EFEK EKSTRAK BEE POLLEN
DALAM MEMODULASI AKTIVITAS AMOXICILLIN TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus
THE EFFECT OF BEE POLLEN EXTRACT TO MODULATE AMOXICILLIN ACTIVITIES AGAINST BACTERIA Staphylococcus aureus
AMALIA PERTIWI AKBAR N111 14 051
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
EFEK EKSTRAK BEE POLLEN
DALAM MEMODULASI AKTIVITAS AMOXICILLIN TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus
THE EFFECT OF BEE POLLEN EXTRACT TO MODULATE AMOXICILLIN ACTIVITIES AGAINST BACTERIA Staphylococcus aureus
SKRIPSI
untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana
Amalia Pertiwi Akbar N111 14 051
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
vi
UCAPAN TERIMAKASIH
Alhamdulillahi robbil alamin puji dan puji syukur kepada Allah SWT.
karena berkat, rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin. Salawat serta salam tak henti-hentinya kita panjatkan kepada junjungan kita Rasulullah Muhammad SAW. serta keluarga dan para sahabat sehingga kita masih bisa menikmati indahnya berislam.
Banyak kendala yang penulis hadapi selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. Namun karena adanya dukungan moril maupun materil dari berbagai pihak, akhirnya penulis mampu menyelesaikan dan merampungkan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa hormat dan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Pembimbing utama Bapak Prof. Dr. H. M. Natsir Djide, MS., Apt serta kepada pembimbing pertama, Ibu Dr. Sartini, M.Si., Apt. yang telah meluangkan banyak waktu, petunjuk, perhatian dan kesabaran dalam membimbing dan mengarahkan penulis mulai dari saat mengerjakan perencanaan penelitian hingga selesainya penelitian dan skripsi ini 2. Ibu Prof.Dr. rer-nat. Marianti A. Manggau, Apt., Bapak Muh. Aswad.,
S.Si., M.Si., Ph.D., Apt., dan Bapak Sukamto S. Mamada, S.Si., M.Sc., Apt. selaku tim penguji ujian skripsi yang telah memberi kritik dan saran yang sangat membantu dalam penyusunan skripsi ini.
vii
3. Dekan, Wakil Dekan, serta staf dosen dan pegawai Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas bantuan serta motivasi-motivasi yang diberikan.
4. Dosen pembimbing akademik, Bapak Sukamto S. Mamada, S.Si., M.Sc., Apt yang telah meluangkan waktunya dalam membimbing dan memberikan nasehat akademik yang membangun kepada penulis.
5. Seluruh laboran laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin.
Khususnya Kak Lia, Kak Sumi dan Kak Dewi atas segala bantuan fasilitas selama penulis mengerjakan penelitian.
6. Rekan seperjuangan penelitian, Nur Ainiah dan Juwinda yang selalu sabar dan tetap saling menyemangati ketika salah satu mulai menyerah.
7. Sahabat-sahabat terdekat, Ulfa Yulyani, Sabrina Resky P, Juwinda, Indardaya, Haerunnisa, Astria Dewi M., Ayu Indah Rahayu, Nurul Mukhlisah, Melati Mekar Mewangi dan Angelina E.F. Kounang yang selalu meluangkan waktunya mendengar keluh kesah penulis, memberikan semangat, motivasi dan menjadi pendorong penulis untuk selalu bersabar dan bersyukur.
8. Korps Asisten Mikrobiologi dan Korps Asisten Farmasetika yang selalu memberikan semangat dan menumbuhkan rasa ingin belajar untuk penulis.
9. Kakak-Kakak DESINTEGRATOR khususnya Kak Eka Selvina, S.Si., Kakak THEOBROMINE, teman-teman HIOSIAMIN, adik-adik POISON dan NEOSTIGMINE serta seluruh Keluarga Mahasiswa Fakultas
viii
ix
ABSTRAK
AMALIA PERTIWI AKBAR. Efek Ekstrak Bee Pollen Dalam Memodulasi Aktivitas Amoxicillin Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus (dibimbing oleh M. Natsir Djide dan Sartini)
Bee pollen adalah salah satu bahan alam yang mengandung senyawa fenolik.Staphylococcus aureus merupakan jenis bakteri patogen yang dapat mengakibatkan infeksi yang serius.Pengobatan infeksi akibat S. aureus salah satunya menggunakan antibiotika jenis penisilin, namun telah banyak dilaporkan mengalami resistensi.Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan modulasi ekstrak bee pollen dalam meningkatkan aktivitas antibakteri amoxicillin terhadap S. aureus ATCC 33592. Bee pollen diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan cairan penyari etanol 96% (1:10).Metode yang digunakan untuk menetukan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ekstrak, antibiotika dan antibiotika yang dikombinasi dengan ekstrak adalah dilusi cair (makrodilusi). Efek modulasi ekstrak terhadap aktivitas antibakteri amoksisilin diperoleh melalui penentuan faktor modulasi. Hasil penelitian menunjukkan nilai KHM ekstrak bee pollen 5 mg/mL dan nilai KHM amoxicillin 4 µg/mL. KHM amoxicillin turun menjadi 1 µg/mL setelah dikombinasi dengan ekstrak bee pollen 1,25 mg/mL dan 0,625 mg/mL. Penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak bee pollen dapat meningkatkan aktivitas antibakteri amoxicillin terhadap S. aureus 4 kali efeknya dibandingkan amoxicillin sendiri.
Kata Kunci: Amoxicillin, Bee Pollen, Efek Modulasi, Ekstrak etanol, Staphylococcus aureus ATCC 33592.
x
ABSTRACT
AMALIA PERTIWI AKBAR. Effect of Bee Pollen Extract to Modulate Amoxicillin Activities Against Bacteria Staphylococcus aureus (Supervised by M. Natsir Djide and Sartini).
Bee pollen is one of the natural ingredients that contain phenolic compounds. Staphylococcus aureus.,a species of pathogenic bacteria that can lead to serious infections. Penicillin-type antibiotics are often used as a treatment for S. aureus infections,however it has been widely reported to be resistance. The aim of this study was to determine the ability of bee pollen extractsto modulate the antibacterial activity of amoxicillin against S. aureus ATCC 33592. Bee pollen was extracted with a maceration method using 96%
ethanol (1:10).The method used to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of extracts, antibiotics and antibiotics combined with the extracts was broth dilution method (macrodilution). The modulation effect of the extracts towards amoxicillin activity was obtained by determination of modulation factor. The results showed that MIC value of bee pollen extract was 5 mg/mL and MIC value of amoxicillin was 4 µg/mL. The MIC value of amoxicillin was down to 1 µg/mL after combined with 1.25 mg/mL and 0.625 mg/Ml bee pollen extracts. This study showed that Bee pollen extracts can increase the antibacterial activity of amoxicillin against S. aureusb acteria by 4 times stronger than amoxicillin itself.
Keywords: Amoxicillin, Bee pollen, Ethanol Extracts, Modulation Effect, Staphlococcus aureus ATCC 33592.
