Perubahan Struktur Sitoskeleton Berbasis Mikrotubulus dan Ultrastruktur Oosit Pasca Kriopreservasi dengan Metode Vitrifikasi

IAPORAN

HASIL

FENELlTlAN FUNDAMENTAL

I1

PERUBAHAN

STRUKTUR

SITOSKELETON

BERBASIS

MIKROTUBULUS

DAN ULTRASTRUKTUR

OOSlT

PASCA

KRIOPRESERVASI

DENGAN

METODE VITRIFtKASI

Ole

h

Dr. Ir.

Sri Wahj~n~ingsih,

MSf.

Dr.lr. M.Sasrnko

Djati,MS

Dibiayai

sleh

Direktmt Penelitian dan

Pengabdian

Kepada Wf&syaraW

Dengan

Swat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penugasan Penelitisrn

Desentralisasi Momor 0 1

?!SP2fllPPID.~Mfi1112007

Direktorat Jenderal

Pendidikan Tinggi

'Departemen Pendidikan

Nasi~nal

UNIVERSITAS BRAWlJAYA

I. Judul Penelitian :

Pmubahan

Stwldur

Sitoskeleton

Bwbasis

MikrotubuCus dan UKraetruktur Oosit

Pas=

Kri~raservasi

Dewan

Metode ViWfiks t

2.

Ketua PenelitF

a.Nma

:

Dr.

Ir. Srf

Wahjuningsik,MGi b. Jenis

kelarnin

:

P m p u a f l

c.NIP : 131 759 598

d .ParrgkatlGabngan

:

PernMna

/lV-A e.Jaba2an hngslnnal : Lelstor; Kepalal

f.Juntsadf akultas

:

Praduksi

TernaWPetemakah

g

.Perguruam Ting~i

: Urriversitas Brawijaya

3.

Jurn1.a

Tim Peneliti : 2 orang

4. Lokasf

hneliiian

: Laborahdurn Reproduksi

T-mak

Fapet W-rikbpaw dan Biolagi

MslekirIer

Eijlrmtm

5.

K e r j a m

dmgarr Institusi

lain

a.

Warn

Instans1

-

6. Masa P d i t i a n : 8 bukn

PERUBAHAN STRUKTUR SITOSKELETON BERBAStS MIKROTUEULUS

DAM ULTRASTRUKTUR OOSIT PASCA KR1OPRESERVASI DENGAN METODE VlTRIFiKkI

Sri

WahjunCngsih

dan

Sasrnlto Djati

Tujuan perreMan

dalah

mengkaji

uitrastnrhr olosit pas= vitrifikasi rnenggunakan konsmtmsi

EG

30 Ohdqn lama papawn 8

medt

menggunakanl

TE.M (Transmisi EtMron Mikmkop). AnaJisa dat4

s m r a

dwkriptlf. Hasil penelitian menunjukkan

-sit

hasil 4tMkasi rnempunyai =ria pdusida

yang

abnormal

(fraktur),

rnernbran

plasma lapis gartdb

mengalami

ILis,

bebermpa Wir korteks

mengalami

degenemsi dengan demjat rang yang leterlihal

dan

perpindahan

butir kmteks di ruang psrivielin.

Kesimpulan

dari penelitian

Ini

adaleh

terdapat

penlbahan ultrasttwktur pada i t h v;mkasi

mnggunakan

EG 30 74

ctengan

lama pqparan

3

menit.

THE

CHANGE

OF

CtTOSCELETON STRUCTURE BASED ON MICROTUBULUS AND OOCYtE ULTRASTRUCTURE AFTER

CRYOPRESERVATION USING VtTR1FICATION METHOD

The aim af

this research

far

the

second year was to nnaliiped w l t m ~ d u f a l d

c r y o p ~ n r e d

czooyte using vitrification method

by

Twnsmissi~n Electlrone Miomscope UEM). The results

of

the research showed that cryapresenred mcyk

using

vitrification had

ultrastructural

change :mna frastUre, lysSs of membrane plasm, chamge

d

wr@aC granule position

to

per vit&in space

and

degeneration

of

mttical gmnub. The condusbm of ,this

research

was that vitrification use

30%

EG

and

the

time

af

exposum during 3 minutes caused

ultrastructural

&aflge in goat w@e

Pvji dan syukur

.Icehadid

Allah SVVT

karma

b e h t

rahmat

dan k,ar~niaNYA, ,pbksanaan Ipemlitian dan plembwtan laporan penelithn

Fundamental

h h u n prtama ini dapat

did-ikan.

