertahankan keutuhan dan penyesuaian terhadap lingkungan diluar batas dirinya (Bavelander 1998).
Sajian histologi merupakan suatu irisan jaringan yang sangat tipis, yang cocok untuk dipelajari di bawah mikroskop cahaya atau mikroskop elektron. Sajian ini berfungsi sebagai pengamatan sesaat terhadap apa yang terjadi pada saat itu di dalam jaringan. Sajian yang akan diamati dengan mikroskop cahaya harus cukup tipis agar cukup ditembus cahaya dan menghindarkan tumpang tindih visual oleh berbagai unsurnya. Untuk mikroskopi cahaya biasanya sajian dibuat dengan teknik parafin (Cormack 1992).
Mikroteknik adalah ilmu yang mempelajari tentang pembuatan preparat. Setiap pembuatan preparat pada umumnya selalu dilakukan fiksasi terlebih dahulu. Fiksasi itu sendiri adalah suatu cara atau proses (metode) yang bertujuan untuk mematikan sel tanpa mengubah fungsi dan struktur di dalam sel itu sendiri. Jika telah dilakukan fiksasi maka preparat yang dibuat akan menjadi lebih awet dan tahan lama (Kiernan 1990).
2.7 Pemeriksaan Histologi
Histologi merupakan salah satu cabang ilmu yang mempelajari tentang organ atau bagian tubuh hewan atau tumbuhan secara cermat dan rinci. Upaya untuk mengamati, mempelajari serta meneliti jaringan-jaringan dari organisme tertentu dapat dilakukan dengan cara pembuatan spesimen atau preparat histologi. Menurut Davenport (1960) diacu dalam Gunarso (1986) penyiapan spesimen histologi secara umum dilakukan dengan 4 cara, yaitu:
(1) penyiapan preparat/spesimen secara keseluruhan (whole mount), yaitu pengamatan perkembangan embrio dan lain sebagainya;
(2) penyiapan spesimen dengan metode penyayatan (sectioning methods); (3) penyiapan dengan metode remasan (teasing/squashing methods); (4) penyiapan dengan menggunakan metode ulasan (smear methods).
Metode penyayatan (sectioning) adalah suatu metode yang banyak digunakan dalam penyiapan spesimen histologi. Metode ini dilakukan dengan menyayat spesimen hingga sangat tipis, kemudian diwarnai dan dijadikan spesimen awetan. Penyayatan dilakukan menggunakan mikrotom. Spesimen dilakukan perlakuan pengerasan agar memudahkan dalam penyayatan. Pengerasan jaringan dilakukan dengan cara membekukan atau dengan penanaman dalam suatu
substansi yang mampu mengeraskannya (Davenport 1960 diacu dalam Gunarso 1986).
Pembuatan preparat dengan metode parafin merupakan suatu metode yang paling umum digunakan. Metode ini banyak digunakan karena pembuatannya lebih mudah dan lebih cepat serta material kering dapat disimpan lebih lama (Kiernan 1990). Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik tumbuhan ataupun hewan menggunakan parafin. Kelebihan metode ini ialah irisan jauh lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode seloidin. Tebal irisan dengan metode beku rata-rata diatas 10 mikron, tetapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut, dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan dengan menggunakan metode ini karena sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada jaringan akan larut (Kiernan 1990).
Langkah-langkah dalam teknik histologi secara manual adalah fiksasi atau pengawetan jaringan, perlakuan (processing) jaringan, pemotongan jaringan, pewarnaan jaringan, serta pengamatan menggunakan mikroskop (Angka et al. 1990). Tahapan dalam persiapan preparat adalah fiksasi, dehidrasi, clearing, impregnasi dan embedding, blocking dan trimming, pemotongan, pewarnaan, dan perekatan jaringan.
Fiksasi merupakan tahap awal pembuatan preparat histologi yang dilakukan untuk mencegah autolisis dan dekomposisi postmortem dari suatu jaringan atau organ. Selain itu, fiksasi akan membuat padat suatu jaringan lunak. Hal ini disebabkan karena bahan fiksatif akan mengkoagulasi protein dalam sel dan jaringan. Fiksasi juga bertujuan untuk mengawetkan morfologi dan komposisi jaringan sehingga jaringan tetap, seperti keadaan semula sewaktu hidup, serta memudahkan pemulasan atau pewarnaan jaringan yang akan dilakukan pada tahapan selanjutnya (Cormack 1992).