xi
DAFTAR ISI
Halaman
UCAPAN TERIMA KASIH vi
ABSTRAK ix
ABSTRACT x
DAFTAR ISI xi
DAFTAR TABEL xiv
DAFTAR GAMBAR xv
DAFTAR LAMPIRAN xvi
BAB I PENDAHULUAN 1
I.1 Latar Belakang 1
I.2 Rumusan Masalah 3
I.3 Tujuan Penelitian 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 4
II.1 Bee Pollen 4
II.1.1 Karakteristik 4
II.1.2 Kandungan kimia dan manfaat sampel 4
II.2 Staphylococccus aureus 6
II.3 Antibiotika 7
II.3.1 Amoxicillin 8
II.4 Metode Pengujian 10
II.4.1 Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri 10
xii
BAB III METODE PENELITIAN 13
III.1 Alat dan Bahan 13
III.2 Metode Kerja 13
III.2.1 Ekstraksi Bee pollen 13
III.2.2 Penentuan Kadar Total Polifenol 14
III.2.2.1 Pembuatan Larutan Standar 14
III.2.2.2 Pengukuran Kadar Total Polifenol 14
III.2.3 Sterilisasi Alat 14
III.2.4 Pembuatan Media Mueller Hinton Broth (MHB) 15
III.3 Pembuatan Larutan Stok 15
III.3.1 Pembuatan Larutan Stok Ekstrak Bee pollen 15 III.3.2 Pembuatan Larutan StokAmoxicillin 15
III.4 Penyiapan Biakan Bakteri 15
III.5 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) 16 III.5.1 Penentuan KHM Ekstrak Bee pollen 16
III.5.2 Penentuan KHM Amoxicillin 16
III.5.3 Penentuan KHM Amoxicillin Yang Dikombinasi
. Ekstrak Bee pollen 17
III.6 Penentuan Modulasi Ekstrak Terhadap Efek
Antibiotika Amoxicillin TerhadapStaphylococcus aureus 17 III.7 Pengumpulan dan Analisis data 18
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 19
IV.1 Hasil Ekstraksi dan Hasil Analisis Kadar Total Polifenol 19 IV.2 Hasil Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum
xiii
(KHM) Terhadap Staphylococcus aureus 20 IV.2.1 Hasil Penetuan Nilai KHM Ekstrak Bee pollen 20 IV.2.2 Hasil Penentuan Nilai KHM Amoxicillin 21 IV.2.3 Hasil Penentuan KHM Amoxicillin Yang Dikombinasi
Ekstrak Bee Pollen dan Faktor Modulasi Terhadap S. aureus 22
BAB V PENUTUP 26
V.1 Kesimpulan 26
V.I Saran 26
DAFTAR PUSTAKA 27
LAMPIRAN 31
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Hasil Ekstraksi dan Rata-Rata Polifenol Ekstrak Bee pollen 19
2. Hasil Penentuan KHM Ekstrak Bee pollen 20
3. Hasil Penentuan KHM Amoxicillin 21
4. Standar Interpretasi Konsentrasi Hambat Minimum
Untuk Bakteri Staphylococcus sp. 22
5. Hasil Penentuan KHM Amoxicillin
Yang dikombinasi Ekstrak bee pollen 1,25 mg/mL 22 6. Hasil Penentuan KHM Amoxicillin
Yang dikombinasi Ekstrak bee pollen 0,625 mg/mL 23 7. Hasil Penentuan KHM Amoxicillin
Yang dikombinasi Ekstrak bee pollen dan Faktor Modulasi 23
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Bakteri Stapyhlococcus aureus 6
2. Struktur Amoxicillin 8
3. Ekstrak Etanol Bee pollen 38
4. Hasil Pengamatan Penentuan KHM
Ekstrak Bee pollen Terhadap S. aureus 38
5. Hasil Pengamatan Penentuan KHM Amoxicillin Terhadap S. aureus 39 6. Hasil Pengamatan Penentuan KHM Amoxicillin Yang Dikombinasi
Ekstrak Bee pollen 1,25 mg/ml 40
7. Hasil Pengamatan Penentuan KHM Amoxicillin Yang Dikombinasi
Ekstrak Bee pollen 0,625 mg/ml 40
8. Isolat Bakteri S. aureus Pada Media MHA 41 9. Suspensi Bakteri S. aureus Sesuai Kekeruhan Mc Farland 0,5 41
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Skema Kerja 31
2. Skema Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum
Ekstrak Bee pollen 32
3. Skema Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum Amoxicillin 33 4. Skema Penentuan KHM Amoxicillin Yang Dikombinasi
Esktrak Bee Pollen terhadap Staphylococcus aureus. 34
5. Perhitungan Faktor Modulasi 36
6. Perhitungan Kadar Total Polifenol 37
7. Dokumentasi Kegiatan 38
8. Komposisi Medium 42
1
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Bee pollen adalah salah satu bahan alam yang mengandung senyawa fenolik, protein, asam amino, karbohidrat, lipid dan asam lemak, enzim, dan koenzim, vitamin dan bioelemen (Hajková et al., 2013). Senyawa fenolik seperti flavonoid yang terkandung pada bee pollen memberikan efek sebagai antibakteri (Cushnie and Lamb, 2005).Bee pollen digunakan dalam pengobatan karena menunjukkan efek terapi seperti antimikroba, antijamur, antivirus, anti-inflamasi, imunostimulan, dan analgesik lokal dan juga memfasilitasi proses granulasi penyembuhan luka bakar (Komosinska- Vassev et al., 2015). Menurut penelitian yang dilakukan Miroslava dkk (2012) menunjukkan bahwa bee pollen yang diekstraksi dengan larutan penyari etanol 96% dan 70% dapat menghambat pertumbuhan S.aureus, penelitian Abouda dkk (2011) menggunakan bee pollen yang diekstraksi dengan beberapa variasi konsentrasi larutan penyari ekstrak etanol 50%,60%,70%
dan 80% menunjukkan bahwa ekstrak lebih rentan menghambat bakteri gram positif daripada bakteri gram negatif, penelitian Solange dkk (2015) menunjukkan bahwa ekstrak etanol bee pollen pada konsentrasi larutan penyari 90% dapat menghambat bakteri S. aureus.
Senyawa fenolik seperti flavonoid merupakan salah satu senyawa yang memberikan efek sebagai antibakteri (Cushnie and Lamb, 2005).
2
Menurut penelitian Blesson dkk (2015) menunjukkan bahwa efek gentamisin meningkat hingga 10 kali lipat bila dikombinasi talas dengan Gentamisin yang digunakan untuk melawan MRSA, penelitian Hanan dkk(2012) menunjukkan bahwa minyak lemon memiliki aktivitas sinergis yang signifikan dengan antibiotika amoxicillin terhadap bakteri MRSA, penelitian Braga dkk (2005) menunjukkan bahwa kombinasi ekstrak etanol Punica granatum dengan antibiotika ampisilin mengurangi viabilitas sel bakteri sehingga meningkatkan onset antibiotika dari 3 jam menjadi 7 jam terhadap bakteri MRSA.
Staphylococcus aureus atau S. aureus merupakan jenis bakteri yang sebagian besar ditemukan pada lingkungan yang kering dan bertahan lama.S. aureus dapat menyebabkan infeksi yang serius (Carboneau et al., 2010; Nair et al., 2013). Pengobatan infeksi akibat S. aureus awalnya menggunakan antibiotika jenis penisilin, akan tetapi sekarang 80% isolat S.aureus resisten terhadap penisilin sehingga dilakukan pengembangan, antibiotika penisillin (seperti amoksisilin, piperasilin dan ticarsillin) dikombinasi dengan obat inhibitor β-laktamase (seperti, asam klavulanat) untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme akan tetapi kombinasi keduanya beresiko terjadinya sindrom Stevens Johnson, purpura dan hepatitis. Tingkat pelaporan hepatitis rata-rata Sembilan kali lipat lebih tinggi bila dikombinasi daripada menggunakan amoxicillin tunggal, golongan penisillin seperti amoxicillin masih digunakan dalam kombinasi obat sebab memiliki efek samping yang jarang terjadi (Deurenberg et al., 2007;
3
Greenwood, 2008). Kombinasi obat secara umum memiliki biaya yang cukup mahal. Salah satu alternatif yang dapat dilakukan adalah mencari bahan alam yang mampu meningkatkan aktivitas antibiotika yang ada.
Resistensi antibiotika merupakan ancaman global bagi dunia kesehatan. Pada awalnya resistensi terjadi di tingkat rumah sakit, tetapi lambat laun juga berkembang di lingkungan masyarakat, khususnya bakteri Staphylococcus aureus (Permenkes, 2011).WHO (World Health Organization)(2014) melaporkan sekitar 2 - 81% Staphylococcus aureus resisten terhadap antibiotika.
I.2 Rumusan Masalah
Permasalahan yang timbul adalah apakah ekstrak bee pollen mampu memodulasi efek antibakteri dari amoxicillin sehingga dapat meningkatkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus.
