M aksum Radji
Labor ator ium M ikr obiologi dan Bioteknologi
Depar temen Far masi, FM IPA-UI, Kampus UI Depok 1 6 4 2 4
Pendahuluan
Tanaman, telah lama kita ketahui merupakan salah satu sumber daya yang sangat penting dalam upaya p eng o batan d an up ay a memp er-tahankan kesehatan masy arakat. Bahkan sampai saat inipun menurut perkiraan bad an kesehatan d unia (WHO), 80% penduduk dunia masih m eng g antung kan d iriny a p ad a p engo batan trad isio nal termasuk penggunaan obat yang berasal dari tanaman. Sampai saat ini seperempat dari obat-obat modern yang beredar
PERAN AN BIO TEKN O LO GI
DAN M IKRO BA EN DO FIT
DALAM PEN GEM BAN GAN O BAT HERBAL
ABSTRACT
Plants have been the chief source of compounds of medicine for thousand of years. Plants are also the source of many medicines for the majority of the world’ s popula-tion. The role of biotechnology is very important for multiplying, conserving the spesies, and enhancing the production of secondary metabolites. Endophytes are microbes that inhabit plants are currently considered to be a wellspring of novel secondary metabolites offering the potensial for medical and industrial exploitation. Natural products from various endophytic microbes have been investigated. Some examples of natural products observed from endophytic microbes are antibiotics, anti-viral compounds, anticancers, antimalarial compounds, antioxidants, antidiabetics, and immunosuppressive compounds.
Key words : secondary metabolites, endophytes, genetic engineering, tissue cultures.
di dunia berasal dari bahan aktif yang d iiso lasi d an d ikembangkan d ari tanaman. Sebagai contoh misalnya aspirin adalah analgesik yang paling popular yang diisolasi dari tanaman Salix d an Spiraea, d emikian p ula paclitaxel dan vinblastine merupakan obat antikanker yang sangat poten-sial y ang berasal d ari tanam an (Pezzuto J, 1996).
o bat herbal y ang berbasis p ad a tanaman obat kita sendiri. Lebih dari 1000 sp esies tum buhan d ap at dimanfaatkan sebagai bahan baku obat. Tumbuhan tersebut menghasil-kan m etabo lit sekund er d eng an struktur m o lekul d an aktiv itas biologik yang beraneka ragam, me-miliki potensi yang sangat baik untuk d ikembangkan menjad i o bat ber-bagai penyakit.
Permasalahannya adalah bagai-mana menjaga tingkat produksi obat herbal tersebut dengan bahan baku o bat herbal yang terbatas karena sebag ian besar bahan baku o bat herbal diambil dari tanaman induk-nya. Sehingga dihaw atirkan bahw a sumberdaya hayati ini akan musnah disebabkan karena adanya kendala d alam bud id ayanya. Bahkan d isi-nyalir bahwa bahan obat herbal yang diproduksi dan diedarkan di Indo-nesia saat ini sebagian besar bahan bakunya sudah mulai diimpor dari beberapa negara lain.
Peranan bio tekno lo g i d alam bud id aya, multip likasi, rekayasa g enetika, d an skrining m ikro ba end o fit yang d apat menghasilkan metabolit sekunder sangat penting dalam rangka pengembangan bahan obat yang berasal dari tanaman obat ini. Bahkan dengan kemajuan yang pesat dalam bidang bioteknologi ini telah dapat dihasilkan beberapa jenis tanaman transg enik y ang d ap at mempro d uksi vaksin reko mbinan (Maksum R. 2004).
Dalam tinjauan pustaka ini akan dibahas tentang perkembangan dan
pemanfaatan teknik-teknik biotek-no lo g i antara lain sep erti teknik kultur jaringan, in-vitro pro pagsi, rekayasa genetika, d an peran mi-kroba endofit dalam meningkatkan pro d uksi metabo lit sekund er d ari berbagai tanaman obat tersebut.
Kultur Jaringan
Tumbuhan memiliki sifat totipo-tency, artinya perkembangbiakannya tidak hanya dari sel telur atau sperma saja akan tetapi juga bisa berasal dari sel-sel akar, daun, batang, dan sel tumbuhan lainnya.
Bila kita menggunakan sebuah sel yang berasal dari tumbuhan maka bad an tumbuhan keseluruhannya dapat ditumbuhkan kembali. Karena adanya sifat inilah, dengan teknik-teknik y ang telah lam a d ikenal seperti setek, okulasi, cangkok, serta d eng an m eto d e kultur jaring an, perbanyakan klon tumbuhan dapat dilakukan tanpa batas.
seperti Cinchona ledgeriana, D igitalis spp, Rehmania glutinosa, Rauwolfia serpentina, Isoplexis canariensis, dll. (Paek,KY.et.al.1995, Ro y SK.,et.al. 1994., Perez BP., et.al. 2002).