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan jaringan histologis antara lain: tebal irisan jaringan 3-5 mm sehingga cairan fiksasi dapat dengan cepat memfiksasi seluruh jaringan, volume cairan fiksasi sekurang-kurangnya
harus 15-20x volume jaringan yang akan difiksasi. Besarnya volume jaringan menentukan volume fiksasi yang diperlukan sedangkan tebal jaringan menentukan kecepatan fiksasi. Panjang dan lebar jaringan umumnya ditentukan oleh jenis mikrotom yang akan digunakan, dan jenis cairan fiksasi yang akan digunakan bergantung kepada unsur jaringan yang akan didemonstrasikan dan kepada jenis pewarnaan yang akan digunakan. Untuk keperluan praktis, cairan fiksasi dapat dibedakan menjadi 3 kelompok, yaitu micro-anatomical fixation, cytological fixatives, dan histochemical fixatives (Kiernan 1990).
Larutan fiksasi disebut fiksatif. Beberapa fiksatif yang dapat digunakan antara lain fiksatif Zenker, fiksatif Clarke’s, fiksatif Carnoys, Buffer Normal Formalin (BNF), fiksatif Alcohol-formalin-acetic mixtures, larutan Bouin’s, Larutan Helly’s, fiksatif Altmann’s, larutan Gendre’s dan fiksatif Heidenhain ‘s (Kiernan 1990). Formula fiksatif BNF adalah (Kiernan 1990):
Sodium phosphate
NaH2PO4.H2O : 4,0 g Na2HPO4 (anhidrid) : 6,5 g
Akuades : 900 ml
Formaldehid 37-40 % : 100 ml
Waktu minimum yang dibutuhkan untuk jaringan dalam fiksatif ini adalah 24 jam dan maksimum 1 minggu. Konsentrasi formaldehid tidak terlalu berpengaruh, dan berkisar dari 2,5-10%. Fiksasi dilakukan dengan cara membenamkan potongan kecil jaringan ke dalam larutan fiksatif. Pengambilan jaringan dilakukan dengan pisau yang tajam. Hal ini bertujuan untuk menghindari kerusakan pada jaringan (Genesser 1994).
Tabel 1 Kelebihan dan kekurangan berbagai larutan pengawet
Larutan
Pengawet Kelebihan Kekurangan Formalin Cairan pengawet umum, pH netral,
potongan jaringan dapat ditinggalkan dalam pengawet tanpa terjadi
perubahan berarti (sampai 1 tahun)
Waktu perendaman > 24 jam, terjadi pengerutan jaringan
Muller Daya penetrasi cepat dan baik, memfiksasi nukleus dan sitoplasma dengan baik
Jika sampel direndam dalam pengawet (> 24 jam), jaringan menjadi rapuh, tidak dapat dipakai untuk pewarnaan dengan metode histokimia, harus dicuci dulu dengan air kran mengalir sebelum dilakukan dehidrasi
Bouin Daya penetrasi cepat dan merata tetapi menyebabkan pengerutan, memberikan warna cemerlang bila diwarnai dengan metode trichrome, sangat baik untuk nukleus dan kromoson, warna kuning membuat jaringan mudah dilihat saat perendaman dan pengirisan jaringan
Bila direndam dalam pengawet (> 24 jam), jaringan menjadi rapuh, harus dicuci dulu dengan air kran untuk menghilangkan kelebihan pikrat
Zenker Formol (Cairan Helly)
Daya fiksasi cepat dan kuat, sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang, limpa dan organ lain yang banyak mengandung darah, warna sitoplasma menjadi lebih cemerlang
Pemaparan jaringan dalam larutan yang melebihi waktu yang ditentukan mengakibatkan jaringan rapuh
Sumber: Kiernan 1990
Proses dehidrasi dilakukan dengan tujuan untuk menghilangkan air atau menarik cairan yang ada dalam jaringan setelah proses fiksasi dan digantikan parafin. Kandungan air yang tinggi akan menghambat proses selanjutnya. Cairan dalam jaringan akan menyebabkan jaringan menjadi lunak, berisi lumen dan mudah rusak saat penyayatan (Sass 1951).
