J. Sains MIPA, April 2007, Vol. 13, No. 1, Hal.: 43 - 48 ISSN 1978-1873
ISOLASI DAN KARAKTERISASI MANANASE
EKSTRASELULER DARI Fusarium oxysporum
Sumardi
Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung
Email : sumardi_bio@yahoo.co.id
Diterima 10 Januari 2007, perbaikan 26 April 2007, disetujui untuk diterbitkan 30 April 2007
ABSTRACT
The aims of the research are to isolate and to produce the mannanase enzyme from F. oxysporum. The extracellular of the mannanase was then analyzed for its biochemical characteristics of. The result showed that extracellular -mannanase (endo-1,4- -D--mannanase, EC 3.2.1.78) produced by Fusarium oxysporum grown in palm kernel meal as a carbon source on the 5th day. Supernatant -Mannanase activity was 30.8 U/mg but it was increase up to 123.0 U/mg after precipitation by 60-80% ammonium sulfate. The optimum pH mannanase activity after ammonium sulfate precipitation (concentrated) were two peaks. The first peak was at pH 4.0 and the second peak was at pH 7.0. The optimum temperature was 70oC. The fractions of 60 80% was run on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and then it was detected with zymogram assay. Two -mannanases of 55 kDa and 115 kDa were observed.
Key words : Fusarium oxysporum, extraselullar mannanase, ammonium sulfate precipitation
1. PENDAHULUAN
Enzim mananase adalah enzim ekstraseluler yang mampu menghidrolisis molekul polisakarida manan yang mempunyai ikatan 1-4 ß menjadi manooligosakarida. Kemudian manooligosakarida dapat dihidrolisis oleh enzim manosidase menjadi manosa. Manan merupakan komponen utama dari endosperma kelapa (Cocos nucifera), kelapa sawit (Elaeis guinensis), biji kopi (Coffea canephora var robusta), locust bean gum (Ceratonia siliqua), guar bean (Cyanaposis tetragonoloba), dan akar konjak (Amorpophalus konjak)1). Enzim mananase dapat dihasilkan oleh bakteri dan kapang.
Penelitian sebelumnya oleh Sachslehner et al.2), membuktikan bahwa kapang fitopatogen Sclerotium rolfsii dapat menghasilkan mananase dengan aktivitas enzim yang tinggi (675,1 U/mg). Aktivitas optimumnya pada pH 4 dan suhu 50 C. Sedangkan berat molekul protein enzimnya 46 kDa.
Kapang fitopatogen lainnya, Fusarium oxysporum setelah dilakukan penelitian pendahuluan ternyata tidak mampu menghasilkan enzim amilase, selulase, dan protease. Namun kapang tersebut mampu menghasilkan mananase. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi dan pemurnian mananase dari Fusarium oxysporum serta karakterisasi enzim tersebut yang meliputi pH, suhu, dan berat molekulnya.
2. METODE PENELITIAN
2.1. Isolat kapang
Isolat yang digunakan adalah Fusarium oxysporum yang diperoleh dari koleksi biakan Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi FMIPA Unila.
2.2. Inokulum
Kapang Fusarium oxysporum dari biakan murni dipindahkan ke media Potato Dextrose Agar (air dari ekstraks kentang 200 g, dextrosa 10 g dan agar 15 g dalam akuades 1000 ml), kemudian diinkubasi pada suhu ruangan selama 6 hari.
2.3. Media Produksi
Media produksi dibuat berdasarkan modifikasi dari Mendels and Stenberg3) dengan komposisi (NH4)2SO4 0,14 %, KH2PO4 0,2 %, MgSO4 0,05 %, urea 0,03 %, CaCl 0,03 %, FeSO4.7 H2O 0,0005 %, MnSO4.H2O 0,00016 %, ZnSO4.7H2O 0,00014 %, CoCl2 0,002 %, ekstrak khamir 0,005 %, pepton 0,075 %, dan bungkil sawit 1 % dalam 1000 ml aquades. Bahan-bahan tersebut selanjutnya diaduk sampai larut. Kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dengan sumbat kapas. Kemudian di sterilisasi pada suhu 121 C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit.
