Prosedur Pengujian Mikrobiologi
untuk Identifikasi Agen Penyebab
Mastitis Subklinis pada Sapi Perah
Daftar Isi
Pendahuluan 1
Bab 1 Cara Penanganan dan Pengambilan contoh 2
1. Bahan pengambilan contoh 2
2. Teknik pengambilan contoh 3
3. Penanganan dan penyimpanan contoh 4
Bab 2 Bahan dan Alat Diagnostik 5
1. Pendahuluan dan informasi umum 5
2. Peralatan yang dibutuhkan 5
3. Lembar kerja (format isian) 6
Bab 3 Prosedur Pengujian 10
1. Pewarnaan Gram 10
2. Uji Katalase 12
3. Uji KOH 13
4. Uji CAMP-Esculin 14
5. Uji Coagulase 15
Bab 4 Prosedur Diagnostik 16
1. Inokulasi contoh susu 16
2. Prinsip kerja 18
3. Contoh yang terkontaminasi 18
Bab 5 Identifikasi Penyebab Mastitis Subklinis 19
1. Proses identifikasi 19
2. Prosedur Identifikasi Penyebab mastitis Subklinis 20
Bab 6 Streptococci 21 1. Pola Hemolysis 21 2. Identifikasi Streptococcus 21 3. Streptococcus canis (SC) 22 Bab 7 Staphylococci 23 1. Pola Hemolysis 23
Bab 8 Coliforms (CO) 24
Bab 10 Uji Sensitivitas Antibiotik (dimodifikasi) 26
1. Tujuan 26
2. Uji Disk diffusion susceptibility 26
3. Catatan 26
Bab 11 Kultur biakan dari Bulk Tank (TPS) 27
1. Prosedur kultur biakan Bulk Tank 27
2. Hasil kultur biakan Bulk Tank 27
3. Hal yang perlu diperhatikan 28
Bab 12 Klasifikasi dan Karakter Mikroba Penyebab 29
Mastitis Subklinis
1. Klasifikasi 29
2. Karaktaeristik dan pengendalian 29
3. Mikroba Penyebab Mastitis yang infeksius 30
4. Penyebab Mastitis dari Lingkungan 35
Daftar Singkatan
Staphylococci Staphylococcus aureus SA
Coagulase Negative Staphylococci CNS
Streptococci
Streptococcus agalactiae SAG
Streptococcus canis SC Other Streptococci (Environmental Streptococci) OS
Coliforms CO
Corynebacterium bovis CB
Others (mikroba lainnya) OTH
Sumber Tulisan; LABORATORY HANDBOOK ON BOVINE MASTITIS (NMC)
Microbiological Procedures for Use in the Diagnosis of Bovine Mastitis (NMC)
1
Pendahuluan
Mastitis merupakan masalah yang sering ditemui diseluruh dunia. Kondisi mastitis berbeda-beda tergantung pada daerah/ Negara, tapi metode yang digunakan untuk pengendalian mastitis pada dasarnya sama.
Penyebab utama mastitis adalah mikroorganisme, oleh karena itu sangat penting untuk melakukan proses identifikasi mikroba dari susu dan sapi yang terkena mastitis sehingga pada akhirnya bisa dibuat satu program untuk pengendalian mastitis tersebut. Jika anda ingin melaksanakan program pengendalian mastitis, pengujian bakteriologis susu santa penting dilakukan karena mastitis merupakan penyakit yang infeksius (menular).
Contoh susu dari seluruh sapi dari satu kelompok ternak yang bermasalah harus diambil dan kemudian dibiakan di laboratorium. Dan perlu juga ditambahkan dalam mengidentifikasi mikroba penyebab mastitis di suatu kelompok ternak maka perlu juga dilakukan pengujian sensitivitas antibiotika untuk menentukan jenis antibiotika mana yang ampuh dan efektif dalam pengobatan mastitis nanti. Selain itu tujuan lain dari pengujian bakteriologis ini adalah untuk mengetahui ternak mana saja yang menghasilkan prognosis mastitis yang jelek, sehingga bisa diambil langkah selanjutnya pada ternak sakit tersebut.
Pengujian untuk identifikasi mikroba penyebab mastitis yang cepat dan murah sangat penting sekali dilakukan. Dalam buku petunjuk ini terdapat metode identifikasi dan pengujian mikroba penyebab mastitis yang murah, mudah dan cepat yang bisa dilakukan oleh para praktisi.
Juli 2009
JICA Short-term Expert
ANRI Akira, DVM, PhD
JICA Counterpart
3
Bab 1 Penanganan dan Pengambilan Contoh Susu
Pengambilan contoh harus dilakukan se-aseptik mungkin. Kualitas contoh sangat penting dalam prsedur diagnostic.