Penambahan senyawa auxin dan cytokinin dalam media perbenihan kultur jaring an terny ata mamp u mempercepat multiplikasi sel jaringan beberap a tum buhan o bat (Ro ut Gr,et.al. 1999, Tsay HS, et.al. 1989). Dem ikian p ula p enam bahan 6-benxy lamino p urine (BA ) d eng an konsentrasi tinggi (1-5 ppm), dapat mempercepat petumbuhan jaringan meristem d an meningkatkan pro -duksi alkaloid dari A tropa belladonna (Benyamin BD., et.al. 1987). Penam-bahan 1-5 mg/ l kinetin mampu me-ningkatkan proliferasi sel Picorrhiza kurroa (Lai N.,et.al. 1996), dan Plan-tago ov ata (Barna KS.et.al.1988), sed ang kan p enam bahan 2,2 uM thid iaz uro n d ap at memp ercep at proliferasi sel Nothapodytes foetida (Rai V R et.al. 2002). Dem ikian p ula dengan penambahan 5 uM indole-3-acetic acid (IAA), dapat meningkat-kan kecep atan tum buh d ari sel jaringan Zingiber spp. (Faria RT.1995). Ind uksi p ertum buhan callus dengan berbagai jenis zat yang ber-sifat sebagai regulator pertumbuhan yang dimasukkan ke dalam medium pertumbuhannya juga telah banyak dilakukan. Penambahan auxin dan cytokinin dalam jumlah yang tepat terbukti dapat meningkatkan rege-nerasi kultur dari callusPlumbago rosea (Satheesh KK., et.al. 1988), d an regenerasi callus ini telah berhasil
dilakukan dari berbagai tambuhan o bat y ang berasal d ari berbag ai eksplan tumbuhan misalnya callus yang berasal dari daun, cabang, akar, umbi, bunga, dan bagian lainnya dari tumbuhan. Beberap a d iantaranya adalah regenerasi callus Hyoscyamus mutius (Basu P. et.el. 1996), Solanum melongena (Sharma P.,et.al. 1995), Chephaelis ipecacuanha (Rout GR.et.al. 1992), Psoralea cory lifolia (Saxena C.et.al. 1997), Zingiber officinale (Rout GR, et.al.1997), M entha arv ensis (Shasany A K.,et.al. 1998), Centella asiatica ( Patra A., et.al. 1998), Plum-bago Zeylanica (Rout GR., et.al. 1999), Solanum laciniatum ( Okslar V., et.al. 2002), Echinacea pallida ( Koroch AR., et.al. 2003), d an Lepidium sativum (Pande D., et.al. 2002).
Disamping regenerasi melalui sel callus, regenerasi tumbuhan o bat melalui somatic embry ogenesis juga telah banyak dilakukan. Teknik ini merupakan suatu proses dimana sel somatik yang diambil dari jaringan tumbuhan dapat diinduksi menjadi embrio dan dapat tumbuh menjadi tanaman utuh di dalam media per-benihan yang sesuai. Dalam berbagai p erco baan y ang telah d ilakukan p eng aturan z at tumbuh atau z at suplemen lainnya dapat mengatur p ercep atan d ari em bry o g enesis tersebut untuk tujuan p embud i-dayaan tanaman obat (A rumugam N.et.al. 1990, Ghosh BE., et.al. 1991., Z hou J.,et.al. 1994., Rout GR.,et.al. 1995., Das P.,et.al. 1999., Kumar A., 1992).
obat yang telah didapat melalui re-generasi secara in vitro ini d apat disimpan dalam w aktu yang lama pada temperatur rendah dalam nitro-gen cair (-1960 C). Beberapa tanaman
obat telah dilakukan preservasinya dengan cara pembekuan sel kultur-nya antara lain tanaman obat yang menghasilkan alkaloid yang sangat penting seperti Rauwollfia serpentina, D igitalis lanata, A tropa belladonna, Hyoscyamus spp, dll. Sistem preservasi beku (cry opreserv ation) ini d ap at d igunakan untuk tujuan penyim-panan berbagai jenis sel/ jaringan, meristem, p o llen, embrio , callus, ataupun protoplas, sehingga sangat bermanfaat untuk konservasi tana-man obat (Tripathi L.,et.al. 2003).