Sumardi Isolasi dan Karakterisasi Mananase
2.4. Penentuan Lama Waktu Inkubasi terhadap Produksi Enzim
Erlenmeyer volume 250 ml diisi dengan 50 ml media produksi, kemudian kultur kapang 1x1 cm diinokulasikan. Setelah itu biakan diinkubasi selama 6 hari, pada suhu 37 C. Tingkat pertumbuhan dan fluktuasi aktivitas enzim ditetapkan dengan sampling setiap 1 hari sekali pada hari 0, 1, 2, 3, ke-4, ke-5, dan ke-6. Aktivitas enzim ditentukan dengan metode DNS. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 575 nm.
2.5. Pemurnian Enzim Mananase
Pengendapan dengan Garam Amonium sulfat Secara Terfraksi
Ekstrak kasar enzim yang telah dipisahkan dari sel dengan cara sentrifugasi diendapkan dengan penambahan amonium sulfat pada berbagai tingkat kejenuhan (0-20%, 20-40%, 40-60%, 60-80%, dan 80-100%). Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan magnetik stirer. Pengendapan dilakukan dalam suasana dingin (4oC). Campuran ini didiamkan selama 2 jam dalam lemari es, endapan yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifugasi dan dilarutkan dalam buffer fosfat 0,1 M pH 7,0 (4). Enzim yang mengendap kemudian didialis dalam plastik selofan.
2.6. Karakterisasi Enzim Mananase Pengaruh pH dan suhu
Pengaruh suhu dan pH diamati untuk menentukan kondisi optimum aktivitas enzim -mananase. Suhu optimum ditentukan dengan menginkubasi reaksi enzim pada suhu 25 C, 30 C, 35 C, 40 C, 45 C, 50 C, 55 C, 60 C, 65 C, 70 C, dan 75 C. Sedangkan pH optimum ditentukan dengan uji aktivitas enzim pada pH 3 sampai 10 pada suhu optimum enzim dengan bufer universal. Analisis Elektroforesis Gel dan Zimogram
Elektroforesis dilakukan dimodifikasi dengan cara SDS-PAGE dilakukan dengan gel pemisah (poliakrilamid 8%) dan gel penahan (poliakrilamid 4%). Aktivitas -mananase pada gel dideteksi menggunakan locust bean gum sebagai substrat pada gel pemisah5). Setelah running elektroforesis, SDS pada gel zimogram dihilangkan dan protein mananase direnaturasi6). Gel kemudian diinkubasi pada suhu 65 oC selama 35 menit pada bufer sitrat 0.05 M pH 6.0. Aktivitas -mananase dapat terlihat setelah dilakukan pewarnaan dengan larutan 0.1% merah kongo selama 20 menit dan dilanjutkan dengan pencucian larutan NaCl 1 M selama 10 menit. Analisis elektroforesis nondenaturan dilakukan dengan cara yang sama, namun tanpa penambahan SDS.