1. Bahan dan Alat Pengambilan Contoh
Sterile tubes Kapasitas 5-15ml
Glove Mencegah kontaminasi dari tangan
Kapas steril Direndam dalam alcohol 70%
Ice Pendinginan contoh
Rak Menyimpan contoh
Teat dip Desinfeksi putting setelah pemerahan
Lap bersih Mengeringkan putting sebelum
pemerahan
Spidol marker Identifikasi sampel
Syringe 5-10 ml Pengambilan sampel air atau lainnya
CMT paddle CMT reagent
2. Teknik Pengambilan contoh
Sangat direkomendasikan untuk mengikuti prosedur di bawah ini ketika mengambil contoh susu untuk dibiakkan di laboratorium.
(1) Ambil sampel susu pada pemerahan terakhir.
(2) lap/ bersihkan seluruh putting menggunakan kertas tisu, dimulai dari putting yang terjauh dari pengambil sampel.
(3) Gosok lubang putting menggunakan kapas beralkohol dimulai dari putting terjauh dari pengambil sampel.
(4) jika sampel yang diambil adalah sampel quarter (jumlah ternak sedikit), ambil sekitar 2,5 ml setiap putting, jika mengambil sampel komposit (jumlah ternak banyak) ambil jumlah yang sama dari setiap putting dimulai dari putting yang terdekat dengan pengambil sampel. Usahakan tabung sampel dengan posisi miring 45-60 derajat dan tidak menyentuh permukaan putting atau tangan pengambil sampel.
(5) celup putting dengan desinfektan setelah pengambilan sampel selesai. Sangat penting untuk menyiapkan putting yang kering dan bersih sebelum pengambilan sampel serta cara pengambilan sampel yang benar untuk mencegah terjadinya kontaminasi sampel, karena jika terjadi kontaminasi akan menyebabkan hasil yang diharapkan menjadi bias. Ikuti cara pengambilan sampel seperti yang tercantum di atas.
5
3. Penanganan dan Penyimpanan Contoh
Setelah pengambilan sampel, tempatkan tabung sampel pada rak didalam coolbox yang diisi dengan es. Secepat mungkin kirim sampel ke lab dalam suhu 5 C.
Bab 2 Bahan dan Alat Diagnostik
1. Pendahuluan dan Informasi Umum
Peralatan yang dibutuhkan untuk identifikasi dan diferensiasi kuman penyebab mastitis tergantung pada kebutuhan dan tingkatan/ kemampuan pengujian yang akan dilakukan. Peralatan yang canggih/ kompleks tidak diperlukan untuk pengujian rutin mastitis pada sapi perah. Namun sekarang sudah banyak media-media diagnostic yang khusus untuk identifikasi kuman penyebab mastitis. Staphylococci, Streptococci, CO dan CB dapat tubuh pada 5% sheep blood agar.
2. Peralatan yang diperlukan:
(1) incubator (37 C), Refrigerator, Microscope, Autoclave (2) Peralatan lain yang dibutuhkan (optional):
Ose (10 dan 1 micro litter), Cotton swab, tabung untuk coagulase test, Microscope slides, Spreader (batang penyebar), pinset, Bunsen burner (Alcohol bunsen), CMT paddle, gelas Beaker, Pipette, sterilized tips, Syringe dengan jarum 18G , kaca pembesar
(3) Media agar:
5% sheep blood agar, Muller-Hinton agar (4) Reagent:
CMT reagent, Rabbit plasma, Esculin discs#, Antibiotic sensitivity discs, Aquadest sterile, ethanol murni/ alcohol 96%, alcohol 70%
(5) Others:
Biakan S. aureus dengan beta hemolysin dan Strep. Agalactiae (untuk CAMP test)
# Prosedur pembuatan esculin discs
1. Sterilisasi cakram kertas (diameter 6mm) yang dibungkus dengan alumunium foil (1 bungkus 50 cakram) menggunakan autoclave (121 C, 15 menit)…… (1)
2. Menyiapkan larutan Pepton (100 ml) : aquadest 100 ml+ Pepton 1 gr + Garam 0,5 gr …….. (2)
3. (2) + esculine 0,1 gr + Ferric Citrate 0,05 gr kemudian larutkan dengan cara dididihkan …….. (3)
7
6. Tuangkan (4) ke (5) dan sisa laturan dibuang.
7. Keringkan menggunakan sterilisasi panas (55 C selama 2 hari)… (6) 8. Setelah kering kemudian disimpan dalam lemari pendingin.
3. Lembar Kerja / Format isian
Ada tiga jenis lembar kerja (contoh kuartir , contoh komposist, dan contoh bulk tank).
A:LF B:LR C:RF D:RR No.