Petaelitian ihi

dibiayai

dengan dana dari Direfdaraf .i endera1 Pendidikah Tinggi,

Departemen

Pendidkan Nasionai, Kontrak: Nornor:

Surat

Perjanjian Pelaksanaan Wibah Penugasan

Penelitian

Des~~ralisasi Nomor 01 ?1SP2HIPP;tDPZMIl'IlI2007

Pa& kesempatan ini kaml menyampalkan tex3ma kasih

kepada

yang

terhomnat:

9.

Dimktorat

Jenckmi

Pendid;ikm f inmi, Departemen

Pdidikan bfasidnd,

2.

Rekot Uniuersltas Bmwijaya

3. Ketua lLmbaga

PenefKbtr

Unibraw 4.

Dekan

lFakulhs Peternaka Unibraw

5 Kepala

dan

gtaf

Laboratorim

TEM dan Hisiologi bboratarim Bjolpgi

Maiekufe~

Eiijkman, Jakarta

6. Smua

pihak ymg

klah

mwnbsrikan

rekomendasi, menyetyjui dan membantu

pelaksanaan serta penyusunan laporan peneiitiw mP.

Sernoga

basil penelaim ymg

ditrsangkan

ddam

lapran

ini bemanfaat

bagi pihak-pi hak

yang

mmerfukan.

Mabng, 3 DesmWr

2007

DAFTAR

I

S

1

H A M A N PENGESAHW RFMGKASAN PRAKATA DAFTAR IS1 DAFTAR GAMBhR MI3 I. PENDAHULUAN BAB 11. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kriopmrvasi Ooslt

~Mesaggunakan

M W s viiflbsf

2.2. KualFbs Oasit Pasca Vitrifihi

2.3. Penrbahan UltWrukur Omit Setelah WbiBkasi 8A8 )!I. TUJUAM'DAAI MANFAAT PENELINAN

BAB

IV. METODE PENELiTIAN

BAB V. MSIL DAN PEMBP~HASAN BPI6 V1. KESIM PULAN DAN SARAN

6.1. Kesirnpulan 6.2.

Swan

DAFTAR PUSTAKA

Satah satu kernajuan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang biulogi rtproduksi adalah teknologi

tmnsfer

embrio. Sakh satv hambatan

dalam

pelaksanaan

program

transfer embrio (TE) pada tern* di Indonesia adahb

f a k t ~ r ketersediaan smbrio yang berkualitas unggui. Upaya ini dapat . d i r ~ k h dari beberiapa surnber (1) koleksi embriu dari ternak M n a danar yang

disupemvulasi

(2) pFoduksi embrio melaiui ,proses fertiIIsasi in M t m (FIV). Produksi embria secara in wive memerlukan biay yang relatif tinggi

dan

jumlahnya sangat terbatas, khususnya jika mempruduksi embrio yang d i k W s i dari safurrtn reproduksi betina

donor

yang disupero~w1ad. Pdulcsi embrio in d b merupakan

alternatif

yang

bLa

dirnanfaatka~

untuh

me'idap-n embrio. Secara umum ptoduksi

embrio

secara

in vitm yang meliputi

maWrasi

omit, ferttflsasi dan

ku#ur

in vitm

telah

dnaporkan pada hewan tern& kambing dan

sapi (Djati,

4999; Wahjuningsih dkk., 2 0 I )

Teknologi FIY saat ini di Ind~nesia dilakwkan

dangsln

mmanbakan

-sit segar yang

d i b l e h

langsurtg dhri Rumah P o w Hewn

(RPH).

Nm-uri demikian,

kendala

yang

dihadapi

adalab oosit mamalia rnerniliki daya

tahan

hidup )fang sangat terbatas sehiqgga tMak dapat dlsjmpasl d&rn waI$u yang

lama pada

suhu

kamar.

kteibatasan

waMu

simpan

ini dapat diatasl &man teknIk penyirnpanan beku atau kriupresti)rvasi wsit

unbk

mempertahankan

blangsungan

htdup sel sehingga viahilitas omit dapt dipemhankan .

Teknologi rekayasa reprodwksi khususnya k r i o p r e m i

telah

dikernbangkan

untuk

spematozoa

dan

embrio, narnun

wjawh

ini kebrhasilan kriopraservasi oosit yang ktah dilaprkan masih sang&

terbatas

dan

varidif. Penggunaan

prosedur

kriapmsewasi

msit

secara

kornenial rnasih sangat teeat?? [fajta, 2000). Pa& awa! studi tenbng

Mopres~rvasi,

- - e l a k h n

k r t o p r e w a s i menggunakan metode konvensional, namun saat i i meide

vltrifikasi

lebih sering diaptikasikan- Metode tersebut sedsrhana, murah dan tidak memartukan

alat

khusus untuk manumnkan

auhu

secata brkthap dan dapat

merninirnalkan

pernbentukan kristai es sehtngga nudah diaplikaskkan di tempat yang rnsmiiiki kuntainer

nitrogen

cair. (Shaw

ef aJ., 2OOU),

Selma

proses kriapmniasi

dipdidcan

suatu kriogrotektm.