I.3 Tujuan Penelitian
Tujuan dilakukannya penelitian ini yaitu untuk mengetahui pengaruh ekstrak bee pollen dalam meningkatkan aktivitas antibiotika amoxicillin terhadap bakteri Staphylococcus aureus, untuk itu dilakukan penelitian efek ekstrak bee pollen dalam memodulasi aktivitas amoxicillin terhadap bakteri Staphylococcus aureus.
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Bee Pollen II.1.1 Karakteristik
Bee pollen merupakan serbuk sari yang telah dikemas oleh lebah madu menjadi bentuk butiran yang telah ditambahkan madu atau nektar. Bee pollen berukuran 2,5 – 250 µm, bentuk bee pollen beragam berdasarkan jenis tanamannya seperti, bentuk bulat, silinder, lonceng, segitiga dan berduri, Bobot bee pollen belasan hingga puluhan mikrogram. Warna serbuk sari bervariasi mulai dari kuning cerah hingga hitam.Serbuk sari yang dikumpulkan oleh lebah madu biasanya terdiri dari serbuk sari dari satu tanaman saja atau bahkan lebih (Boukraâet al., 2013; Komosinska-Vassev et al., 2015).
II.1.2 Kandungan kimia dan manfaat
Bee pollen mengandung senyawa fenolik, protein, asam amino, karbohidrat, lipid dan asam lemak, enzim dan koenzim serta vitamin dan bioelemen. Bee pollen mengandung 1,6% senyawa fenolik termasuk 1,4%
flavonoid, leukotrien, katekin, dan asam fenolik, 22,7% dari protein rata-rata, termasuk 10,4% dari asam amino esensial seperti metionin, lisin, treonin, histidin, leusin, isoleusin, valin, fenilalanin, dan elemen protein triptopan (Carpes et al., 1818; Boukraâet al., 2013).
5
Bee pollen memiliki efek terapiseperti antimikroba,antijamur, antiviral, antiinflamasi, imunostimulan,analgesik lokal dan juga memudahkan proses granulasi dari luka bakar luka penyembuhan (Komosinska-Vassev et al., 2015). Ekstrak pollen memiliki aktivitas antibakteri yang cukup kuat dan efektif terhadap bakteri patogen gram positif dan gram negatif, flavonoid dan asam fenolik pada bee pollen yang berpotensi memiliki aktivitas tersebut (Komosinska-Vassev et al., 2015).
Flavonoid merupakan salah satu senyawa yang terkandung di dalam bee pollen yang memiliki aktivitas antibakteri. Aktivitas antibakteri pada flavonoid memiliki beberapa target seluler, bukan satu mekanisme yang spesifik. Mekanisme flavonoid sebagai antibakteri antaralain, membentuk kompleks dengan membran protein dan dinding sel melalui pengikatan hidrogen secara nonspesifik dan efek hidrofobik, dan juga dengan pembentukan ikatan kovalen (Jayaprakasha et al 2005; Aiyegoro and Okoh, 2009), flavonoid juga dapat bekerja sebagai efflux pump inhibitor (Ughachukwu and Unekwe, 2012). Efflux Pump Inhibitors (EPIs) merupakan agen terapetik yang dapat mengembalikan aktivitas antibiotika dengan beberapa mekanisme, antara lain dengan meningkatkan masuknya antibiotika ke dalam membran yang kemudian meningkatkan konsentrasi obat di dalam sel(Handzlik et al, 2013).
6
II.2 Staphylococcus aureus
Gambar 1. Bakteri Staphylococcus aureus (Sumber: Prescott, 2002)
Klasifikasi bakteri Staphylococcus aureus adalah sebagai berikut, Divisio : Protophyta
Class : Schizomycetes Ordo : Eubacteriales Famili : Micrococcaceae Genus : Staphylococcus
Species : Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif yang berbentuk bulat seperti anggur dengan diameter 0,5 – 1,5 µm, S. aureus adalah bakteri yang non-motil, tidak memiliki spora, toleran terhadap konsentrasi garam yang tinggi, menunjukkan ketahanan terhadap panas dan termasuk bakteri anaerob fakultatif. Bakteri S. aureus tumbuh pada suhu 10-45°C dengan suhu optimum yaitu 37°C. Pada tubuh biasanya terdapat pada permukaan kulit, kelenjar kulit, membran lendir, aliran darah dan saluran pernapasan
7
bagian bawah dan tempat-tempat lainnya (Cells et al., 2002; Joshi and Devkota, 2014).
Mekanisme umum S. aureus mengalami resisten terhadap antimikroba terbagi atas empat mekanisme, yaitu membatasi konsentrasi obat di dalam sel melalui perubahan permeabilitas membran, modifikasi target obat, inaktivasi obat dan pengaktifan pompa efflux terhadap obat (Handzliket al., 2013; Reygaert, 2013).
II.3 Antibiotika
Antibiotika adalahbahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme, yang mempunyai kemampuan menghambat atau mematikan mikroorganisme lain. Penggolongan antibiotika berdasarkan mekanisme kerja yaitu (Djide, 2014):
1. Menghambat sintesis dinding sel bakteri atau menghambat aktivitas enzim yang dapat merusak dinding sel mikroorganisme. Contohnya adalah penisilin,cephalosporin, karbapenem, monobaktam dan vankomysin.
2. Menghambat fungsi permeabilitas membran sel yang bekerja langsung pada membran sel yang mempengaruhi permeabilitas dan menyebabkan keluarnya senyawa di dalam sel mikroorganisme (bakteri). Contohnya adalah polymyxin dan kolistin.
3. Menghambat sintesis protein dengan mempengaruhi fungsi ribosom 30S dan 50S pada mikroorganisme yang menyebabkan sintesis protein terhambat. Contohnya adalah Aminoglukosida, tetrasiklin, kloramfenikol,
8
linkomisin, klindamisin dan eritromisin.
4. Menghambat sintesis asamnukleat sel mikroba. Contohnya adalah rifampicin yang menghambat sintesis RNA polimerase dan kuinolon yang menghambat topoisomerase. Keduanya bersifat bakterisidal.
5. Menghambat enzim yangberperan dalam metabolisme folat. Contohnya adalah trimethoprime dan sulfonamide. Keduanya bersifat bakteriostatik.
II.3.1 Amoxicillin
Gambar 2. Rumus struktur amoxicillin (Sumber: Farmakope Indonesia Ed. IV, 1995)
Menurut Ditjen POM (1995), sifat fisika dan kimia amoksisilin adalah sebagai berikut:
Rumus molekul : C16H19N3O5S.3H2O
Berat molekul : 419, 45. 365, 9 dalam bentuk anhidrat Pemerian : serbuk hablur, putih, praktis tidak berbau.
Kelarutan : sukar larut dalam air dan metanol, tidak larut dalam benzena, dalam karbon tertraklorida dan dalam kloroform.
pH : 3,5-6,0
9
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, pada suhu kamar terkendali
Amoxicillin adalah antibiotika semi sintetik dan termasuk turunan penisilin (β-laktam) yang stabil pada asam, efektif bekerja pada bakteri gram positif dan negatif.Amoxicillin bersifat bakterisida dengan mekanisme kerja menghambat biosintesis dinding sel mukopeptida dengan mengikat Penisilin Binding Protein A1 (PBP A1) sehingga Menghambat cross-linking antara rantai polimer peptidoglikan linear yang membentuk komponen utama dari sel dinding bakteri(Kaur et al., 2011).
Amoxicillin memiliki absorbsi obat dalam saluran cerna lebih sempurna, sehingga kadar darah dalam plasma dan saluran seni lebih tinggi.
Amoxicillin memiliki cincin β-laktam sebagai inti dasar yang dapat diinaktivasi oleh enzim β-laktamase yang diproduksi oleh mikroorganisme sehingga amoxicillin tidak efektif untuk melawan bakteri yang memproduksi β- laktamase (Ashnagar and Naseri, 2007).
Proses resistensi amoxicillin terhadap bakteri Staphylococcus aureus disebabkan karena bakteri Staphylococcus aureus dapat menghasilkan enzim β-laktamase yang menyerang cincin β-laktam pada molekul penisilin.