M etabolit sekunder
Tanaman obat merupakan salah satu sumber bahan baku obat. Seba-gian besar ko mpo nen kimia yang berasal dari tamanan yang diguna-kan sebagai o bat atau bahan o bat adalah merupakan metobolit sekun-der. Secara in vitro produksi meta-bolit sekunder ini dapat dilakukan dengan teknik kultur jaringan (Deus B., et.al. 1982., Stafford A, 1986).
Pro d uksi metabo lit sekund er beberapa tanaman obat melalui kul-tur jaringan telah banyak dilakukan. Beberapa diantaranya adalah pro -duksi solasodine yang diisolasi dari kultur callus Solanum eleagnifolium (Nigra HM., et.al.1987) dan alkaloid pyrrolidine dari kultur akar tanaman Senecio spp. (Toppel G.,et.al. 1987).
Alkaloid cephaelin dan emetine dapat diisolasi dari kultur callus tanaman Cephaelis ipecacuanha (Jha S.,et.al. 1988). Demikian juga dengan alka-loid-alkoloid penting lainnya seperti quinoline disolasi dari kultur jaringan Cinchona ledgeriana, diosgenin dari kultur jaringan D ioscorea deltoidea (Rav ishankar GA .,et.al. 1991), beberap a enz im p ro teo litik d ari kultur jaringan A llium sativum (Parisi M.,et.al.2002), alkaloid cardenolide dari kultur Digitalis lanata (Pradel H., et.al.1997), alkaloid azadirachtin dari kultur jaringan A zadirachta indica (Srividya N., et.al 1998) dan lepidine dari kultur jaringan tanaman Lepidium sativum (Pande D., et.al.2002).
d eng an cara-cara ko nv ensio nal d imana untuk mend apatkan 1 kg komponen aktif taxol harus mene-bang 1 pohon Taxus yang kira-kira telah berumur 100 tahun (Muhlbah H.,1998).
Rekayasa G enetika
Kemajuan yang telah d icap ai d alam bid ang bio tekno lo g i d an teknik DNA rekombinan telah mem-bantu mempercepat dan meningkat-kan berbagai penelitian menuju ke arah pemahaman tentang biosintesis dari metabo lit sekunder. Berbagai penelitian telah berhasil mengiden-tifikasi beberapa enzim yang ber-p eran ber-p enting d alam jalan meta-bolisme, dan telah berhasil dilakukan rekayasa dan manipulasi terhadap enz im -enz im tersebut. Teknik rekayasa genetika dengan melakukan transformasi genetik telah dilakukan untuk memanipulasi lebih dari 120 jenis spesies dari sekitar 35 famili tanaman menggunakan perantara bakteri A grobacterium ataup un transfo rmasi langsung (Birch RG., 1997).
A grobacterium tumafaciens, dan A grobacterium rhizogenes, merupakan bakteri gram-negatif yang terdapat di dalam tanah yang menyebabkan tumor crown gall dan hairy root pada tanaman. Bakteri A grobacterium tumafaciens m eng and ung m eg a-p lasm id y ang bera-p eran a-p enting dalam induksi tumor tanaman yang diberi nama Ti plasmid. Selama proses infeksi, T-DN A yang merup akan
seg men p enting d ari Ti plasmid ditransfer ke dalam nukleus sel yang terinfeksi dan terintegrasi ke dalam kro mo so m ho spesnya. Sed angkan bakteri A . rhizogenes d apat meng-induksi proliferasi multibranched di tempat akar yang terinfeksi sehingga disebut dengan “ hairy root” . Melalui infeksi ini dapat ditransfer T-DNA yang dikenal dengan root inducing plasmid (Ri plasmid), dan kemudian dapat terintegrasi ke dalam kromo-som sel tanaman (Nester EW., et.al., 1984).
produksi artemisin sebesar 4.8 mg/ L, dari kultur sel A rtemisia annua L. (Cai G.,et.al.1995), d an d ap at mening katkan p ro d uksi alkalo id p uerarin d ari kultur sel Pueraria phaseoloides (Shi HP.,et.al. 2003). Berbagai jenis tanaman lain juga telah diteliti peningkatan kadar metabolit sekunder yang dihasilkannya melalui transformasi genetik dengan A gro-bacterium rhizogenes antara lain adalah terhadap kultur sel/ jaringan yang berasal d ari tanaman A conitum heterophy llum (Giri A .,et.al.1997), Digitalis lanata (Pradel H.,et.al. 1997), Papaver somniferum L. (Park SU.,et.al. 2000), dan Solanum aviculare (Argolo., et.al. 2000).