'Krioprotektan slain dapat melihdungi sel juga temyata diduga

&pat

rnenirnbulkan

kerusakan

pada sel akibat pengaruh toksisitasnya.

Derajat

ptoteksi dari bahan krioprotektan

terhadap

proses krEstalCsasi pad4 masa

~lpembekuwn tergantung dari jenis clan Isonsentmsi

krioprotektan

yang dipakai

serrta lama paparan (Leoni ef a\.,

2002).

Dan bebrapa p n s l i i n tentang

ktiopreservasi

omit,

dikehhui ada bemamm-macam krioprotektan

yang

dapat

digsrgunakan untu'k vitrifikasi oasit,

namun

demikiarr telah diketahui bahwa

etilen

gllkol (EG) mernpunyai efek hksih yang lebih rendah dtbandingkan krbprotektail @iiQ

Jain

(Gotdon, 19W,;; Hachi et a],, 1995).

Pada tahun p e a m a

telah

dipersteh hasil bahwa haitas oasit twbaik ditzgsifkan

pasca

vitrifikasi memggunakan Etilen

Gtikd 30

%

dan h a

paparan

3

menk.

Evaiuasi pngaruh

sitologis

setelah

perlakuan

menunju'bkan brrrsakan

pmanen yam

t i i k

tampak setelah

paparan krhyroWan

[Han

et

al.,20[b4!)-

Uleh

wbb

itu

,pendihn

pada

tahun kedua

adalah mengarmati uttr~b'uktur

oosit

owit hasil tVM yang blah mengalami

proses v'rtrifikasi

pa$a

tahun

perkma.

2.f.

K r i c r p r ~ ~ s ~ ~ i nos& menggunakan

mewe

4W1)rasi

Secara garis besar ada dua

metode kriopresewasi

yaitu 'konvensional

(sbw hexihg) dam metode vitriflkasi.

Pehdaan

yang merldasar dr'mtgr;?

kedua

metode

tersebut addah pada

metode

konvensiongll terjadi pemsdabn airan melalui pmbntukan khstal

es,

sedangkan pada vitMikasi pemadabn

cairan tanpa mlaIui

pembnttrkan krisial

es

intrasetuler

(Men et

al

2003).

Ktiopreservasi d n g a n metoda

konvensional

mmedukan perslatan W i n g

machine (cryoeelt) yam harganya sangat rnahal unbk menufunkan

swhw

berhhap, prbses kribpresemsi memeduk8n waMu yang relatif

iama

serta

terbmtuk

krislall es intraMuler sehingga mehsak organs1

oasit.

DWndingkan

sistirn komndonal, keuntungan kriopreservdsi secara vittflkasi &ah tidak

mmerlukan

freezing

rnaclrjne

{Cfyo#Ci',l dbsl prows

ktiopresevasi

wpat,

narm

un

kelernahannya

adalah seringkali teljddi toksisitars karma tingginya

molaritas lamtan wWkad (Acker

ef ale,

20Da;lhn eta/., 2004)

Tidak seperti pada krlopmsemi embrio,

pnggunaan

pmsedur

kriapraewasi

aosit secara 1 komersial rnasih

s a n e *

tehatas. Sifat yang berbeda pada o o i t dan ernbrio sepbrfi

wkuran,

bbfltuk, pemeabillbs, kuafitas dan

sensNvitas,

btgantung path spasies,

tahap

perkernbangan akan

menentukan kondjsi

yang paling @at urrtuk

keh~hasilan

'Mopmervasi (VaJta,

20Ml;

Qwllo d a!.,2004).

Pada pr;mes

wtYrlPikasi

dihutuhkan

kriopmtetdan.

Ada dua sisi ymg

berlwanan

dari

penggunaan

krisrprotektqn, ygRu salain dapert mdindmgi =I, kdoprotekhn &pat rnenimbutbn kermakan pa& sel What pengaruh

kukdsitasnya.

Konsmtrad kdqwcdektan yang mdah

daIam

mdlrsm kriqobktan

a b n

mnyehbkan kerus&n msit

m e n f a n y a ~kristal-

kriaB8

es intramtuler, aka

tebpi knnsentrasi , k r i o i p r w n yang tinggli dapat

Wsik dan menyebibkan kemsakan osrmtk pa& amit. Diantara

kriopraZekbn

irrtraseluler, @film glikd rnetwakan yaog paling 'banyak digunakan dalain proses

pernbekuan

(Saha

et

&.,

?Sf%).

Dibndingkan

Mgan

glisml dan proclplien

glukd.

dilm

glikol

rnemifild

tokisitas yamg bbth

~mdah'kwena eelngIiko1 paling mudah menyerap air datm

-it

Bibanditytkan kriopeoMZan blnnya (Motgmisligil et

d.,

1936,

Wahjuningsih,

2002).