Enzim ini bekerja dalam peningkatan perlawanan terhadap penisilin. Enzim β-laktamase melindungi bakteri gram positif dan gram negatif. Pada gram positif, enzim dibebaskan kedalam medium dan menghancurkan antibiotika sebelum mencapai sel dan pada bakteri gram negatif enzim secara strategis
10
terlokasi pada rute dimana antibiotika harus berjalan untuk mencapai targetnya (Article, 2012; Tandari, 2016).
II.4 Metode Pengujian
I.4.1 Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri
Penentuan aktivitas antibakteri secara in vitro dan penentuan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dapat dikelompokkan dalam tiga metode, yaitu (Valgas et al., 2007; Balouiriet al., 2016) :
1. Metode difusi
Pada metode difusi, terdiri dari metode disk difusi agar dan metode gradien antimikroba (Etest). Metode disk difusi agar menggunakan media padat, mikroorganisme diinokulasikan pada media dan kertas cakram (berdiameter 6 mm) yang mengandung senyawa uji pada konsentrasi tertentu di letakkan diatas media agar pada cawan petri, diinkubasi selama 1 x 24 jam, larutan uji akan berdifusi ke dalam agar dan pertumbuhan mikroorganisme akan terhambat ditandai dengan diameter zona hambat disekeliling kertas cakram. Metode gradien antimikroba (Etest) menggabungkan prinsip metode pengenceran dengan metode difusi yang diuji di media agar untuk menentukan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) berdasarkan gradien konsentrasi.
2. Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)- bioautografi
Pada metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) terdiri dari metode difusi agar, biaoutografi langsung dan Agar overlay bioassay. Metode difusi agar disebut juga metode kontak menggunakan lempeng KLT yang agen
11
antimikroba pada lempeng tersebut akan berdifusi ke media agar pada cawan petri. Setelah beberapa menit atau jam kromatogram akan dilepas dan cawan petri berisi agar dan inokulum mikroorganisme diinkubasi. Hasil positif berupa zona hambat pada bagian senyawa antimikroba yang kontak dengan agar. Metode bioautografi langsung, lempeng KLT akan dicelup atau disemprotkan dengan suspensi mikroorganisme kemudian diletakkan pada media dan diinkubasi.
3. Metode dilusi
Metode dilusi merupakan metode yang tepat untuk penentuan nilai KHM. Konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme didefinisikan sebagai nilai KHM, metode ini dapat digunakan secara kuantitaif untuk mengukur aktivitas antimikroba secara in vitro dalam melawan bakteri dan jamur. Metode dilusi terbagi atas,
1. Metode dilusi cair
Metode dilusi cair terdiri dari metode makrodilusi dan mikrodilusi.
- Metode makrodilusi, menggunakan media cair MHB yang dimasukkan ke dalam tabung dengan volume minimal 2 ml. Tiap tabung diinokulasikan inokulum yang sesuai dengan 0,5 Mc. farland. Kelebihan metode ini, lebih mudah dalam pengamatan. Kekurangan dari metode ini yaitu, tingginya resiko kesalahan dalam persiapan, membutuhkan reagen yang relatif besar.
- Metode mikrodilusi, menggunakan media cair MHB yang dimasukkan ke dalam well plate 96 dengan volume yang lebih kecil daripada metode
12
makro. Tiap well plate diinokulasikan inokulum yang sesuai dengan 0,5 Mc. farland. Kelebihan dari metode ini yaitu, jumlah media, sampel dan mikroba yang digunakan lebih sedikit dan reagen yang digunakan untuk mendeteksi relative rendah. Kekurangan metode ini, resiko terjadinya kesalahan pada saat mengerjakan lebih tinggi.
2. Metode dilusi agar
Metode dilusi agar menggunakan konsentrasi zat antimikroba yang diinginkan ke dalam media agardan biasanya pengenceran dua kali lipat.
Tiap media agar pada cawan petri digoreskan suspensi bakteri yang setara dengan 0,5 Mc. farland.
13
BAB III
METODE PENELITIAN
III.1 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah Autoklaf (All American®), gelas piala (Pyrex®), inkubator (Memmert®), labu tentukur (Pyrex®), lampu spiritus, mikropipet, oven, (Memmert®), ose bulat, tabung reaksi, timbangan analitik, tip steril dan vial steril.
Bahan yang digunakan adalah aluminium foil, alkohol 96%, air suling steril, bee pollen dari peternakan Lawang Malang,dimetil sulfoksida (DMSO) (Merc®), kapas, kertas saring, Medium Mueller Hinton Broth (MHB), plastic wrap, silika gel, serbuk amoksisilin, suspensi bakteri Staphylococcus aureus ATCC 33592, Standar Mc Farland 0,5 (H2SO4 1% 9,95 ml, BaCl2 1%
0,05 ml).
III.2 MetodeKerja
III.2.1 Ekstraksi Bee Pollen
100 g bee pollen diekstraksi menggunakan etanol 96% sebanyak 1000 mL (1:10).Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi selama 72 jam. Ekstrak yang diperoleh disaring menggunakan kertas saring dan diuapkan pelarutnya hingga diperoleh ekstrak kental.
14
III.2.2 Penentuan Kadar Total Polifenol III.2.2.1 Pembuatan Larutan Standar
Dilarutkan 10 mg asam gallat dalam metanol hingga 100 mL (100 bpj). Dibuat seri pengenceran 1,5, 3, 5, 7, 10 dan 15 bpj dengan mengambil dari larutan stok kemudian ditambahkan 2,5 mL reagen Folin- Ciocalteau dan 2 mL larutan natrium karbonat 7,5% kemudian dicukupkan dengan air suling hingga 5 mL. Diinkubasi selama 60 menit pada suhu ruangan lalu diukur absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang 648,0 nm.
III.2.2.2 Pengukuran Kadar Total Polifenol
Dilarutkan 100 mg serbuk bee pollen dalam metanol hingga volume mencapai 10 mL. Diambil sebanyak 0,5 mL dari larutan stok dan ditambahkan 2,5 mL reagen Folin-Ciocalteau dan 2 mL larutan natrium karbonat 7,5% kemudian dicukupkan dengan air suling hingga 5 mL.
Diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan lalu diukur absorbansi sampel menggunakan spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang 648,0 nm.
III.2.3 Sterilisasi alat
Alat-alat gelas disterilkan dalam oven pada suhu 180°C selama 2 jam. Adapun alat-alat gelas yang berskala dan tidak tahan terhadap pemanasan dan yang terbuat dari plastik disterilkan dalam autoklaf pada
15
suhu 121°C selama 15 menit. Ose disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala api bunsen.
III.2.4 Pembuatan Medium MHB (Mueller Hinton Broth)
Sebanyak 2,1 g Mueller Hinton Broth dilarutkan dengan air suling hingga 100 mL. Cek pH medium dengan rentang pH 7,3 ± 0,1 kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi sejumlah media yang ditentukan dan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C.
III. 3 Pembuatan Larutan Stok
III.3.1 Pembuatan Larutan Stok Ekstrak Bee Pollen
Sebanyak 0,2 g ekstrak bee pollen dilarutkan dengan 5 mL DMSO dan 5 mL media MHB (20 mg/mL).
III.3.2 Pembuatan Larutan Stok Amoxicillin
Sebanyak 0.016 g amoxicillin dilarutkan dengan DMSO dan dicukupkan di dalam labu tentukur 100 mL (160 µg/mL) dengan air suling steril kemudian dibuat konsentrasi 80 µg/mL, 40 µg/mL, 20 µg/mL, 10 µg/mL dan 5 µg/mL.
III.4 Penyiapan Biakan Bakteri
Bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah Staphylococcus aureus. Diremajakan bakteri uji dalam medium MHA serta diinkubasi pada suhu 37ºC selama 1 x 24 jam. Biakan bakteri disuspensikan sesuai dengan
16
kekeruhan Mc. Farland 0,5 (1.5 × 108 CFU/mL) dan selanjutnya digunakan sebagai bakteri uji.