No. CAMP Esc. No. Coag. SA CNS SAG OS CO CB OTH P DX E K T CZ
A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D Culture: / /
Work Sheet for the Identification of Mastitis Causative Pathogens (Quarter milk samples)
Cow ID Antibiotic Sensitivity Remark
Owner:
Strep. Staph. Mastitis Causative Pathogen Q
9
No.
No. CAMP Esc. No. Coag. SA CNS SAG OS CO CB OTH P DX E K T CZ
Work Sheet for the Identification of Mastitis Causative Pathogens (Composite milk samples)
Owner： Culture： / / /
No.
No. CAMP Esc. No. Coag. SA CNS SAG OS CO CB OTH P DX E K T CZ Rank
Work Sheet for the Identification of Mastitis Causative Pathogens (Bulk milk samples)
Culture： / / /
11
Bab 3 Prosedur Pengujian
1. Pewarnaan Gram
Buat/ siapkan preparat ulas yang sudah dikeringkan:
(1) Buat preparat ulas dari biakan murni dengan cara mencampur biakan dengan 2-3 mata ose aquades steril.
(2) Tandai preparat ulas dengan pensil.
(3) Kering udarakan dan kemudian difiksasi dengan cara melewatkan pada api. Prosedur:
(1) Teteskan crystal violet pada preparat ulas selama 60 detik. (2) Cuci dengan air mengalir
(3) Teteskan Gram’s iodine dua kali selama 60 detik. Keringkan jangan dicuci. (4) Lakukan proses pemucatan 95% alcohol sampai warna menjadi pucat. (5) bilas dengan air mengalir.
(6) Teteskan larutan safranin (fuchsin) dan diamkan selama 30 detik. (7) Bilas dengan air mengalir.
CONTOH TEMUAN MIKROSKOPIK BAKTERI SUSU Gram positive cocci (Staphylococci)
Sama seperti gambaran histologis paru-paru atau kelenjar ambing
Gram positive cocci (Streptococci)
Cocci atau ovoid
Gram negative batang (Escherichia coli)
Batang pendek
Gram positive batang (Corynebacterium bovis)
13
2. Catalase test
Prosedur:
(1) Satu tetes larutan 3% hydrogen peroxide (Oxydol) pada microscope slide. (2) ambil satu koloni kuman dengan larutan hydrogen peroxide tersebut.
Interpretasi:
+ Staphylococci, CB
- Streptococci
+: terbentuk gelembung gas - : tidak ada reaksi
Perhatian:
Sel darah merah menghasilkan katalase. Hindari mengambil agar darah dengan koloni kuman, karena akan memberikan reaksi positif palsu.
3. KOH test
Metode yang sederhana dan efektif untuk melanjutkan proses pewarnaan Gram adalah Uji KOH. Bahan yang digunakan hanya KOH 3% dan biasanya hasilnya sangat berhubungan erat sekali dengan hasil pewarnaan Gram.
KOH 3% dalam jumlah yang sedikit diteteskan pada slide glass. Satu mata ose koloni kuman dicampurkan dengan larutan KOH tersebut. Jika menghasilkan larutan yang kental dalam waktu 5 – 30 detik, dan jika ose diangkat menghasilkan seperti benang maka bakteri yang diperiksa adalah Coliform. Jika tidak maka adalah bakteri gram positif.
+ Gram Negative (CO)
- Gram Positive (Staphylococci)
+: campuran menjadi kental dan seperti gel - : campuran tetap cair
Positive
15
4. CAMP-Esculin test
Untuk identifikasi Streptococus, lakukan uji CAMP pada seluruh koloni yang diduga koloni Strep. S. Aureus yang beta hemolysis di goreskan pada bagian tengah plate agar darah domba 5%. Satu atau dua koloni dari suspek strep di goreskan tegak lurus terhadap gorean SA tadi dengan jarak 5 mm dari tengah ke pinggir., sebagai control positif maka lakukan goresan SAG murni pada agar tersebut dengan cara yang sama dengan suspek.
Jika hasil uji CAMP positif, lanjutkan uji eskulin pada koloni yang positif dengan cara menempelkan cakram eskulin pada koloni tadi (tengah-tengah goresan). 30 menit kemudian diamati hasilnya. Jika warna cakram berubah dari putih menjadi coklat atau hitam berarti ujinya positif. Jika CAMP positif dan eskulin negative maka koloni suspek adalah koloni Strep. Agalactiae.
CAMP Esculin hydrolysis Species
+ + OS
+ - SAG
- + OS
- - OS
CAMP+: bentuk mata panah dengan hemolisis komplit pada daerah hemolisis beta SA
CAMP- : tidak ada reaksi
Esculin hydrolysis+: berubah warna dari putih jadi coklat/hitam Esculin hydrolysis-: tidak ada reaksi (putih)
CAMP positive
5. Coagulase test
Uji Koagulase untuk membedakan antara SA dengan CNS (koagulase negative Staph)
prosedur:
Inokulasi 0.5 ml coagulase rabbit plasma dengan inokulum Staphylococci dari plate biakan kuman.