Panggunaan

elllan

gfikal &bagai kribprofektan htraselulreri

juga

biungkapkrt otet~ Gordon

(I*).

2.2. Kuaf Stas

wsit

pasca kriopresewasi

Hasil permtitian Kbwayarna et

d.,

(t!3Q9) p d a aasit m u s i a bahwa

mQade

vitrifikasi ddengam carrrplrwn 30 % EG dan 6.5 M

S u b =

dapat menjaga

viabititas oosit

miefah

dibekukarr

s e k r 00%. Wsai (19963 rnembuktfbian behw penamkhan

N%

EG padn larutan

PfJS

menh$ka%n

tingk&t

kelangsungan Ridup ataw survirral

mte

in vW oolsit ~fiius

sam,pi

cferrgan

98%. Mmun demikian ~ n d i t i ~ a n b e M a

dibandingkan

dengsn hasil penditian

%

daIam

lamban

vitrZfjkasi kbih balk penganrhnya krhadap viabititas dibondingkan EG

50

%. Perbedaan ini disebabkan

lama

paparan

yang

&&&a.

Hasil penditianl bhun pertarma rnenunjukksm bahwa persentase morfologi

oasit normal berbeda

pada

k o m t m s i dan

lama paparan

yang

beheda. k i n a

,paparan

3 menit

dam

kansentrasi

EG

30

%

mmberikan

maffologi normal terbaik.

~srldkuan

EG

30% ckhgan

lama

paparan 4 menit dan EG 50% den@ii

lama

paparan 5 menFt rnenunjllrkkan

nilai rnarfohgi

aosit normal yang terendah.

Konsentrasi EG berpengaruh sangat

nyata

[p<O,Ol) terhadap yang hidug,

sedangkan lama

paparan

tidak

msmpunyai

pengaruh (p>0,01) terhadap Wsit yang hiidup Konsentrasi EG

dan

bma

paparan

berpsngaruh nyata brhadap

uiabilitas oosit. (P<O,Ol).

Kunsentrasi

30%

EG dengan lama

papman

3 menil

~merupakan

konssentrasi opiirnal yang dapat

rnenjaga

viabilks omit hasil

vitMbsi. (Wahjuningsih dan Djadli, 2006).

Narmun

demikian penerrtian ini berbeda

klbandingkan

dengan hasil

penelMan

Otoi et at. (1998)

yang

mehunjukkan 'bahwa ,pcnggunaan krioprotektan

EG

40 %

dalam

fanitan

vitdflkasil

lebih

baik pengamhnya terhadap viahifitas dibandindkan

EG

30

%. Perbethan ini disebabkan lama

paparah

yang beheda.

Be-pa

faktor

yang

dWuga

ciapat

rnengaklbatlcan perubahq a-fukgi

dan

fungsi blotogis oosit addah pemaparan tmhadap kbprotektan (Taha dan

Sceliander,

1982;

Kubota

ef

a]., 79981,

proses

pertdinginan (Aman

dart

Park,

Hasill penelltian ini

menunjukkatl

h h w a penurunan tingfcat fdtlsasi

oosit

hasii

vizrifikasi di$&atjbn

prubahan

rnarfologj,

viabilitas dan struktur oosit. Vihikasi diduga msit

dapat

mengakibdbn

kawsaLan

pada

zona

peiudda,

membran plasma dan, organel sitoptasma mrti s k o s k e h

sel

(Amv @t a!., 1903; Hochi et aL, 1996; Vajta 1B7) dan butir-bul kod& (Fukui et a!., 1995;

Hyttel

ef

al.,

2001)).

Pemdingfnan

dtduga

dapat

daprrt rnenumnkan tingkat fertilisasil kamna kerusakan organel oosit (Didion eZ

d,

19210). Pengamatan ultragtruMur wsit mengguWn transrnisi elektmn

mikr&kclp

yahg dilakukan oteh Fukui

et

el. (1995) membuktlkan

bahwa

vitrf~k&ai

dapat

rneny8bblcan aleh skositmis gr;anrha, kart&, nawn

bagaimaria

rnekanismenya

b l u m

dapat mdijel=km

3.1. Tujuan Penelltian

Mengkaji

kualitas

omit paaca $ i k a s i menggunakan konwntrasi EG

30 %

d m

lama

paparan 3

inenit

terhadw aftrastmktur

rnenggunakan

TEM (Twnsmisi Ebktmn Mlkroskop)

3.2. Manfaat

Fendlaan

Mempem1e.h

informasi

tentang

ultm&mktur oosit pasca vltrifl kasi

mngglrnakan konsenfrasi EGj30 %

dan

I m a

paparan

3

menit

Mengembattgkan Wnolagi kfiopmerv~si

osif

Penelltian dlahkan di hkraturiurn Replduksi Temak

Fakultas

Pemakan Unibraw

dan

Labomtotiurn Hietolqgi dan Tmrrsrnisi

Efdctron

Mitcroskop

Lernbaga

Biologi Molekuler Eijkman

-

Jakarta

Tahapan

Penel iibn

Kobksi omit:

Ovadurn dikurnputkan dari RPH Sukun

Malang

balam Readaan sqar dan dirn~ukkan

dalgm

medium bsrisi k C I D,9%

+

Penislbn

100

Ill

+ Strwtornisin 100 IU pada suhu

35'C.