III.5 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimun (KHM) III. 5.1 Penentuan KHM Ekstrak Bee Pollen
Penentuan konsentrasi hambat minimum ekstrak bee pollen dilakukan dengan metode dilusi cair menggunakan media MHB. Ekstrak bee pollen dengan konsentransi 20 mg/mL diambil 2,5 mL dan dimasukkan ke dalam 2,5 mL media, 1,25 mL dimasukkan ke dalam 3,75 mL media dan 0,625 mL dimasukkan ke dalam 4,375 mL media MHB sehingga konsentrasinya menjadi 10 mg/mL, 5 mg/mL dan 2,5 mg/mL. Masing-masing tabung dimasukkan 1 ose suspensi bakteri uji S. aureus yang setara dengan Mc.Farland 0,5 (1.5 × 108 CFU/mL). Diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37° C dan amati pertumbuhan bakteri.
III.5.2 Penentuan KHM Amoxicillin
Penentuan konsentrasi hambat minimum amoxicillin dilakukan dengan metode dilusi cair menggunakan media MHB. Masing masing konsentrasi amoxicillin diambil 1 mL dan dicampuarkan dengan 9 mL media MHB sehingga konsentrasinya menjadi 16 µg/mL, 8 µg/mL, 4 µg/mL, 2 µg/mL, 1 µg/mL dan 0,5 µg/mL. Masing-masing tabung dimasukkan 1 ose suspensi bakteri uji S. aureus yang setara dengan Mc.Farland 0,5 (1.5 × 108 CFU/mL).
Diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37°C dan amati pertumbuhan bakteri.
17
III.5.3 Penentuan KHM Amoxicillin Kombinasi Ekstrak Bee Pollen
Penentuan konsentrasi hambat minimum dari amoxicillin yang dikombinasi dengan ekstrak bee pollen dilakukan dengan metode dilusi cair menggunakan media MHB. Konsentrasi ekstrak bee pollen seperempat dan seperdelapan dari nilai KHM dicampurkan masing masing dengan media MHB pada tabung reaksi hingga homogen kemudian ditambahkan amoksisilin sesuai konsentrasi yang telah ditentukan (2 µg/mL, 1 µg/mL, 0,5 µg/mL, 0,25 µg/mL dan 0,125 µg/mL). Media dimasukkan 1 ose suspensi bakteri uji S.aureus yang setara dengan Mc Farland 0,5 (1.5 × 108 CFU/mL).
Diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37°C dan amati pertumbuhan bakteri.
III.6 Penentuan Modulasi Ekstrak Terhadap Efek Antibiotika Amoxicillin Terhadap S. aureus
Penentuan faktor modulasi dilakukan dengan membandingkan KHM dari amoxicillin dengan KHM amoxicillin yang dikombinasi dengan ekstrak bee pollen. Faktor modulasi (FM) dapat dihitung dengan rumus sbb (Lechner et al., 2008):
𝐹𝑀 = KHM (antibiotika) KHM (antibiotika + ekstrak)
dengan mengetahui faktor modulasi tersebut, maka dapat diketahui kekuatan modulasi berapa kali efeknya dibanding antibiotika sendiri.
18
III.7 Pengumpulan dan Analisis Data
Data yang didapatkan berupa angka dari hasil perhitungan faktor modulasi kemudian dilakukan proses analisis.
19
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil Ekstraksi dan Hasil Analisis Kadar Polifenol
Hasil ekstraksi Bee pollen sebanyak 209,7 g bahan/simplisia yang diekstraksi dengan etanol 96% dan hasil analisis kadar polifenol ekstrak dengan menggunakan asam gallat sebagai baku standar diperoleh hasil seperti terlihat pada lampiran 7 gambar 3 dan tabel 1.
Tabel 1. Hasil ekstraksi dan rata-rata polifenol ekstrak bee pollen Konsistensi
Ekstrak
Rendemen (g)
Rendemen (%)
Rata- rata Polifenol (%)
Kental 0,09 9,00 0,71 ± 0,02
Hasil ekstraksi bee pollen memperlihatkan bahwa persen rendemen ekstrak bee pollen sebesar 9,00% dan hasil analisis kadar polifenol pada ekstrak bee pollen sebesar 0,71 ± 0,02%. Berdasarkan hasil penelitian Sartini dkk (2017) ekstrak bee pollen dengan menggunakan cairan penyari etanol 80% mengandung kadar total polifenol 1,199±0,013% dan hasil penelitian Emilia dkk (2017) kadar polifenol serbuk bee pollen yaitu sebesar 1,64%, berdasarkan hasil penelitian tersebut dapat dikatakan bahwa perbedaan larutan penyari pada bee pollendapat mempengaruhi kadar total polifenol.
Menurut Komosinska dkk (2015) beepollen mengandung 1,6% senyawa fenolik termasuk 1,4% flavonoid dan asam fenolat.
20
IV.2 Hasil Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Terhadap Staphylococcus aureus
IV.2.1 Hasil Penentuan KHM Ekstrak Bee pollen
Penentuan KHM ekstrak Bee pollen dilakukan pada konsentrasi 20 mg/mL, 10 mg/mL, 5 mg/mL dan 2,5 mg/mL dengan metode dilusi cair.
Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 7 gambar 4 dan tabel 2.
Tabel 2. Hasil penentuan KHM ekstrak bee pollen
NO Konsentrasi
(mg/mL) Hasil
1 20 -
2 10 -
3 5 -
4 2,5 +
Keterangan: (-) Tidak ada pertumbuhan bakteri; (+) Ada pertumbuhan bakteri
Berdasarkan hasil pengamatan penentuan KHM ekstrak bee pollen pada konsentrasi 20 mg/mL, 10 mg/mL dan 5 mg/mL menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri, dapat dilihat dari kondisi media yang tidak keruh. Konsentrasi 2,5 mg/mL menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri, dapat dilihat dari tingkat kekeruhan pada media. Hal ini menunjukkan bahwa Konsentrasi Hambat Minimum dari ekstrak bee pollen terhadap bakteri S. aureus adalah 5 mg/mL. Hasil penelitian Sartini, dkk (2017) memperoleh 5 mg/mL sebagai nilai KHM ekstrak bee pollen dengan menggunakan cairan penyari etanol 80% dan metode mikrodilusi dan hasil peneletian yang dilakukan Mohdaly, dkk (2015) memeroleh 0,78 mg/mL sebagai nilai KHM ekstrak bee pollen dengan menggunakan cairan penyari metanol dan metode mikrodilusi. Berdasarkan acuan tersebut dapat dikatakan bahwa
21
perbedaan jenis bee pollen, cairan penyari dan metode pengujian mempengaruhi nilai KHM ekstrak.
IV.2.2 Hasil Penentuan KHM Amoxicillin
Penentuan KHM Amoxicillin dilakukan dengan konsentrasi 16 µg/mL, 8 µg/mL, 4 µg/mL, 2 µg/mL, 1 µg/mLdan 0,5 µg/mLmenngunakan metode dilusi cair. Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 7 gambar 5 dan tabel 3.
Tabel 3. Hasil penentuan KHM Amoxicillin
NO Konsentrasi
(µg/mL) Hasil
1 16 -
2 8 -
3 4 -
4 2 +
5 1 +
6 0,5 +
Keterangan: (-) Tidak ada pertumbuhan bakteri; (+) Ada pertumbuhan bakteri
Berdasarkan hasil pengamatan penentuan KHM amoxicillin pada konsentrasi 16 µg/mL, 8 µg/mL, 4 µg/mL menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri, dapat dilihat dari kondisi media yang tidak keruh dan sesuai dengan kontrol positif. Konsentrasi 2 µg/mL, 1 µg/mL dan 0,5 µg/mL menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri, dapat dilihat dari tingkat kekeruhan pada media. Hal ini menunjukkan bahwa Konsentrasi Hambat Minimum dari amoxicillin terhadap bakteri Staphylococcus aureus adalah 4 mg/L. Menurut CLSI (2017) pada tabel 4, standar interpretasi KHM antibiotika golongan penisillin dikatakan resisten terhadap bakteri Staphylococcus aureus apabila Konsentrasi Hambat Minimun (KHM)
≥0,25 µg/mL. Jadi dapat disimpulkan bahwa, bakteri Staphylococcus aureus
22
telah mengalami resistensi terhadap antibiotika amoxicillin karena KHM pada penelitian ini 4 µg/mL.