M ikroba Endofit
Mikroba endofit adalah mikroba y ang hid up d i d alam jaring an tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya. Setiap tanaman ting kat ting g i d ap at m eng and ung beberap a m ikro ba endofit yang mampu menghasilkan seny aw a bio lo g i atau m etabo lit sekunder yang diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik ( ge-netic recombination) d ari tanaman inangnya ke dalam mikroba endofit (Tan RX.,et.al. 2001).
Kemamp uan mikro ba end o fit memp ro d uksi senyaw a metabo lit sekund er sesuai d engan tanaman inangnya merupakan peluang yang
sangat besar dan dapat diandalkan untuk m em p ro d uksi m etabo lit sekunder dari mikroba endofit yang d iiso lasi d ari tanaman inang ny a tersebut. Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman mengan-dung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari bakteri dan jamur (Stro bel GA .,et.al. 2003). Sehingga apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman o bat d apat meng-hasilkan alkalo id atau metabo lit sekund er sama d eng an tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman aslinya untuk diambil sebagai simplisia, yang kemung kinan besar memerlukan puluhan tahun untuk dapat dipanen. Berbagai jenis endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya, dan telah berhasil dibiakkan dalam me-dia perbenihan yang sesuai. Demi-kian pula metabolit sekunder yang d ip ro d uksi o leh mikro ba end o fit tersebut telah berhasil diisolasi dan dimurnikan serta telah dielusidasi struktur m o lekulny a. Beberap a diantaranya adalah :
1. M ikro ba end o fit y ang menghasilkan antibiotika
d an Trichopy ton spp. (Stro bel GA .,et.al. 1999).
Beberapa zat aktif lain yang d iiso lasi d ari mikro ba end o fit misalnya ecomy cin d ipro d uksi oleh Pseudomonas viridiflava juga aktif terhad ap C ry ptococcus neoformans dan C.albicans. Eco-mycin merupakan lipo peptida y ang d isam p ing terd iri d ari molekul asam amino yang umum juga mengand ung ho mo serin dan beta-hidroksi asam arpartat (Miller RV., et.al. 1998), sedang-kan senyawa kimia yang dipro-d uksi o leh m ikro ba endipro-d o fit Pseudomonas Syringae yang ber-hasiat sebagai anti jamur adalah pseudomycin, yang dapat meng-hambat pertumbuhan Candida albicans d an Cry ptococcus neo-formans (H arriso n LD.,et.al. 1991).
Pestalotiopsis micrispora, m erup akan m ikro ba end o fit yang paling sering ditemukan di tanaman hutan lind ung d i seluruh dunia. Endofit ini meng-hasilkan m etabo lit sekund er ambuic acid yang berhasiat se-bagai antifungi (Li, JY., et al. 2001). Phomopsichalasin, merupa-kan metabolit yang diisolasi dari mikroba endofit Phomopsis spp. berhasiat sebagai anti bakteri Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Staphylococcos aureus, dan juga d ap at meng hambat p ertum -buhan jamur Candida tropicalis (Horn WS., et.al. 1995).
A ntibio tika bersp ektrum
luas yang disebut munumbicin, dihasilkan oleh endofit Strepto-myces spp. strain NRRL 30562 yang merupakan endofit yang diisolasi dari tanaman Kennedia nigriscans, d apat menghambat pertumbuhan Bacillus anthracis, dan M ycobacterium tuberculosis y ang m ultiresisten terhad ap berbagai obat anti tbc. (Castillo UF.et.al. 2002). Jenis end o fit lainnya yang juga menghasilkan antibio tika bersp aktrum luas ad alah mikro ba end o fit yang diisolasi dari tanaman Grevillea pteridifolia. End o fit ini meng-hasilkan metabolit kakadumycin. A ktifitas antibakterinya sama sep erti munumbicin D, d an kakadumycin ini juga berkhasiat sebagai anti malaria (Castillo UJ., et.al. 2003).
2. Mikroba endofit yang mem-produksi antivirus
Jamur endofit Cytonaema sp. Dapat menghasilkan metabolit cy tonic acid A d an B, y ang struktur malekulnya merupakan iso mer p-trid epsid e, berhasiat sebagai anti virus. Cytonic acid A dan B ini merupakan protease in-hibitor dan dapat menghambat pertumbuhan cytomegalovirus manusia. (Guo B.et.al. 2000).