Ekstrak kasar enzim
+ (NH4)2 SO4 (0-20%)
+ (NH4)2SO4 (20-40%)
Gambar 1. Skema proses pengendapan enzim dengan penambahan amonium sulfat Supernatan Endapan
(F
1)
Endapan (F2) Supernatan + (NH4)2SO4 (40-60%) Supernatan Endapan (F3) + (NH4)2SO4(60-80%) Supernatan Endapan (F 4) + (NH4)2SO4 (80-100%) Supernatan Endapan (F5)J. Sains MIPA, April 2007, Vol. 13, No. 1
2.7. Pengujian Aktivitas Enzim Mananase
Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan komposisi cairan ekstrak enzim sebanyak 0,5 ml ditambahkan ke dalam 0,5 % larutan manan (locust bean gum) pada buffer sitrat 50 mM pH 6. Kemudian sebanyak 1 ml total volume diinkubasi pada shaker water bath suhu 37 C selama 30 menit. Setelah diinkubasi, ditambahkan 1 ml pereaksi DNS. Kemudian dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit. Setelah itu didinginkan pada air dingin selama 20 menit, agar warna kompleks yang terbentuk stabil pada saat dilakukan pengukuran. Pembacaan dengan spektrofotometer diukur pada panjang gelombang 575 nm7). Kadar manosa yang terbentuk karena aktivitas enzim merupakan kadar manosa hasil degradasi enzim setelah dikurangi kontrol. Satu unit aktivitas enzim adalah banyaknya enzim yang memecah polisakarida manan yang dapat menghasilkan 1 µmol manosa per menit pada kondisi penengujian.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1. Waktu Inkubasi
Pada uji pengaruh lama inkubasi terhadap produksi mananase dari Fusarium oxysporum terlihat bahwa pada awal inkubasi (0-1 hari) belum terlihat adanya aktivitas enzim mananase. Hal ini disebabkan Fusarium oxysporum masih beradaptasi pada lingkungan baru. Aktivitas enzim mulai tampak pada hari pertama dan terus naik secara eksponensial sampai mencapai optimum pada hari kelima, dimana aktivitas yang diperoleh merupakan aktivitas tertinggi yaitu sebesar 3,4 U/ml. Setelah hari kelima, terjadi penurunan aktivitas meskipun masih menunjukkan aktivitas yang cukup tinggi (Gambar 2).
3.2. Pemurnian Enzim Mananase
Berdasarkan hasil pengujian aktivitas enzim mananase, diperoleh aktivitas sebesar 3,3 U/ml pada ekstrak kasar. Hasil pengendapan enzim mananase secara terfraksi bahwa pada frakti 0-20%, 20-40%, dan 40-60% diperoleh aktivitas yang rendah. Pada beberapa fraksi tersebut enzim mananase yang terendapkan sedikit karena terjadi proses salting in pada konsentrasi garam rendah. Pada fraksi 60-80% menunjukkan aktivitas enzim tertinggi yaitu sebesar 10,7 U/ml. Pada fraksi
tersebut pengendapan mananase oleh garam amonium sulfat mencapai optimum (Gambar 3).
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0 1 2 3 4 5 6 7 Waktu (hari) A k ti v it a s U n it ( U /m l)
Gambar 2. Pengaruh waktu inkubasi F. oxysporum dengan aktivitas unit enzim mananase
0 5 10 15 0 - 20 % 20 - 40 % 40 - 60 % 60 - 80 % 80 - 100 % Fraksi Kejenuhan A k ti v it a s U n it ( U /m l)
Gambar 3. Pengendapan enzim mananase dengan garam amonium sulfat secara terfraksi dan dialisis. Dari hasil tahapan pemurnian enzim mananase terlihat bahwa aktivitas spesifik enzim mananase mengalami peningkatan yaitu dari 30,8 U/mg menjadi 123,0 U/mg seperti terdapat pada Tabel 3.