Tabel 4.Standar interpretasi konsentrasi hambat minimum untuk bakteri Staphylococcus sp.
Antibiotika Konsentrasi Hambat Minimum (µg/mL)
S I R
Penicillin ≤0,12 - ≥0,25
(Sumber: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 2017) Keterangan: S =Sensitif; I =Kurang sensitif (Menengah); R = Resisten
IV.2.3 Hasil Penentuan KHM Amoxicillin Yang Dikombinasi Ekstrak Bee Pollen dan Faktor Modulasi Terhadap S. aureus
Penentuan KHM dari amoxicillin yang dikombinasi dengan ekstrak bee pollen dilakukan dengan metode dilusi cair. Konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah seperempat dan seperdelapan dari nilai KHM yaitu 1,25 mg/mL dan 0,625 mg/mL sehingga konsentrasi yang digunakan tidak berefek sebagai antimikroba. Konsentrasi amoxicillin yang digunakan merupakan variasi konsentrasi dibawah nilai KHM sehingga tidak memiliki aktivitas antibakteri yaitu 2 µg/mL, 1 µg/mL, 0,5 µg/mL, 0,25 µg/mLdan 0,125 µg/mL Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 7 gambar 6 dan 7 dan tabel 5, 6 dan 7
Tabel 5. Hasil penentuan KHM amoxicillin kombinasi ekstrak bee pollen 1,25 mg/mL
NO Konsentrasi
(µg/mL)
Konsentrasi Ekstrak
(mg/mL) Hasil
1 2
1,25
-
2 1 -
3 0,5 +
4 0,25 +
5 0,125 +
Keterangan: (-) Tidak ada pertumbuhan bakteri; (+) Ada pertumbuhan bakteri
23
Tabel 6. Hasil penentuan KHM amoxicillin yang dikombinasi ekstrak bee pollen 0,625 mg/mL
No Konsentrasi
(µg/mL)
Konsentrasi Ekstrak
(mg/mL) Hasil
1 2
0,625
-
2 1 -
3 0,5 +
4 0,25 +
5 0,125 +
Keterangan:(-) Tidak ada pertumbuhan bakteri; (+) Ada pertumbuhan bakteri
Tabel 7. Hasil penentuan KHM amoxicillin yang dikombinasi ekstrak bee pollen dan faktor modulasi
No. Antibiotika + ekstrak Nilai KHM
(µg/mL) F. Modulasi
1 Amoxicillin + bee pollen 1.25 mg/mL 1 4
2 Amoxicillin + bee pollen 0.625 mg/mL 1 4
Dari hasil pengamatan penentuan KHM amoksisilin yang dikombinasi ekstrak bee pollen pada konsentrasi 2 µg/mL dan 1 µg/mL baik pada konsentrasi ekstrak 1,25 mg/mL maupun 0,625 mg/mL menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri, dapat dilihat dari kondisi media yang tidak keruh dan sesuai dengan kontrol positif. Konsentrasi 0,5 µg/mL, 0,25 µg/mL, dan 0,125 µg/mL menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri, dapat dilihat dari tingkat kekeruhan pada media. Hal ini menunjukkan bahwa KHM dari
amoxicillin terhadap bakteri Staphylococcus aureus adalah 1 µg/mL. Berdasarkan pengamatan tersebut menunjukkan adanya
peningkatan aktivitas antibakteri dari amoxicillin yang sebelum dikombinasi KHM nya 4 µg/mL dan setelah dikombinasi dengan ekstrak bee pollen terhadap bakteri S. aureus KHM nya menjadi 1 µg/ml.
24
Penentuan faktor modulasi ekstrak terhadap efek antibiotika amoxicillin nterhadap bakteri S. aureus dilakukan dengan membandingkan nilai KHM amoxicillin tunggal dan nilai KHM amoxicillin yang telah dikombinasi ekstrak bee pollen. Berdasarkan hasil perhitungan faktor modulasi, di dapatkan peningkatan aktivitas antibakteri amoxicillin setelah dikombinasi yaitu 4 kali efeknya dibandingkan amoxicillin tunggal. Sehingga, dapat dikatakan bahwa ekstrak bee pollen mampu meningkatkan aktivitas antibakteri dari amoxicillin terhadap S. aureus. Hal ini ditunjang oleh beberapa penelitian yang menggunakan bahan alam sebagai modulator sehingga dapat meningkatkan aktivitas antibakteri yaitu, hasil penelitian Blesson dkk (2015) menunjukkan bahwa efek gentamisin meningkat hingga 10 kali lipat bila dikombinasi talas untuk melawan MRSA, penelitian Hanan dkk (2012) menunjukkan bahwa minyak lemon memiliki aktivitas sinergis yang signifikan dengan antibiotika amoksisilin terhadap bakteri MRSA, penelitian Braga dkk (2005) menunjukkan bahwa kombinasi ekstrak etanol Punica gratum dengan antibiotika ampisilin mengurangi viabilitas sel bakteri sehingga meningkatkan onset antibiotika dari 3 jam menjadi 7 jam terhadap bakteri MRSA.
Staphylococcus aureus memiliki beberapa mekanisme resistensi, salah satunya adalah efflux pump (Cells et al., 2002). Pompa efflux yang dimiliki S. aureus berfungsi untuk melindungi bakteri dari efek toksik bahan kimia organik (Ughachukwu and Unekwe, 2012) sehingga dibutuhkan Efflux Pump Inhibitors (EPIs) yang merupakan agen terapetik yang dapat mengembalikan aktivitas antibiotika. Kombinasi inhibitor pompa efflux
25
diharapkan dapat meningkatkan konsentrasi antibiotika di dalam sel yang dikeluarkan oleh pompa efflux, mengurangi resistensi bakteri intrinsik terhadap antibiotika, membalikkan resistensi akibat pompa eflux yang terlalu banyak mengekspresikan, dan mengurangi frekuensi munculnya resistensi (Mohdaly et al., 2015). Flavonoid merupakan salah satu senyawa yang dapat berperan sebagai Efflux Pump Inhibitors (EPIs) (Ughachukwu and Unekwe, 2012). Bee pollen mengandung senyawa flavonoid (Komosinska-Vassev et al., 2015) sehingga diduga bahwa bee pollen dapat berperan sebagai Efflux Pump Inhibitors dengan mekanisme kerja meningkatkan masuknya antibiotika ke dalam membran sel yang kemudian meningkatkan konsentrasi obat di dalam sel (Handzlik et al, 2013).
26
BAB V PENUTUP
V.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa Ekstrak bee pollen dengan kosentrasi 1,25 mg/mL dan 0,625 mg/mL mampu memodulasi efek antibakteri dari amoxicillin terhadap S. aureus dengan kekuatan amoksisilin yang dikombinasi dengan ekstrak bee pollen 4 kali efeknya dibandingkan amoxicillin sendiri.
V.2 Saran
Saran untuk penelitian selanjutnya adalah dibuat sediaan foodsupplement sebagai terapi pendukung pasien yang diberi terapi amoxicillin dan diuji secara klinis.
27
DAFTAR PUSTAKA
Abd El-Kalek, H.H., dan Mohamed, E.A., 2012. Synergistic Effect Of Certain Medicinal Plants And Amoxicillin Against Some Clinical Isolates Of Methicillin – Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Int J Pharm Appl. 3(3):976–2639.
Abouda, Z., Zerdani, I., Kalalou, I., Faid, M., dan Ahami, M.T. 2011. The Antibacterial Activity of Moroccan Bee Bread and Bee-Pollen (Fresh and Dried) against Pathogenic Bacteria Vol. 6. Research Journal of Microbiology. p. 376–84.
Aiyegoro, O., dan Okoh, I. 2009. ‘Use of bioactive plant products in combination with standard antibiotics : Implications in antimicrobial chemotherapy’. Journal of Medicinal Plants Research. 3(13) : 1147–1152.