3. M ikro ba end o fit y ang menghasilkan metabolit sebagai antikanker
sebagai antikanker yang pertama kali ditemukan yang diproduksi oleh mikroba endofit. Paclitaxel merupakan senyawa diterpenoid yang didapatkan dalam tanam-an Taxus. Senyaw a ytanam-ang dapat mempengaruhi molekul tubulin dalam proses pembelahan sel-sel kanker ini, umumnya diproduksi oleh endofit Pestalotiopsis micro-spora, yang diisolasi dari tanaman Taxus andreanae, T. brevifolia, dan T. wallichiana. Saat ini beberapa jenis endofit lainnya telah dapat diisolasi dari berbagai jenis Taxus dan didapatkan berbagai senya-w a yang berhasiat sebagai anti tumo r. Demikian p ula up aya untuk sintesisnya telah berhasil d ilakukan (Stro bel GA . Et.al. 2002).
4. Mikroba endofit penghasil zat anti malaria
Colletotrichum sp. merupakan endo fit yang diiso lasi dari ta-naman A rtemisia annua, meng-hasilkan metabolit artemisinin yang sangat po tensial sebagai anti malaria (Lu H., et.al. 2000). Disamping itu beberapa mikroba end o fit y ang d iiso lasi d ari tanaman C inchona spp, jug a mampu menghasilkan alkaloid cinchona yang dapat dikembang-kan sebagai sumber bahan baku obat anti malaria (Simanjuntak P., et.al. 2002).
5. Endofit yang memproduksi antioksidan
Pestacin d an iso p estacin merupakan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh endofit P. microspora. Endofit ini berhasil diisolasi dari tanaman Terminalia morobensis, yang tumbuh di Papua New Guinea. Baik pestacin atau-pun isopestacin berhasiat sebagai antioksidan, dimana aktivitas ini diduga karena struktur molekul-ny a m irip d eng an flav o no id (Strobel GA., et.al. 2002).
6. Endofit yang menghasilkan metabolit yang berkhasiat seba-gai antidiabetes
End o fit Pseudomassaria sp yang d iiso lasi d ari hutan lin-dung, menghasilkan metabolit sekunder yang bekerja seperti insulin. Seny aw a ini sang at menjanjikan karena tidak seba-gaimana insulin, senyaw a ini tidak rusak jika diberikan per-o ral. Dalam uji p raklinik terhad ap binatang co ba m em -buktikan bahw a aktiv itasnya sangat baik dalam menurunkan glukosa darah tikus yang diabe-tes. Hasil tersebut diperkirakan d ap at menjad i aw al d ari era terapi baru untuk mengatasi dia-betes dimasa mendatang (Zhang B. et.al.1999).
7. Endofit yang memproduksi senyawa imunosupresif
organ. Selain itu imunosupresif jug a d ap at d ig unakan untuk mengatasi penyakit autoimum seperti rematoid artritis dan in-sulin dependent diabetes. Senyawa subg lutino l A d an B y ang dihasilkan oleh endofit Fusarium subglutinans yang diisolasi dari tanaman T. wilfordii, merupakan senyaw a imuno sup resif yang sangat poten (Lee,J., et.al. 1995).
Penutup
Tanaman merup akan sumber bahan baku o bat yang tak ternilai harg any a, p erlu terus m enerus mend ap at p erhatian kita semua. Ekploitasi tanaman obat yang ber-lebihan tanpa memperhatikan upaya konservasinya tentu sangat meng-khaw atirkan. Peran para ahli budid aya tanaman budid an p ara ahli bio -teknologi khususnya -teknologi kultur jaring an sang at p enting untuk menghindari kelangkaan bahan baku o bat herbal yang samp ai saat ini masih diambil dari tanaman aslinya secara konvensional. Kultur jaringan sang at bermanfaat d alam up ay a perbanyakan dan multiplikasi serta ko nv ersi d ari beberap a sp esies tanaman o bat. Pro duksi metabo lit sekunder dapat dilakukan secara in vitro dalam skala besar. Demikian p ula rekayasa genetika d an transfo rm asi g enetik d ap at m ening -katkan produksi metabolit sekunder. Peran mikroba endofit yang dapat mempro d uksi metabo lit sekund er
y ang sam a kualitasny a d eng an tanaman aslinya sangat po tensial untuk terus d ikembangkan guna memp ero leh metabo lit sekund er yang dapat digunakan untuk mengo-bati berbagai jenis penyakit.
D aftar A cuan
Arumugam N., SS. Bhojwani. (1990). Somatic embryogenesis in tissue cultures of Podohyllum kexandrum. Can J. Botany. 68: 487-491. A rg o lo A C., BV. Charlw o o d , M .
Plesch. (2000). The regulation of solasodine production by Argo-bacterium rhiz o g enes trans-formed roots of Solanum avicu-lare. Planta M edica. 66: 448-451. Barna KS., AK. Wakhlu. (1988).
Axil-lary shoot induction and plant regeneratio n in Plantago ovata. Plant Cell Tissue Organ Cult. 15 : 169-173.