Clearing merupakan suatu proses penjernihan yang bertujuan untuk menggantikan alkohol. Proses clearing dilakukan dengan menambahkan clearing agent yang berfungsi untuk melarutkan parafin. Pada proses ini jaringan menjadi jernih dan transparan sehingga tidak tertembus cahaya. Bahan yang dapat digunakan sebagai clearing agent, yaitu xylol, kloroform, dan benzol. Xylol banyak digunakan karena bekerja dengan cepat, membuat preparat cukup transparan dan bersifat dealkoholisasi (Sastrohadinoto et al. 1973). Menurut
Angka et al (1990), Setelah dilakukan proses dehidrasi, air di dalam sel akan keluar. Bagian yang kosong akan terisi parafin agar jaringan terikat kuat dengan parafin. Alkohol tidak dapat melarutkan parafin, oleh sebab itu digunakan xylol yang dapat melarutkan parafin dan dapat bercampur dengan alkohol.
Impregnasi merupakan proses pemasukan medium tanam ke dalam jaringan secara bertahap. Medium yang digunakan untuk menanam adalah parafin. Embedding adalah proses untuk memasukkan parafin cair ke dalam jaringan. Proses ini berlangsung di dalam oven pada suhu 60 oC karena titik cair parafin pada suhu 54 oC-58 oC. Proses ini bertujuan agar parafin menyusup ke dalam seluruh celah antar sel dan bahkan ke dalam sel sehingga jaringan lebih tahan saat dilakukan pemotongan (Angka et al. 1990). Pada suhu yang lebih tinggi dari titik cair parafin sisa-sisa dehidratant dan clearing agent akan lebih cepat menguap (Sastrohadinoto et al. 1973). Proses pembenaman ke dalam parafin membantu memudahkan pemotongan jaringan yang sangat tipis.
Jaringan yang telah dilakukan proses embedding menggunakan parafin cair lalu diblok (dicetak agar mudah dipotong) dengan parafin cair yang kemudian dibekukan. Proses ini membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas yang kaku seperti kertas kalender dengan ukuran 2x2x2 cm3. Parafin cair dituangkan ke dalam cetakan hingga memenuhi sekitar 1/8 bagian cetakan dan dibiarkan hingga sedikit membeku. Setelah itu, jaringan disusun dalam cetakan dan dituangi parafin cair hingga material jaringan terendam. Selanjutnya dibiarkan beku dalam suhu ruang selama 24 jam (Angka et al. 1990).
Blok parafin dikeluarkan dari cetakan setelah mengeras dan ditriming menggunakan silet. Tujuan dilakukannya trimming yakni membuang parafin yang berlebihan, mengatur bentuk potongannya agar rapi dan agar dapat disesuaikan dengan tempat blok alat pemotong (Sastrohadinoto et al. 1973, Angka et al. 1990).
Pemotongan jaringan dilakukan menggunakan pisau khusus yaitu mikrotom. Alat ini dilengkapi dengan pisau yang sangat tajam dan ketebalan irisan yang diingikan. Menurut Kiernan (1990) mikrotom ada beberapa macam yaitu :
(1) Mikrotom geser (sliding mikrotome).
Pada alat ini, jaringan tetap berada pada tempatnya, sedang pisaunya yang bergerak. Pada umumnya jaringan yang akan dipotong dengan mikrotom geser adalah jaringan yang tanpa penanaman (embedding ) terlebih dulu. Jaringan yang akan diiris sebelumnya dapat diwarnai dengan pewarnaan tunggal, ataupun tanpa warna terlebih dahulu. Metode ini banyak dikerjakan untuk pengirisan jaringan tumbuh-tumbuhan.
(2) Mikrotom beku ( freezing microtome).
Alat ini dihubungkan dengan tabung berisi CO2 dingin, melalui suatu pipa karet. Mikrotom ini keadaannya sama dengan mikrotom geser yaitu jaringan tetap berada pada tempatnya sedangkan pisau mikrotomnya yang bergerak ke muka dan ke belakang. Fiksasi dapat dijalankan setelah pemotongan dan sebelum pewarnaan.