Peningkatan aktivitas spesifik enzim ini terjadi karena tingkat kemurnian enzim semakin tinggi. Dengan demikian makin tinggi tingkat kemurnian enzim maka makin optimal enzim tersebut bekerja. Tingkat kemurnian enzim dihitung berdasarkan perbandingan aktivitas spesifik masing masing tahapan terhadap aktivitas spesifik enzim kasar. Pada tabel menunjukkan peningkatan kemurnian enzim, pengendapan dengan amonium sulfat memberikan tingkat kemurnian sebesar 4,0 kali pada fraksi 60-80%. Aktivitas total mengalami penurunan yang diikuti dengan peningkatan aktivitas Tabel 3. Tahapan Pemurnian Enzim Mananase
Tahapan Pemurnian Volume enzim (ml) Aktivitas Unit (U/ml) Aktivitas Total (Unit) Kadar Protein (mg/ml) Aktivitas Spesifik (U/mg) Tingkat Kemurnian Perolehan (%) Supernatan 380 3,3 1261,6 0,10767 30,8 1 100 Amonium Sulfat (60-80%) 24 10,7 256,3 0,08683 123,0 4 20,3
Sumardi Isolasi dan Karakterisasi Mananase
spesifik dan tingkat kemurnian enzim. Penurunan kadar protein menunjukan bahwa protein lain yang terdapat pada larutan ekstrak kasar dapat dipisahkan dari protein enzim. Penurunan aktivitas total disebabkan oleh larutan ekstrak kasar enzim yang terlalu encer sehingga tidak semua enzim dapat mengendap. Selain itu enzim mengalami kehilangan aktivitasnya selama proses pengendapan dengan amonium sulfat dan dialisis. Penurunan perolehan disebabkan oleh volume larutan enzim yang semakin kecil. Pada pengendapan, fraksi 60 80% memberikan perolehan sebesar 20,3 %. 3.3. Karakterisasi Enzim Mananase
Hasil penelitian menunjukan ada dua puncak aktivitas tertinggi dari fraksi 60-80% terdapat pada pH 4 dengan aktivitas sebesar 18,0 U/ml dan pH 7-8 dengan aktivitas sebesar 8,9 U/ml (Gambar 4). Hasil dua puncak aktivitas mananase ini unik ini dan jarang ditemukan dalam penelitian enzim.
Hasil tersebut diperkuat dengan elektroforesis dimana pada pH 4 dan pH 8 pita enzim mananase terlihat jelas. Sedangkan pada pH 6 dan pH 10 tidak tampak (Gambar 5).
Pita yang muncul pada inkubasi pH 4 mempunyai dengan berat molekul 55 kDa. Dengan demikian jenis mananase pertama yang aktif pada pH 4 adalah mananase dengan berat molekul 55 kDa. Aktivitas mananase pada pH 8 ada tetapi rendah. Dari hasil zimogram pita yang muncul kecil/kurang jelas. Jenis mananase kedua yang aktif pada pH 8 ini adalah mananase dengan berat molekul 115 kDa.
Adanya dua jenis enzim yang mempunyai aktivitas optimum yang berbeda tersebut diduga merupakan dua unit molekul monomer mananase. Fenomena ini diduga merupakan salah satu mekanisme kapang Fusarium mempertahankan diri dari lingkungannya yang tidak menguntungkan. Dengan demikian maka kapang tersebut akan sulit ditanggulangi karena kapang tersebut aktif pada pH 4 ,0 dan pH 8,0.
0 20 40 60 80 100 120 3 4 5 6 7 8 9 10 pH Inkubasi A k ti v it a s R e la ti f (% )
Gambar 4. Pengaruh pH terhadap aktivitas relatif mananase hasil pengendapan amonium sulfat (60-80%) pada buffer universal.
S A B C D
Gambar 5. Zimogram mananase fraksi 60-80%
Keterangan :
S : Standar marker molekul protein
A : Inkubasi pH 4 suhu 370C selama 30 menit
B : Inkubasi pH 6 suhu 370C selama 30 menit
C : Inkubasi pH 8 suhu 370C selama 30 menit
D : Inkubasi pH 10 suhu 370C selama 30 menit
97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 21 kDa 14,4kDa
J. Sains MIPA, April 2007, Vol. 13, No. 1
3.4. Penentuan Suhu Optimum
Berdasarkan uji aktivitas mananase fraksi 60-80% aktivitas enzim tertinggi pada suhu 70 C (Gambar 6).
0 50 100 150 20 30 40 50 60 70 80 Suhu ( C) A k ti v it a s R e la ti f (% )
Gambar 6. Pengaruh suhu terhadap aktivitas relatif mananase hasil fraksi pengendapan amonium sulfat 60-80%.