Basu P., S. Chand. (1996).Regenera-tion of plantlets from root-de-rived callus of Egyptian henbane. Cell Chromosome Res. 19: 31-34. Benyamin BD., P. Roja, MR. Heble,
MS. (1987). Chandra. Multiple shoot cultures of A tropa bella-donna : Efect of physicochemi-cal factors on growth and alka-loid formation. J. Plant Nutr. 129: 129-135
Cai G., G. Li, H.Ye, (1995). Hairy roots culture of A rtemisia annua L. by Ri plasmid transformation and biosynthesis of artemisinin. Chin J Biotechnol. 11: 227-235. Castillo UF., GA . Strobel, EJ. Ford,
WM Hess, H. Poter, JB. Jenson, H. A lbert, R. Ro binso n, M A . Co ndro n, DB. Teplo w , D. Ste-v ens and D. YaSte-v er. (2002). Munumbicins, w id e spectrum antibiotics produced by Strepto-myces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans. M icrobiol-ogy 148:2675-2685.
Castillo UJ., K. Harper, GA. Strobel., J. Sears, K. Alesi, E.Ford, J. Lin, M. Hunter, M. Maranta, H. Ge. D. Yaver, JB. Jensen, H. Porter, R. Ro binso n, D. M illar, W M . H ess, M . Co nd ro n, and D. Teplow. (2003). Kakandumycins, novel antibiotics from Strepto-myces sp. NRRL 30566, an endo-p hy te o f Grev illea pteridifolia. FEM S Lett. 24: 183-190.
Cucu N., Gabriela, L. Gavrila. (2002). Genetically modified medicines plants. Transfer and expression of a marker kanamycine resis-tance gene in A tropa belladonna plants. Rom Biotechnol Lett. 7: 869-874.
Das P., SK. Palai, A . Patra, YS Samantaray, GR. Rout. (1999). In vitro somatic embryogenesis in Ty hponium trilobatum Scho o t. Plant Growth Reg. 27: 95-99. Deus B., MH Zenk. (1982).
Exploita-tion of plant cells for the produc-tio n o f natural co m p o und s.
Biotechnol Bioeng. 24: 1965-1974. Faria RT., RD. Illg. (1995). Micro
-prpgation of Z ingiber spectabile Griff. Sci. Horticult. 62: 135-137. Gastald o P., A M. Cafiglia. (1996). Somatic embryogenesis and es-culin formation in calli and em-bryo ids fro m bark explants o f A esculus hippocastanum L. Plant Sci. Shannon. 119: 157-162. Ghosh BE, S. Sen. (1991). Plant
regen-eration through somatic embryo-genesis from spear callus culture of A sparagus cooperi Baker. Plant Cell Rep. 9: 667-670.
Giri A ., S. Banerjee, PS A huja, CC Giri. (1997). Production of hairy roots in A conitum heterophyllum Wall. Using A rgobacterium rhi-zogenes. In vitro Cell Dev Biol Plant .33: 293-306.
Guo B., J. Dai, S. Ng, Y. Huang, C. Leong, W.Ong, and BK. Carte. (2000). Cyto nic acid A and B, no v el trid ep sid e inhibito r o f hCMV protease from the endo-p hy tic fung us C y tonaena sp. J.Nat.Prod. 63: 602-604.
Hahn EJ., YS Kim, KW.Yu, CS Jeong, KY Paek. (2003). A dventitio us root cultures of Panax gingseng and g insed o sid e p ro d uctio n though large scale bioreactor sys-tem. J Plant Biotechnol. 5: 1-6. Harrison L., C.Teplow., M. Rinaldi.,
Schartz, and WM. Blaney. (1995). Phomopsichalasin, a novel anti-microbial agent from an endo-phytic Phomopsis Spp. Tetrahedron 14: 3969-3978.
Jha S., NP. Sahu, SB. Mahato. (1988). Production of the alkaloids emet-ine and cephaelin in callus cul-tures o f Cephaelis ipecacuanha. Planta M edica 54: 504-506. Koroch AR., J. Kapteyn, HR. Juliani,
JE. Simon. (2003). In vitro regen-eration of Echinacea pallida from leaf explants. In vitro Cell Dev Biol Plant. 39: 415-418.
Koroch AR., J. Kapteyn, HR. Juliani, JE. Sim o n. (2002). Inv o tro -regeneration and Agrobacterium transfo rm atio n o f Echinecea purpuria leaf explant. Trend s New Crop New News.