Ashnagar, A., dan Naseri, N.G. 2007. ‘Analysis of Three Penicillin Antibiotics (Ampicillin, Amoxicillin and Cloxacillin) of Several Iranian Pharmaceutical Companies by HPLC’. E-Journal of Chemistry.
4(4): 536–545.
Anonim, Farmakope Indonesia. Edisi IV. 1995. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.
Article, R., 2012. ‘Mechanisms of Antimicrobial Resistance in Bacteria.
General Approach’. 1(2): 166–187.
Balouiri, M., Sadiki, M., dan Ibnsouda, S.K. 2016. ‘Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review’. Journal of Pharmaceutical Analysis. Elsevier. 6(2): 71–79.
Boukraâ, L., Abdellah, F., dan Ait-Abderrahim, L. 2013. ‘Antimicrobial Properties of Bee Products and Medicinal Plants’. Formatex (Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education). pp. 960–970.
Blesson, J., Saji, C.V., Nivya, R.M., dan Kumar, R. 2015. Synergistic antibacterial activity of natural plant extracts and antibiotics against methicillin resistant Staphylococcus aureus ( MRSA ).
World J Pharm Pharm Sci. 4(3): 741–63.
Braga, L.C., Leite, A.A., Xavier, K.G., Takahashi, J.A., Bemquerer, M.P., Chartone-Souza E., dan Nascimento, A.M. 2005. Synergic interaction between pomegranate extract and antibiotics against Staphylococcus aureus. Canadian journal of microbiology.
1;51(7): 541-7.
28
Carboneau, C., Benge, E., Jaco, M.T., dan Robinson, M. 2010. A lean six sigma team increases hand hygiene compliance and reduces hospital-acquired MRSA infections by 51%. Journal for Healthcare Quality.32: 61-70.
Carpes, S.T., Begnini, R., Matias De Alencar, S., dan Masson, M.L. 1818.
Study Of Preparations Of Bee Pollen Extracts, Antioxidant And Antibacterial Activity Estudo das preparações de extratos de pólen apícola, atividade antioxidante e antibacteriana. Ciênc agrotec Lavras. 31(6):1818–25.
Cells, H., Harris, L.G., Foster, S.J., Richards, R.G., dan Harris, L. 2002. An Introduction To Staphylococcus Aureus , And Techniques For Identifying And Quantifying S . Aureus Adhesins In Relation To Adhesion To Biomaterials. 4:39–60.
Cushnie, T.P.T., dan Lamb, A.J. 2005. ‘Antimicrobial activity of flavonoids’, International Journal of Antimicrobial Agents. 26(5): 343–356.
Deurenberg, R.H., Vink, C., Kalenic, S., Friedrich, A.W., Bruggeman, C.A., dan Stobberingh, E.E. 2007. The molecular evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology and Infection. 13: 222-235.
Djide, M.N., Sartini. 2014. Dasar-Dasar Mikrobiologi Farmasi. Makassar : Penerbit Lembaga Penerbitan Universitas Hasanuddin.
Utomo, E., Saidah, L.N., dan Utami, I.F. 2017. Potensi Kapsul Bee Pollen Plus Sebagai Food Supplement Inovatif Peningkat Stamina dalam Rangka Pencegahan Penggunaan Doping pada Atlet Makassar : Uji Coba Pada Mahasiswa UKM Sepak Bola. 1(1): 9–
15.
Greenwood, D. 2008. Antimicrobial Drugs: Chronicle of a Twentieth Century Medical Triumph. New York, NY: Oxford University Press. 85- 139.
Hajková, Z., Toman, R., Hluchý, S., Gálik, B., Bíro, D., Martiniaková, M., Omelka, R., dan Boboňová, I. 2013. ‘The Effect of Pollen on the Structure of the Small Intestine in Rats after an Experimental Addition in Diet.’ Scientific Papers: Animal Science &
Biotechnologies / Lucrari Stiintifice. Zootehnie si Biotehnologii.
46(1): 232–237.
Handzlik, J., Matys, A., dan Kieć-Kononowicz, K. 2013. ‘Recent Advances in Multi-Drug Resistance (MDR) Efflux Pump Inhibitors of Gram- Positive Bacteria S. aureus’. Antibiotics. 2(1): 28–45.
29
Jayaprakasha, G., Jaganmohanrao, L., dan Sakariah, K. 2005. ‘Chemistry and biological activities of’, Trends in Food Science &
Technology. 16(12): 533–548.
Joshi, L.R., dan Devkota, S.P. 2014. ‘Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) in Cattle: Epidemiology and Zoonotic Implications’. International Journal of Applied Sciences and Biotechnology. 2(1).
Kacániová, M., Vuković, N., Chlebo, R., Haščík, P., Rovná, K., dan Cubon J.
2012. The antimicrobial activity of honey, bee pollen loads and beeswax from Slovakia. Arch Biol Sci. 64(3): 927–34.
Kaur, S.P., Rao, R., dan Nanda, S. 2011. ‘Amoxicillin: A broad spectrum antibiotic’, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3(3): 30–37.
Komosinska-Vassev, K., Olczyk, P., Kazmierczak, J., Mencner, L., Olczyk, K.
2015. Bee pollen: chemical composition and therapeutic application. Evidence-Based Complement Altern.1–6.
Lechner, D., Gibbons, S., Bucar, F. 2008. Plant phenolic compounds as ethidium bromide efflux inhibitors in Mycobacterium smegmatis.
Journal of Antimicrobial Chemotherapy. London. Pp: 345-348.
Mohdaly, A.A.A., Mahmoud, A.A., Roby, M.H.H., Smetanska, I., Ramadan, M.F. 2015. Phenolic Extract from Propolis and Bee Pollen:
Composition, Antioxidant and Antibacterial Activities. J Food Biochem. 39(5): 538–47.
Almaraz-Abarca, N.M.D.G., Campos, J.A., Avila-Reyes, N., Naranjo- Jim´enez, J., Herrera-Corral, dan Gonz´alez-Valdez, L.S. 2004.
“Variability of antioxidant activity among honeybee-collected pollen of different botanical origin,” Interciencia. 574–578.
Nair,R., Hanson B.M., Kondratowicz, K., Dorjpurev, A., Davaadash, B., Enkhtuya, B., Tundev, O., dan Smith, C.T. 2013. ‘Antimicrobial resistance and molecular epidemiology of Staphylococcus aureus from Ulaanbaatar, Mongolia’. PeerJ. 1: 176.
Patel, B.J., Robin, P., Melvin, W.P., Sandra, S.R., Eliopoulos, M.G., dan Michael, S.M.D. 2017. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.
Permenkes. 2011. ‘Pedoman umum penggunaan antibiotik’. Pp: 1–66.
Prescott H. 2002. Laboratory exercises in microbiology. Lab Exerc Microbiol;117–24.
30
Reygaert, W.C. 2013. ‘Antimicrobial resistance mechanisms of Staphylococcus aureus’, Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education. Pp: 297–
305.
Sartini, Djide, N., dan Nainu, F. 2017. Laporan Penelitian Potensi Ekstrak Kaya Polifenol Dalam Memodulasi Aktivitas Antibakteri Beberapa Antibiotika Terhadap Methicilin Resistance Staphylococcus Aureus (MRSA). LP2M Universitas Hasanuddin. Makassar.
Tandari, A.D. 2016. ‘Pola resistensi bakteri terhadap antibiotik pada penderita infeksi saluran kemih (isk) di rumah sakit x periode januari 2013–september 2015’.
Ughachukwu, P. dan Unekwe, P. 2012. ‘Efflux pump-mediated resistance in chemotherapy’, Annals of Medical and Health Sciences Research. 2(2): 191.
Valgas, C., Machado, S.A., Smânia, E.F., Smânia, J.A. 2007. Screening Methods To Determine Antibacterial Activity of Natural Products.
Brazilian J Microbiol. 38:369–80.
WHO, 2014. ‘Antimicrobial resistance. Global Report on Surveillance’.
Bulletin of the World Health Organization. 61(3): 383–94.