Pada suhu 70 C tersebut aktivitas enzim sebesar 22,0 U/ml. Peningkatan suhu dapat meningkatkan kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim sampai pada batas tertentu yang optimal8). Suhu yang terlalu tinggi juga dapat menyebabkan perubahan konformasi tiga dimensi enzim yang menyebabkan enzim sukar bereaksi dengan substrat. Pada suhu 70 C konformasi enzim mananase tepat berikatan dengan substrat, sehingga aktivitasnya maksimal. Sebagai pembanding -mananase kapang lainnya, Eupinicillium javanicum aktif pada pH 5,8 dan suhu 50 C, Talaromyces bissachlamydoides aktif pada pH 6 dan 50 oC10), Sclerotium rolfsii aktif pada pH 4 dan 50 oC 11).
3.5. Analisis Berat Molekul Enzim Mananase Enzim mananase hasil pemurnian dianalisis jumlah pita protein dan berat molekulnya dengan elektroforesis SDS-PAGE dan zimogram. Prinsip dari elektroforesis ini, molekul molekul yang bermuatan bergerak dalam larutan ke arah elektroda yang polaritasnya sehingga molekul yang berbeda muatan terpisah12).
Elektroforesis SDS-PAGE dengan penambahan substrat manan (locust bean gum 0,5%) pada gel pemisah dihidrolisis oleh enzim mananase. Substrat tersebut berfungsi untuk mendeteksi keberadaan mananase. Manan yang terdapat pada gel diwarnai dengan congo red 0,1%, molekul yang mempunyai aktivitas mananase tampak berwarna putih, sedangkan yang lain akan berwarna merah. Substrat manan mempunyai ikatan 1-4, , D-manopiranosil yang berikatan dengan congo red sehingga berwarna merah13). Namun apabila mananase memecah substrat
locust bean gum maka akan dihasilkan manosa yang tidak mempunyai ikatan tersebut. Congo red tidak akan terikat kuat dan gel berwarna putih (Gambar 7).
S A B
Gambar 7. Elektroforesis SDS-PAGE dan zimogram enzim mananase
Keterangan :
S : Penanda berat molekul protein (standar protein baku)
A : Supernatan inkubasi pH 4 suhu 70 C selama 15 menit
B : Enzim pada fraksi 60-80% inkubasi pH 4 suhu 70 C selama 15 menit
Hasil SDS-PAGE dan zimogram menunjukan ada 2 pita mananase yang konsisten dengan berat molekul 115 kDa dan 55 kDa dari tahap fraksinasi dengan garam amonium sulfat 60-80% yang dihitung berdasarkan protein baku (standar) yang telah diketahui berat molekulnya dengan membandingkan dengan mobilitas relatif (rf) yang diperolehnya. Pada penelitian lain, -mananase dari Vibrio sp. MA-138 bersifat monomer dengan berat molekul 49 kDa5), demikian pula -mananase dari Bacillus stearothermophilus juga bersifat monomer tetapi dengan berat molekul 76 kDa14).
4. KESIMPULAN DAN SARAN
4.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :
1. Fusarium oxysporum menghasilkan mananase dengan aktivitas tertinggi (3,4 U/ml) adalah waktu panen pada hari kelima dengan pH medium 6,0 dan suhu ruang (29oC).
2. Pemurnian enzim mananase menggunakan metode pengendapan dengan garam amonium sulfat secara terfraksi, mampu meningkatkan aktivitas spesifik enzim mananase dari 30,9 U/mg untuk ekstrak kasar enzim menjadi 123,0 U/mg pada fraksi 60-80% hasil pengendapan amonium sulfat, dengan tingkat kemurnian 4,0 kali.
3. Enzim mananase hasil pemurnian mempunyai pH optimum pada pH 4 dengan aktivitas sebesar 18,0 U/ml dan suhu optimum pada suhu 700C dengan aktivitas sebesar 22,0 U/ml.
97 kDa 66 kDa 45 kDa 30 kDa 20,1 kDa 14,4 kDa 115 kDa 55 kDa
Sumardi Isolasi dan Karakterisasi Mananase
4. Hasil elektroforesis SDS-PAGE dan zimogram dengan pewarnaan congo red menunjukkan ada 2 pita mananase yang konsisten dengan berat molekul 115 kDa dan 55 kDa dari tahap pemekatan dengan garam amonium sulfat 60-80%.