Kumar A ., (1992). Somatic embryo-g enesis anembryo-g hiembryo-g h frequency plantlet regeneration in callus cul-tures of Thevetia peruviana. Plant Cell Tissue Organ Cult. 31: 47-50. Lai N., PS. Ahuja. (1996). Plantlet re-generation from callus in Piccor-hiza kurroa Royle, An endangered med icinal plants. Plant Tissue Cult. 6: 127-134
Li JY., JK. Harper, DM. Grant, BO. To mbe, B. Basyal, W M. Hess, and GA .Srobel. A mbuic acid, a highly functionalized cyclohexe-no ne w ith antifungal activ ity fro m Pestalotiopsis spp. A nd M onochaetia spp. Pytochemistry 56: 463-468.
Stro bel, and J. Clard y (1995). Subglutinols A and B: immuno-suppressive compounds from the end o p hy tic fung us Fusarium subglutinans. J.Org.Chem. 60: 7076-7077.
Levin R., V. Gaba, B. Tal, S. Hirsch, D. De Nola, K. Vasil. (1988). Au-tomatic planttissue culture for mass propagation. Biotchnology. 6: 1035-1040.
Lu H., WX. Zou, JC. Meng, J. Hu, and RX Tan. (2000). New Bioactive metabolites produced by Colle-totrichum sp., an endophytic fun-gus in A rtemisia annua. Plant Sci. 151: 76-73.
Maksum R. (2004) Pemberian Vakasin melalui Tanaman Trang enik. M aj. Il.Kefarmasian Indon. 1(1): 1-9.
Miller,RV.,CM.Miller, D. Garto n-Kinney, B.Redgrave, J. Sears, M. Condron, D. Teplow , and GA . Stro bel. (1998). Eco m y cins, unique antimycotics from Pseu-domonas v iridflav a. J. A ppl. M icrobiol. 84:937-944.
Muhlbach H., (1998). Use of plant cell cultures in biotechnology. Biotech A nn Rev. 4: 113-171.
dica) plants using A rgobacterium tumafaciens. Curr Sci. 58: 184-187 N ester EW ., M P Go rd o n, RM Amasino, MF. Yanofsky. (1984). Cro w n g all: a mo lecular and physiological analysis. A nn Rev Plant Physiol. 35: 387-413. Nigra, HM. OH Caso, AM. Guilietti,
(1987). Production of Solasodine by calli from different parts of Solanum eleaginifolium. Plant Cell Rep. 6: 135-137.
Okslar V., B. Strukeij, S. Kreft, B. Bo hanec, J. Z el. (2002). Micro -propagation and hairy root cul-ture o f Solanum laciniatum. In vitro Cell Dev Biol Plant. 38: 352-357.
Pand e P., S. M alik, M . Bo ra. PS. Srivastava.(2002) Rapid protocol for in vitro propagation of Lepi-dium sativum Linn and enchan-cement in the yield of lepidine. In vitro Cell Dev Biol Plant. 38: 451-455.
Parisi M., S. Moreno, G. Fernandez, (2002). Characteriz atio n o f a no vel cysteine peptidase fro m tissue cultures of garlic (A llium sativum L). In vitro Cell Dev Biol Plant. 38: 608-612.
Park JM., SY. Yoon. (1992). Produc-tion of sunguinarine by suspen-sion culture of Papaver somniferum in bioreactors. J.Ferm Bioeng. 74: 292-296.
Patra A., B. Rai, (1998). Succesful plan regeneration from callus cultures of Centella asiatica Linn. Urban. Plant Growth Reg. 24: 13-16.
CH . Park. (1995). M icro p ro -pagatian of Rehmannia glutinosa as medicinal plant by shoot tip and ro o t seg m ent culture. A cta Horticult. 390:113-120.
Pessuto J. (1996)Taxol Production in plant cell culture comes of age. Nature Biotechnol. 14: 1083. Perez-Bermud ez P., HU. Seitz, I.
Gavidia, (2002) A pro to co l fo r rap id m icro p ro p ag atio n o f endergered Iso plexes In vitro. Cell Dev Biol Plant. 38: 178-182. Prad el H., U. Dumkelehmann, B.
Diettrich, M. Luckner. (1997). Hairy root cultures of D igitalis lanata. Seco nd ary metabo lism and plant regeneration. J. Plant Physiol. 151: 209-215.
Preil W., P. Florek, U. Wix, A. Beck. (1988). Tow ard mass propaga-tion by use of bioreactors. A cta Horticult. 226: 99-105.
Rai VR. (2002). Rapid clonal propa-gation of Nothapodytes foetida – a threatened med icinal tree. In-vitro Cell Dev Biol-Plant. 38: 183-185.