Inkubasikan 37 C selama 1-2 hari. Hasil:
Hasil positif (terjadi koagulase) dapat terlihat dalam 2-4 jam atau sampai dengan 24 jam.
+ SA
- CNS
Coagulase+: terjadi koagulasi
Coagulase-: tetap cair setelah 24 jam
Positive Negative
17
Chapter 4
Prosedur Diagnosa
1. Inokulasi Contoh Susu
(1) Penyebaran Inokulum
Sampel susu kuartir : satu plate agar darah 5% untuk satu sapi
Teteskan 0,01 ml susu dengan menggunakan ose, kemudian susu digoreskan di tiap kuadran plate agar darah 5%
Sampel susu komposit : satu plate agar darah 5% untuk dua sapi.
Teteskan 0,05 ml dengan pipet steril dan kemudian disebarkan menggunakan batang penyebar ke setengah permukaan agar dengan perbandingan yang sama. Cow ID A B C D Cow ID Cow ID A:LF, B:LR, C:RF, D:RR
Quarter Milk Sample Composite Milk Sample
(2) Inkubasi Biakan
Suhu yang digunakan untuk inkubasi biakan adalah 37 C. Biakan diamati setelah 20 jam untuk koloni Streptokokki, Staphylokokki, Koliform dan kemudian diinkubasikan lagi selama 24 jam untuk mendeteksi adanya Corynebacterium
bovis.
Mikroorganisme Masa Inkubasi Staphylococci
20 jam Streptococci
Coliforms
19
2. Prinsip-Prinsip
Banyak bakteri penyebab mastitis bisa diisolasi dari lingkungan sekitar sapi. Bakteri bakteri tersebut jika jumlah koloniyang tumbuh di atas 5 koloni dengan ukuran dan warna yang sama, hasil diagnosanya signifikan. Pada kasus
Staphylococcus aureus , jika hanya satu koloni yang tumbuh ini merupakan hasil
yang signifikan.
Infeksi campuran biasanya jarang terjadi (di bawah 5%). Jika hasil dari pembiakan sering ditemukan dua atau lebih jenis bakteri dari sampel susu kuartir, mungkin hal ini disebabkan adanya kontaminasi atau cara pengambilan sampel yang salah (tidak hygiene).
Setelah 20 jam amati hasil dari pembiakan. Pada waktu itu, hampir semua bakteri yang terdeteksi adalam gram positif kokus. Jadi sangat penting untuk dilakukan klasifikasi antara Staphylokoki dengan Streptokoki berdasarkan ukuran dan bentuk koloni.
Kolofirm (CO) jarang terdeteksi pada saat ini. Jika CO menginvasi alveoli, akan berkembang dengan cepat dan menghasilkan gejala klinis.
CB tidak biai terdeteksi dalam 20 jam pembiakan. Untuk mendeteksi CB diperlukan waktu inkubasi di atas 36 jam.
3. Sampel Yang Terkontaminasi
Contoh susu yang tidak terkontaminasi dari sapi yang sehat, ambing yang sehat biasanya tidak mengandung bakteri.
Pada saat ditemukan jenis bakteri lebih dari tiga yang berasal dari susu kuartir, hal ini kemungkinan disebabkan adanya kontaminasi dan contoh tidak bisa diuji karena terkontaminasi.
BAB 5
Proses Identifikasi agen Penyebab Mastitis Sub
Klinis
1. Proses Identifikasi
Gambar di bawah ini sangat bermanfaat dalam mengidentifikasi agen penyebab mastitis subklinis, dengan menggunakan bahan sederhana, cepat dan murah. Hal yang paling dasar dalam identifikasi agen penyebab mastitis subklinis adalah karakteristik koloni (ukuran, warna, pola hemolisis).
Species Karakteristik Koloni
Warna Warna
Staphylococci Kecil- sedang Putih atau kuning
Streptococci kecil Tidak berwarna (basah, cembung,
tembus pandang) Catalase Test Catalase Test ＋ ＋ Staphylococci
Staphylococci StreptococciStreptococci ー ー KOH Test KOH Test ＋ ＋ CO CO CNSCNS ー ー
Jika tidak bisa membedakan antara Staphylokokus dengan Streptokokus berdasarkan koloni, maka dilanjutkan pengujian Katalase (pengujiannya sangat mudah) dan selanjutnya untuk membedakan antara Koliform dengan Staphylokoki dengan menggunakan uji KOH.