(3) Mikrotom putar (rotary microtome).
Mikrotom ini letak pisau tetap pada tempatnya, sedangkan jaringannya yang bergerak ke atas dan ke bawah. Hal inilah yang membedakan mikrotom ini dengan kedua jenis mikrotom di atas. Jenis mikrotom ini yang biasanya digunakan untuk pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin.
Sayatan untuk jaringan keras dengan ketebalan 7-8 µm, sedangkan untuk jaringan lunak seperti daging, hati, ginjal dan lain-lain ketebalannya 5-6 µm. Pita parafin diletakkan di permukaan air hangat/waterbath (45 oC-50 oC). Hal ini bertujuan agar jaringan di dalam parafin teregang. Pita parafin diangkat dari permukaan air dengan menggunakan slide yang sebelumnya telah direndam di dalam metanol. Perendaman ini bertujuan untuk membersihkan kotoran yang menempel pada slide. Preparat yang telah merekat pada slide dibiarkan hingga mengering.
Pewarnaan dilakukan dengan melekatkan irisan jaringan pada kaca obyek. Sebelum pewarnaan harus dilakukan penghilangan parafin yang ada di dalam jaringan menggunakan xilene (xylol) kemudian dilakukan hidrasi dengan konsentrasi alkohol yang menurun, yaitu alkohol 100%, 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, dan 50% masing-masing selama 3 menit. Penghilangan parafin bertujuan agar jaringan menjadi jernih (Angka et al. 1990).
Pewarnaan histologi pada umumnya menggunakan kombinasi hematoksilin dan eosin (HE). Hematoksilin dan eosin adalah metode pewarnaan yang berfungsi ganda. Pertama memungkinkan pengenalan komponen jaringan tertentu dengan cara memulasnya secara differensial. Kedua, dapat memulas dengan tingkat atau derajat warna berbeda yang menghasilkan kedalaman pulasan yang berbeda. Hematoksilin berasal dari ekstrak dari pohon yang diberi nama logwood tree. Pada pulasan H & E, kompleks warna hemaktosilin berwarna ungu tua. Pewarna eosin memberikan warna merah muda sampai merah pada komponen jaringan yang tidak terpulas ungu-biru oleh hemaktosilin. Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa. Zat ini mewarnai unsur basofilik pada jaringan. Eosin bersifat asam serta memulas komponen asidofilik pada jaringan (Cormack 1992).
Mounting adalah suatu proses perekatan sayatan jaringan pada kaca sediaan menggunakan bahan perekat (adhesive). Proses mounting dilakukan menggunakan mounting media. Mounting media merupakan zat pengisi antara preparat yang telah diwarnai dengan kaca penutup. Terdapat dua jenis mounting media, yaitu dalam bentuk resin dan cairan. Resin media terdiri dari tiga tipe, yaitu alami, semi sintetis, dan sintetis sepenuhnya. Contoh resin media adalah Canada Balsam. Canada balsam merupakan mounting alami yang terdiri dari komponen volatil, yaitu resin yang merupakan cairan kental berwarna kuning dan meleleh ketika dipanaskan. Balsam yang dikeringkan akan berbentuk padat dan harus ditambahkan xylene sehingga dapat digunakan sebagai mounting media. Komponen tak jenuh dalam resin membuat Canada balsam sebagai agen pereduksi ringan. Oleh karena itu, media Canada balsam dapat mempertahankan warna pada preparat awetan histologi lebih dari satu bulan atau satu tahun. Contoh mounting media dalam bentuk cairan, antara lain Gliserol jelly, Buffer gliserol dengan PDD, fructose syrup,dan Apathy’s medium (Cormack 1992).
Penutupan kaca obyek dilakukan dengan menutupkan kaca penutup di atas sajian, sehingga apabila xylol dalam media penjernih menguap maka kaca penutup melekat erat dengan kaca obyek. Hal ini dilakukan agar permukaan yang dihasilkan tidak menyebabkan pantulan cahaya selama pengamatan mikroskopis (Geneser 1994).