Kokksi mil

dengan

_cam

aspirasi. dari

bilk4

mengg~nakan

jarurn

dengan

ukumta

118 G. hrtediurn aspi$& yang

4ig~naCran

TCM 199 powder (GIBCQ, Cat Fa 211200b760) dihrmbahkan Hepes dan NaHC03,

media

ini

difiltrasi

dengan

men$gjUhakan membran filter bewkuran

diameter

0.22

urn. Medium aspirei disia@kan dln diinkllbasikan minimal dua

jam

seblum

dlpergunakan.

Evalumi ku(is3s boa#

immature

dilakukan

berdbsarkan

krkteda Mozclrni (ZCKII). Hanya omit

berkuaIIhs

A prig

digunakan

untuk

penditian

sdanjutnya

(SiP+a$m

kompak

m r a

sempwrna dengan

sd~sel

kurnulus hraturan

menempel

di

kes&lh~han

bagian

omit)

Mabml

UOsSt

in

v m

Setetah dilakukan ktasifikasi

kualitas

oost,

maka

&€

yaw

klrkuditas A dimatvrasli

secara in

v i h dengan medium TCM199 + FCS 10% + PMSG 110 IU + HCG 10 IU

sekrna

24 jam

rlalarn

inkubat~t pada

suhu

3g°C

dan

5% .C02, kelembaban 95%.

Kriopresewasi

-sit

rnengwnakan

n n d &

viMAkasr

Omit hsisil lVM dipaparkan ke dalam larutan vitrifikasi yang yaw

rnsngandtr-ng

30

5%

+ 0.5 M Strkfosa dengan

lama

waMu paparan 3 menit.(hasil tahun peama). Omif dimasulckan ke dalam minishw transparant 0,25

a:

(Fmmk

s b w ) masing-masing W$i 10 omit. Setelah pernaparan

di

dalam uap

nitrogen

selama

10 ddk, m i n i d m yang tserisi -it dimasuklcan dalarn kon&i'ner httrogen

cab

dan

tiisimpan setarner

2

rninggu

unfuk

analisa

LeMh

lanjut.

Warning omsit

Setelah msit dalslm mjnistmw disimpan dalam kontainer seiarna

2

minggu, o ~ s i t yang telah mengahrni vitrifikasi dihkukan thewing &ngan cara penghangan (warning) di udara selarna 10 detik kernudian dirnasukkan daiam

penangas

air

suhu

35%

sekma 1 menit. Isi mdnisCmw

dituangkan

ke

&lam cawan petri

dan

ousi? dlbllas d m

kalE

dengan

sukrcsa 0.5

M

untuk rnenghilangkan krioprektan seperti

prasedur

yang

dilakukan

oleh

Sun et aL(t995).

AnarlPsis

ultrastruktur

QOS#

pasca vitriflkasl

Metode

yang

dtgunakan

herdasarkan t-tytbl cfan Madsen (11987) dengan rnodfhsi. Owlt segst d m wsit

Mi-ll

hasil

\EitNkasi

yang

tekh

mengalami

warming difiiFlaesi bC &lam

larutan

PBS

(pH

7,2

-

7.4) 0.1 M

yang

rnengandung

paradomaldehid 2.0 % &an glwtamtdehid 0.1 M pada suhu 4 o C sefarna

60

men#

W i t

dkuci due kali

dalarn PBS

0.1 M suhu 4 & masingmesing

=lama

5 mnit ditanam

pada

agar

4 % dan

difiksasi

~

~

dalam

l

lamb

I

IPBS p n g rnengandung

Os04

I ?4 pad suhu 4 oC *lama I

jam.

Selanjutmya

didehidra~i

daiam serial a n d ' krtingkat &#I dftrtnam

dl

dalarn

epon.

Setelah difakukan

petnotongah serbl

setebal2 mihameter pmpamt diwamai dengan

foluidine biue

dan

dipriksa dl bawah mikroskop caMya. Ssri potrmgran 2 mikrometer

yan$

ferpilih danjutnya dbnam brnbaTr [ m k d d i n g )

dan

dilakukan pernotongan setebal, 60 nm. Potongan uB,m

@pb

tersebut dbkatkan

dt atas

grid termbaga dan dikomltmskan bwturutlturut

dmgaq uranfl a

-

~ d m a

30

mmit dam lead sitrat selama 1 5 menit.