Ravishankar GA., S. Grewal. (1991). Dev elo p m ent o f m ed ia fo r growth of Dioscorea deltoidea cells and in vitro diosgenin produc-tion : Influence of media constitu-ents and nutrient stress. Bio-technol. Lett. 13: 125-130.
ganogenesis in ginger (Zingiber officinale). J.H erbs. Spices and M ed.Plants. 4: 41-51.
Rout GR. C. Saxena, S. Samantaray, P. Das. (1999). Rap id clo nal propagation of Plumbago zeylanica Linn. Plant Growth Reg. 28: 1-4. Rout GR., UC. Mallick, P. Das. (1992).
In vitro plant regeneration from leaf callus of Cephaelis ipecacuanha. A dv.Plat. Sci. 5: 608-613.
Rout GR., S Samantaray. (1995). So-matic embryogenesis and plant regeneration from callus culture of A cacia catechu a multipurpose leguminous tree. Plant Cell Tis-sue Organ Cult. 42: 283-285. Satheesh Kumar K., KV Bavanandan.
(1988). M icro p ro p ag atio n o f Plumbago rosea Linn. Plant Cell Tissue Organ Cult. 15: 275-278. Saxena C., SK. Palai, S. Samantaray,
GR Rout, P. Das. (1997). Plant regeneration from callus cultures of Psoralea corylifolia Linn. Plant Growth Reg. 22: 13-17
Sharma P., MV. Rajam (1995). Geno-type, explat and position effects o n o rgano genesis and so matic em bry o g enesis in Solanum melongena L. J. Exp. Botany. 46 : 135-141.
Shasany A K., SPS. Khanuja, S. Dhawan, U. Yadav, S. Sharma, S. Kumar, (1998). High regenera-tive nature of M entha arvensis in-ternodes. J.Biosci. 23: 641-646. Shi HP., S. Kintzios. (2003). Genetic
transformation of Pueraria
pha-rhizogenes. And puerarin produc-tion in hairy roots. Plant Cell Rep. 21: 1103-1107.
Simanjuntak P., T. Parw ati, Busta-nussalam, TK. Prana, S. Wibowo, H. Shibuya. (2002). Isolasi dan kultivasi mikroba endofit peng-hasil senyaw a alkaloid kinkona dari Chinchona spp. J. M ikrobiol. Indon. 7(2): 27-30.
Sriv id y a N ., BPS Dev i. (1998). Azadirachtin and nimbin content in in vitro cultured shoots and roots of A zadirachta indica A. Juss Indian J Plant Physiol. 3: 129-34. Stafford A., P. Morris, MW. Fowler.
(1986). Plant cell Biotchnology: A perspective. Enzy me M icrobial Tech. 8: 578-597.
Stro bel GA ., and B. Daisy (2003), Bioprospecting for Microbial En-d o p hy tes anEn-d Their N atural Products. M icrobiol. and M ol. Bi-ology Rev. 67(4):491-502.
Stro bel,GA . (2002). Micro bial gifts fro m rain fo rests. Can.J.Plant Pathol. 24: 14-20.
Strobel, GA ., E. Ford. J. Woapong, JK. H arp er, A M . A rif, DM . Grant, PCW. Fung, and K. Chan. (2002). Iso pestacin, an iso ben-zopuranone from Pestalotiopsis microspora, possessing antifungal and antio xid ant activ ities. Pytochemistry 60: 179-183. Strobel GA., RV. Miller, C. Miller, M.
endo-quercina. M icrobiology 145: 1919-1926.
Tan,RX and WX Zou., (2001) Endo-phytes : a rich source of func-tional metabolites. Nat Prod.Rep. 18 : 448-459.
Tripathi L., JN Tripathi. (2003). Role o f bio techno lo gy in medicinal plants. Trop J. Pharm. Res. 2(2): 243-253.
Toppel G., L. White, B. Riebesehl, K. Von Borstel, T. Hartman. (1987). A lkalo id p attern and bio syn-thetic capacity of root cultures from some pyrrolizidine alkaloid producing Senecio spp. Plant Cell Rep. 6: 466-469.
Rap id clo nal p ro p ag atio n o f Pinella ternate by tissue culture. Plant Cell Rep. 8: 450-454.
Zhang,B., G.salituro, D.Szalkow ski, Z . Li, Y. Z hang , I. Ro y o , D. Vilella, M. Dez, F. Pelaes, C. Ruby, RL. Kendall, X. Mao, P. Griffin, J. Calaycay, JR. Zierath, JV. Heck, RG. Smith, and DE. Moller. (1999). Discovery af small molecule insulin mimetic w ith antidiabetic activity in mice. Sci-ence 284: 974-981.