31 Lampiran 1 Skema Kerja
- Diekstraksi sampel
Dengan menggunakan etanol 96% (1:10) - Dimaserasi selama 72 jam
- Diuapkan
Amoxicillin Ekstrak Kental
- Dibuat larutan stok Amoxicillin 160 µg/mL dan dibuat konsentrasi 80, 40, 20, 10 dan 5 µg/mL. Dipipet 1 mL dan dimasukkan ke dalam 9 mL medium MHB sehingga konsentrasi dalam medium 16, 8, 4, 2, 1, dan 0,5 µg/mL.
- Diinokulasikan bakteri S.aureus - Di inkubasi 1 x 24 jam, 37°C - Diamati
- Uji Kadar total polifenol
- Dibuat larutan stok ekstrak 20 mg/ml
- Dipipet 2,5, 1,25 dan 0,625 mL dimasukkan ke dalam 2,5, 3,75 dan 4,375 mL medium MHB sehingga konsentrasi dalam medium 10, 5 dan 2,5 mg/mL - Diinokulasikanbakteri S.aureus - Di inkubasi 1 x 24 jam, 37°C - Diamati
Nilai KHM Amoxicillin terhadap
S. aureus Nilai KHM
Ekstrak Bee pollen terhadap S. aureus
- Uji KHM kombinasi Ekstrak Bee pollen seperempat dan seperdelapan nilai KHM dan beberapa variasi konsentrasi amoksisilin terhadap S.aureus
Nilai KHM
Kombinasi Ekstrak Bee pollen dan Amoxicillin terhadap S. aureus
Faktor Modulasi
Pembahasan Kesimpulan
Sampel Bee pollen
32 Lampiran 2
Skema Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum Ekstrak Bee pollen
Ekstrak 20 mg/mL
Ekstrak 10 mg/mL
Ekstrak 5 mg/mL
Ekstrak 2,5 mg/mL 2,5 mL ekstrak
+
2,5 mL MHB 1,25 mL ekstrak
+ 3,75 mL MHB
0,625 mL ekstrak +
4,375 mL MHB
Diinokulasi 1 Ose s.aureus
Inkubasi 1 x 24 jam
Ekstrak bee pollen 200 mg 5 mL DMSO + 5 mL MHB
33 Lampiran 3
Skema Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum Amoxicillin
Amoxicillin
16 mg
160 µg/ml
Cukupkan hingga 100 mL air suling steril
5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
160 µg/mL 80 µg/mL 40 µg/mL 20 µg/mL 10 µg/mL 5 µg/mL
Cukupkan hingga 10 mL air suling steril
16 µg/mL 8 µg/mL 4 µg/mL 2 µg/mL 1 µg/mL 0,5 µg/mL
Masing-masing konsentrasi dicuplik 1 mL
Tiap tabung berisi 9 mL media MHB
Diinokulasi 1 Ose s. aureus
Diinkubasi 1 x 24 jam
34 Lampiran 4
Skema Penentuan KHM Amoxicillin yang Dikombinasi Esktrak Bee Pollen terhadap Staphylococcus aureus.
Penyiapan stok antibiotika dan sampel
Ekstrak 5 mg/mL =
Ekstrak 2,5 mg/mL = Amoxicillin
16 mg
160 µg/mL
Cukupkan hingga 100 mL air suling steril
16 µg/mL 10 mL
Bee pollen
50 mg
10 mL DMSO
Bee pollen
25 mg
10 mL DMSO
35
Amoxicillin 16 µg/mL
Ekstrak 5 mg/mL Ekstrak 2,5 mg/mL
2,5 mL Amoxicillin +
2,5 mL ekstrak + 5 mL MHB
2,5 mL Amoxicillin +
2,5 mL ekstrak + 5 mL MHB Amoxicillin 4 µg/mL
Esktrak 1,25 mg/mL
Amoxicillin µg/mL Esktrak 0,625 mg/mL
5 mL 5 mL
2 µg/mL 1 µg/mL 0,5 µg/mL 0,25 µg/mL 0,125 mg/mL 2 µg/mL 1 µg/mL 0,5 µg/mL 0,25 µg/mL
0,125 µg/mL Masing-masing berisi 5 mL MHB
Diinokulasi 1 ose S. aureus
Diinkubasi 1 x 24 jam
36 Lampiran 5
Perhitungan Faktor modulasi
Diketahui: KHM Amoxicillin = 4 µg/mL
1. KHM Amoxicillin + ekstrak bee pollen 1,25 mg/mL = 1 µg/mL 𝐹𝑀 = KHM (antibiotika)
KHM (antibiotika + ekstrak) 𝐹𝑀 =4 µg/mL
1 µg/mL
= 4
. 2. KHM Amoxicillin + ekstrak bee pollen 0,625 mg/mL = 1 µg/mL 𝐹𝑀 = KHM (antibiotika)
KHM (antibiotika + ekstrak) 𝐹𝑀 =4 µg/mL
1 µg/mL
= 4
37 Lampiran 6
Perhitungan Kadar Total Polifenol 1. Kurva Baku Asam Galat
Konsentrasi (bpj) Absorbansi
1,5 0.064
3 0.154
5 0.312
7 0.442
10 0.612
15 0.958
2. Kadar Total Polifenol Ekstrak Bee pollen
Konsentrasi
(bpj) Absorbansi Kadar Total Polifenol (mg/g EAG)
Kadar Total Polifenol
(%)
6,832 0,422 6,832± 0,2 0,6832± 0, 02
7,277 0,450 7,277± 0,2 0,7277± 0, 02
7,228 0,447 7,228± 0,2 0,7228± 0, 02
Rata-rata 7,112 ± 0,2 0,7112 ± 0,02
Contoh perhitungan kadar polifenol
Ekivalen asam galat = X x Fp x V.awal sampel yang ditimbang
=(6,832x 10
−3mg
mL)x 10 x 10 mL 0,1
= 6,832mg/g EAG
% (b/b) = 0,006832 g x 100% = 0,6832%
0.064 0.154
0.312
0.442
0.612
0.958
y = 0.0659x - 0.0322 R² = 0.9986
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Absorbansi
Konsentrasi
Kurva Baku
38 Lampiran 7 Dokumentasi Kegiatan
Gambar 4. Hasil Pengamatan Penentuan KHM Ekstrak Bee pollen terhadap S. aureus (A. 20 mg/mL, B.10 mg/mL, C. 5mg/mL, D. 2,5 mg/mL, E. Kontrol positif (media+bakteri), F. Kontrol negatif (media+ekstrak), G. Kontrol blanko (media+DMSO).
A B C
D E F
G
Gambar 3. Ekstrak Etanol Bee pollen
39
A B C
D E F
G H
Gambar 5. Hasil Pengamatan Penentuan KHM Amoksisilin terhadap S. aureus (Keterangan:
A: 16 µg/mL, B: 8 µg/mL, C: 4 µg/mL, D: 2 µg/mL, E: 1 µg/mL, F: 0,5 µg/mL, G: Kontrol positif (media+bakteri), dan Kontrol negatif (media+ekstrak), H: Kontrol blanko (media+DMSO)
40
A B C
D E
C
Gambar 6. Hasil Pengamatan Penentuan KHM Amoxicillin yang Dikombinasi Ekstrak Bee pollen 1,25 mg/mL terhadap S. aureus (A. 2 µg/mL, B.1 µg/mL, C. 0,5 µg/mL, D. 0,25 µg/mL, E.
0,125 µg/mL).
A B C
D E
C
Gambar 7. Hasil Pengamatan Penentuan KHM Amoxicillin yang Dikombinasi Ekstrak Bee pollen 0,625 mg/mL terhadap S. aureus (A. 2 µg/mL, B.1 µg/mL, C. 0,5 µg/mL, D. 0,25 µg/mL, E. 0,125 µg/mL).
41
Gambar 8. Isolat Bakteri S. aureus ATCC 33592
Gambar 9. Suspensi Bakteri S. aureus Sesuai Kekeruhan Mc Farland 0,5
42
Lampiran 8 Komposisi Medium
Media Mueller Hinton Broth (MHB)
Beef, InfusionFrom 300 g
Bacto Casamino Acids, Technical 17,5 g Bacto Soluble Strach 1,5 g