Pengamahn

u l tktur ~ ~msit dmgarl Tmsmission

EImimne

Micmwpe

0

dikklrhn tiwhdap keadaan rnembmat

plasma

wrta

organel loosit

.

V. HASIL DAN PEMBAHASAM

Pada

hhun

p a m a

tehh

dipetoleh had bahwa kuatibs

oosit

W b d k dihasilkan pasta Mrifdcasi mnggunakan

Etibn

GIikol30 % &an lama paparan

3

m i t ,

selamjutnya

pada

penelitirrn

ini dihkukan pengarnatan u!trastruktur.

Zona

pehsida

oosii

setelah vmkasi dapat diklasifikasikan berdasarkan

marfafbgi

normal dan tidak normal (gmbar I dan gambar 2). Omit basil vitflliasi menunjukkan bentuk yang

abnormal

(fraktur) seperti ditunjukkan pada

Cambat

1

,

sedangkan

m i t

segar

(lida k mengalami vttrifikasi )

rnempunyai

zona

pelbsida yang rnasih utuh seperti dftunjukkan pgda Garnbar 2,. Seperti dkketahui bahwa interaksi

spermatozoa

dan

sel

blur

brjadi meblui bekrapa farse pada permrrkaan oosk yang diawat5 dmgan

pedekatan

pada M k s ekstmselukr dan

selarrjunta

pstda membrane

plasma

aasit: (Evan,

2000).

Pade

rangkaian proses

internhi tersebut

ZP memwang peranan pentinp, Terikatnya spena40zua pada ZP

adalah

interaksi m i f i k

yang

maupakan kunci pengdur

proses

fertflkasi.

Setelah

penembusan ZP maka

spematozua

be& dalam

ruang

petivitelin dan menempel psrda mrnbrene

wlblin.

Proses vikfikasi dapat merusalr zona pdlusida,,membran plasma

dan

siroplasrna

mhingga

menyebabkan

oosit

brdegeitems1 (Park

dan

RWimg ,1$@2),

Te

jadinya, abnsmalitas

pa&

ZP

seperfi hktur menyebabkan hamlatan tetjadinya

proses

fertilisasi*

Fuku

ef al ( t M ] menyebutkan

bahwa

pernbekuan dapat

rnenyebabbn

pembahan ZP,

yaRu

terjadinya

pengemsari (hardening) yang

d b n

mertyetlabkan psnurunan angka ferhasi.

Pads penafitian ini

pubahan

ultrastruktur

yang

terS;adi pada

wit

Mtll

setelah

vifrifikaei adaiah di ddam

EG

30 %

ckngan

lama

paparan 3 menit

adabh

adalah

terjadinya

prpindatran

p i s i

erta

degenerasi

dari

butir-butis

k o M s seda terbentuknya wsikel besar. Pew& hart distfi busi dad buti-butir

kofleks yaitw, se3ain

tersusun

wcara

soliter

juga b m p k beskelompuk dl

bebmpa

lakasi,

bebrapa butir

kart&

mengalami

ciegeherasi dengan brajat

yang ~ ~ a - b e d a swta eksr~sitosis

s+

yang

terlihat

dari adanya sha-&sa, butir katteks di wang perivibtin.

Parubahan

lokad

dad

butir-butir

k&s

ini diduga terjadi akibat proses

dehidrasi rnaupun

mhidrasi pada proses vitfifikasi.

Fusi

dari

kortikal

granul

dalam

ornit

dergan membran plasma oosk

dan

deposisi kandurtgan kortikal gmriuI dalarn

ruang

perivitdln meyebahkam reaksi zona

untuk

memblok patispermi. HahbdMn tethadap pdispemtia addah peristiwa

w a I

yang sangat pewng

selama

aktlvasi oosit

Fertilisasi

cm4t

yang

klah

lmngddmi

kemsakan

menyebdtikan

reaksi kodikal panut bid& mpurna yang akan rrlengakibatkan polispmia { Burkin ddh Mulbr, 2000). PewMan pada butir&Mr kurkdcs didgga Wt

wbdgal

+&or

penyebab

taqadinya

polispernola

padit a ~ s i t

aetehh

vitri@kqsi.

~ e r u b h a n

tersebut serupa

dengan

yaw

telah

dihporkan

pada mit sapi

set8lah

vi~fllidsi (Fob el el. 1986; Hytte1 eta/., 2001).