4.2. Saran
Untuk meningkatkan perolehan dan aktivitas enzim yang lebih tinggi perlu diteliti mengenai proses pemurnian dengan cara lain. Selain itu juga perlu diteliti lebih lanjut mengenai karakteristik lain dari enzim mananase Fusarium oxysporum seperti pengaruh pH media terhadap pertumbuhannya, stabilitas suhu, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, inhibitor enzim dalam menghidrolisis bungkil sawit. Uji pengendalian penyakit tanaman yang disebabkan Fusarium oxysporum berdasarkan karakteristik yang didapat dari penelitian ini juga perlu untuk dilakukan.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Program Hibah Kompetisi- A2 Jurusan Biologi FMIPA Unila yang telah mendanai penelitian ini. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Ika Ratna Sari, S.Si yang telah membantu penelitian ini, Dr. Yandri AS, M.Si dan Drs. Bambang Irawan, M.Sc yang telah memberikan masukan sehingga tulisan ini menjadi lebih sempurna.
DAFTAR PUSTAKA
1. Ooi, T., Kikuchi, D. 1995. Purification and some properties of -mannanase from Bacillus sp. World. J. Microbiol. Biotechnol. 11: 310-314.
2. Sachslehner, A., Foidl, G., Foild, N., Gubitz, G. and Haltrich, D. 2000. Hydrolysis of isolated coffee mannan and coffee extract by mannanases of Sclerotium rolfsii. J. Biotechnol. 80: 127-134 3. Mendels, M. and Stenberg D. 1976. Recent
advances in cellulase technology. J. Ferment. Technol . 64: 267-286
4. Bollag, D. M., and S. J. Edelstein. 1991. Protein Methods. A Jhon Wiley & Sons, INC p. 79-80.
5. Tamaru, Y., Araki, T., Amagoi, H., Mori, H., Morishita, T. 1995. Purification and characterization of an extracellular -mannanase from marine bacterium, Vibrio sp. strain MA-138. Appl. Biochem. Biotech. 61: 4454-4458.
6. Spindler, K.D., Rapp, C. 1997. Detection of chitin degrading enzymes on gels. Di dalam Muzzarelli RAA, Peter MG (ed). Chitin Handbook. Italy : Atec Grattamare, Torrette, AN. hlm 243-247.
7. Hossain, Z.M., J.I. Abe, and S. Hizukuri. 1996. Multiple Forms of -mananase from Bacillus sp. KK01. Enzyme and Microbial Technology. Elsevir Science Inc. New York.
8. Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. PAU Bioteknologi-IPB. Bogor.
9. Purwadaria, T., Haryati. T., Darma, J. 1994. Isolasi dan seleksi kapang mesofilik penghasil mananase. Ilmu dan peternakan. 7: 26-29
10. Araujo, A., Ward, O. P. 1990. Extracellular mannanases and galactanases from selected fungi. J. Indust. Microbiol. 6: 171-178
11. Sachslehner, A., Haltrich, D., Gubitz, G., Nidetzky, B., and Kulbe, K D. 1998. Efficient production of mannan degradating enzymes by the Basidiomycete Sclerotium rolfsii. Appl. Biochem. Biotech. 70-72: 939-953
12. Adijuwana, H., Rukmini, H. S. dan Nur, M. A. 1989. Tekhnik Laboratorium untuk Bidang Biologi dan Kimia. IPB. Bogor.
13. Teather, R.M., Wood, P.J. 1982. Used of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterzation of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. Biochem. Biotech.43: 777-780 14. Ethier, N., Talbot, G., Sygusch, J. 1998. Gene cloning, DNA sequencing, and expression of thermostable -mannanase from Bacillus stearothermophilus. Appl. Biochem. Biotech. 64: 4428-4432.