Pada

ocasit

Mt-ll

setelah

vitrifikasi menunjukhan

terjadilnyo

kemirakan, 1Dat4 bsrgian

luar

tmpak bahwa membran lplasma lapis

gmda

rnengaktni lids,, vesiket-uesikei baik

soliter

rnaupun

dalam badam fwi

tenusun

di

bawah

membrane

plasma,

rnarnwn batas

mmbrane

Wikl

tat'npak

ti&& jslars, ~butir-

butit

but&

krsusun

m r a

soliter

rnaugun berkdampok, namun mengalami degenerasi. Begftu

pula

dengan

organel-organd

l a i m p seperki mItrrlc~ndiia dan

badan

golgi

tampak

mengolami

degenemsi.

Butir-Wr

sisa organel yang rnemgalarni thgenemsi 8hm&ar di &jam sitqtlagma. Kenrsakan

otgeheIl

ternbut metryerupai kerusakan

yang

terjadi 1p;ldzi sosit sapi tahap Mt-ll akibat. prosles pembekuan yang diduga kerllsakan tersebut didkibatkanl

oleh

kristai es flng W m t u k (Sun, 1996). FaMor lain yang

dapat

menpbabhnl tefladnya kewsakan

adalah

terjadinya deWm5

baik

daci swspensi media

intra

$an

ebkawluhr

seflingm oosit mengalami pengkerutan

mau

pun pmbengkakan (swelling).

Strakgi

yang dgunabn ,~rltuk utltuk menghindari tokeisitas larutan

vitrifhsi

adaldh memperpeek

waldu pemaparan

dengan ta~ubn. Marnunjib

waMu

perriaparan

iellalu pmdslr, m&a

wk#rap~h

kdoprotemn tidak

a k u p .

sehingpa es intrabeitiier tnasih dapdt be&enikrk. Olah karma & W u

gsJnapar.mn

opumal

bntuk kebrhmilan

~tblflkasi~

diperluirran

sebagai batran

pdimhngan

untuk

men~umngi bkisitas ddh mbrtjaga

agar

fidak

t8rb0ntUk kdstai BS intmwluler.

. - -

-

A , ' - % * _ - - . - -

,4(

- p - - - 1 , 3 : .L = & I 1 I ..

..

11: s 7 -

.-3-53--

.-

;5<-#

VI. KESllHPLlLAW DAN SARAN 6 Kesim pulan

Terdapat

perubahan

ultrastfulrtur

pacia

omit Mt-ll

setelah

vitrifikasi rnenggtlnakan

EG

38 % dengan

lama paparan 3

menit.

Fembahan

ulfrastfuktur

yang terjadi ;addah

ahormerlitirs

mna

lpeiusida,membmn8 piasma,

perpindahan

wisi

wta

degenerasi

dari

butir-butit korteks

6.2. Saran

Untuk

mndapatkan

analisa

yang akurat tentang u!iTasbuktur omit hasit

vitrifikasi

dieerankan mena&&

jwmlah mpel

r P&u dikaji IaiR lanjd mkmbme

dugaan

tetjdinya~ aibnomslMs

m a

Acker,J.P.

and

Lmksley,

E.M.

2003.

Pr&Wve effect of inlmceliular ice during f~:8e&ld ?. Cryobidogy 46 : 197-202

Djati, M-S,, 1999.

Plengaruh

suplmentasl

PMSG dm

hCG pada proses fertilisasi

in

vitro dan kultur klon embrio sapi dertgan IQF-I . Diseriasi hal 25. Program Paswsarjaina lnstitut Pertanian Bogor, Bogor

Burkin,H.R. and D.J. Miller. 2000. Zana pelltmida protein binding abillity of

porcine

sperm

during epididyrnal maturation and the

acrosomal

reaefEbn, Dev.Biol. 222(1) : 99-1

OQ.

Fukui,

E.J.,

Xh,

L.

and Downey,

B.R., 1995, Ultrastructural

changes

in bovine oocyte cryopressrved by vitrification. Ctycrbhlcgy 32(2): 1 3Bt 56.

Evan,J.P. 2000. Getting spem and eggs

togefYEer

: Things

cansenred

and Wing diverged. 8iol.Reprd 63 (25: 355-300.

Fwku,E.,Liu and B.R. Downey. 1995. In vitro viability and

uttrastrucrtural &awes

in bovine oocytes

beated

with

a vitrification solution.

Mal.Reptob.Dev.

40

:I 77-1

85

Gordon, 1. 1904. Laboratory

produdion

of cattle embryos.

Cab.

International. Cambridge. 55.65

Han,

B

and Bischof,J.C.

2004.

birect

-11 injury associated with e u k t i c

crystaIlization during

fmzibg. CryobioEogy 48 : 8-21

Hochi, S., Kimura, K., lto, K, ~ i ~ b a p a ~ h l , M. 1996. Effect

of

nuclear

stages during in vitro

maturatidn

on th&

s u , ~ v a l

of

bovine

oocytes failawing vitdca#un. Thwiogendog),

4 8 : ~ ~ .

H a i , S., ~tljimoto,~., and Oguri, N. ?fW. Yibility

of

immature

horse

oocJrtes cryttpksen/ed by vitrification.

Theiogenofogy

42236

Hotdmkligil,

S., Toner, M, and

power,

R.D. 19W.

Changes

in

membrane

integw, cytaskekl stmdum, and dewlopmenhI poterrt.iat

of

mudne awytes after

vitrSffcatlon

in ethylene

gfycol.

Biatogy

lRepro$udon.

55:IBl-168.

Hmurni, T. 2001. Reproductive Biology ahd %fotechnoiogy, Japan Int@matlanal Coopemtion Agency. fndanesia.22-27

HyW,

P.,

Vajta, @. and Caliasen, H. 2041Q. Vitrification of bovine oooytes with the open pulled straw method : Ulfra-structural consequences. MoI. Reprod and Dev 56~80-88

Kasai, Mi 2802. Advances En the ~ryopresewatiorr of rnarnrnafian

-8s

and embryos: Development of ultrarapid vitrification. Reproductive Medleitle and Bidogy. I 1 9 . http:l/www. blaclwell-synergy

.corn/

IinksldoillO.1 MWj.1445781.2002.~00OLP.

Kasai, M. 1996. Simple and effiier'tt methods for vitrification of rnamalian embryos. Anirn. Reprod. Sci 42:67-75.

KUbota, C., Yang, X., Dinnyes, A,. Todoroki, J, Yqrnakuchi,

H,

hlkushita, K, Inohae,

S,

Tabara, .I. 1998.

In

vitro

and

'In

vivo

survival

of frozen-

thawed bovine aocytes after IVF. nuclear

tran$&r

and

parthenogenetic

aEtSvatiun. Mu1 Reprod. And

Dev

51

:281-286.

Kuwayama, M. and Kata, 0. 1999. All-round v'hifmtian methods for human

oocytes

and embryos. Kata

Ladies

Clinic. Tokyo f fN-OQ23, Japan.

lane,

M-B,, Bavister,B.D., Lyons and Forest,

K.T.

1999. Containerkss viprificatiun of mammalians eocves and embrvas.

h t f p : t l w , biotech. nature.com,

Leuni, G., Boglioli,L., bedinguer, F.,

Rasati,

I., Pintus, P.P., bdda, S., Naitana, S. 2002. Defined media for vitrifidon, wdttnlhg and rehydration

:

effects

on pbst-thaw ,protein synthesis and vi&itIty of in vitro derived wine

embryos.

Cryobjelogy :2W212.

Men, H.. Mofibon, R.L.,

Parrih,

J.J.,

and

Rutl&@, J.J. 2003. degeneration of cryopmenred bovine oocytes via

apoptdsb

during subquenf

culture.

Cryobiol~y 47 : 73-81.

-

Otui. T., Yarrlam~b,

K.,

Kqarne,'N.,

TachikaW, S.

and

Suzuki,

T . 1998.

Cryopresenratian

of mature ,bovine by

Yitrifidtion

in straws.

Cryobiobgy

37 : 73 -85

Shaw,

J,M!,

QranWnachai.

A.

and

Trounspn, A.O. 2Q00. Fundmental

cryclhiblugy of rnarmalian oocykw and

wadan

tissue. Tkriqenoiogy

5%. 59-72.

Swn,Q.Y., Yang,

Q.Z.,Liu,

Q.Y., Feng, H.L. and Qin, P.C. 1996.

Cryopresenratians

df

bovine oocytes matured in

uitro,

Thelriogsndogy

TriwulanningsR,

E.

15397. Pembekwn ernhrio derrgsn

bwbagai IcrbpmWcfan

dan

met&e

pambekuan. Prosiding

Seminar

IUasionaI

Petemelcan

Veteriner.

Balai

Pehelitian

Temak.

Bogor

Vajta.

G.

2000.

Vimcation of

bovine mcybs

and

enatstyo.

Embryo Technalogy CemMr, Danish

Institute

af

Prgricultutql

Sciences, Denmark

Wahjuningsih, S

dan Qati,

M.S.

2003.

K ~

aosit

sapi ~Madura untuk ~ b

pelmtahan plasma numb Indanesb, Makdl'ah

ssmioar

Indonwia

Toray

Science

Foundartian,

Jab&

4 Pebrusri 2003.

Wahjuniilgsih, S. 2002. tn

vitm

maturation

of

bovine cwyts derived from

~ o p m e r v a t i o n of

dlmetyi

sulfoxide (DMSO), Glycerol,

and

ethylen

glycol

(IEG). Journal

of

Reprotech;

vd. I. No. 2:9&%