METODE ANALISIS RESIDU PESTISIDA LINDAN DALAM
DAGING SECARA CEPAT DAN MUDAH DENGAN
KHROMATOGRAFI GAS
(A Quick and Easy Method for Lindane Pesticide Residue Analysis
in Tissue by Gas Chromatography Detection)
YUNINGSIH dan S. YULIASTUTI
Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata No. 30, Bogor 16114
ABSTRACT
A quick and easy method have been improved for determination lindane residue in tissue by extraction of sample with acetonitrile containing 1% acetic acid, then addition of anhydrous magnesium sulfate and sodium acetate. After centrifugation, acetonitrile extract underwent is clean- up by using catridge C18 and magnesium sulfate, then its filtrate is evaporated and detected by gas chromatography (GC) with electron capture detector. Validation of improved method can be conducted are recovery, linearity, repeatability (precision) and limit of detection (LOD). The result of recoveries after adding 0.10, 0.25 and 0.50 ug. (in triplicates) lindane standard solution in tissue sample: mean of recoveries are 78.29, 102.67 and 106.33% which its in range 70 – 110%. Linearity (correlation coefisient) r2: 0.9862 is nearly 0.99, precision (relative standard deviation, RSD): 2.66% is lower than 15%. Validation result is in range of Validation Acceptance Criteria for Analysis Pesticide Residues, so this improved method is quite significant with LOD: 0.03125 ± 0.0223 ng.
Key Words: Lindane Pesticide Analysis, Tissue, Gas Chromatography
ABSTRAK
Telah dilakukan pengembangan metode analisis residu pestisida lindan dalam daging secara cepat dan mudah dengan cara ekstraksi sampel dengan larutan 1% asetat dalam asetonitril dan tambahkan anhydrous magnesium sulfat dan sodium asetat. Hasil ekstraksi disentrifus dan filtratnya dimurnikan melalui catridge C18 dan magnesium sulfat dan hasil pemurnian dievaporasi dan dideteksi dengan kromatografi gas (KG).
Dilakukan uji validasi terhadap pengembangan metode: uji perolehan kembali dengan penambahan 0,10, 0,25 and 0,50 ug. larutan standar lindan kedalam sampel daging (3 ulangan), linearitas, presisi dan penetapan limit deteksi. Hasil uji validasi menunjukkan rata- rata uji perolehan kembali: 78,29; 102,67 dan 106,33% masuk dalam kisaran 70 – 110%. Linieritas dengan koefisien korelasi: r2: 0,9862 mendekati 0,99, presisi dengan deviasi simpangan baku; 2,66% masih jauh di bawah 15%. Keseluruhan hasil uji validasi masuk dalam ketentuan kriteria uji validasi analisis residu pestisida, maka pengembangan metode analisis residu pestisida lindan dalam daging cukup valid dengan limit deteksi: 0,03125 ± 0,0223 ng.
Kata Kunci: Analisis Pestisida Lindan, Daging, Kromatografi Gas
PENDAHULUAN
Awal tahun 1940 – 1960 mulai perkembangan insektisida sintetik, terutama tipe insektisida senyawa lipophilic organoklorin (DDT, lindan, klordan dsb.) yang mempunyai sifat persisten dan terakumulasi (residu) dalam lemak dan sangat berbahaya bagi manusia yang mempergunakannya. Maka pemerintah mengeluarkan peraturan No. 7
tahun 1973 (KOMISI PESTISIDA,1997), yaitu pestisida yang boleh diedarkan, disimpan dan digunakan adalah pestisida yang terdaftar atau izin Menteri Pertanian. Dengan adanya peraturan ini akan mengurangi kebebasan dalam pemakaian pestisida dan harus mengikuti aturan dosisnya sehingga pestisida dapat digunakan secara efektif. Menurut KUSPARTOYO (1991), bahaya penggunaan pestisida yang tidak sesuai aturan dari beberapa
macam pestisida (4-5 jenis campuran pestisida) dalam satu kali penyemprotan akan menaikkan konsentrasi bahan aktif sampai 0,4 – 0,5% dan mengakibatkan kontaminasi terhadap produk pertanian (bahan baku pakan) dan akan menyebabkan residu pada produk ternaknya.
Pestisida lindan, salah satu insektisida dari golongan pestisida organoklorin kebanyakan masih terdeteksi residunya pada produk ternak (dari daging) sampai level 135,5 ppb dan 55,2 ppb lindan dalam daging sapi yang masing- masing berasal dari daerah Bogor (Jawa Barat) dan Lampung.(INDRANINGSIHet al., 2004).
Begitu juga menurut SAHAGUN et al. (1998) bahwa residu lindan dan heptaklor epoksida merupakan 2 dari 9 jenis pestisida yang paling banyak ditemukan dalam jenis ikan rainbow trout di provinsi Leon (Spanyol).
Masih dominannya residu lindan dalam produk ternak dan sangat berbahaya bagi yang mengkonsumsinya, maka perlu mengetahui keberadaan residunya dengan cara melakukan pemeriksaan daging terhadap residu pestisida. Sementara metoda analisis residu pestisida dalam daging memerlukan beberapa macam bahan kimia organik (asetonitril, petroleum eter, metanol, aseton, eter, heksan) yang cukup mahal harganya dan tahapan ekstraksinya cukup panjang (SCHENK dan WAGNER, 1995). Begitu juga hasil modifikasinya dengan cara mengurangi jumlah volumenya dari masing- masing bahan kimia organik tersebut (YUNINGSIH dan YULIASTUTI, 2005), masih memerlukan biaya cukup mahal. Maka pada penelitian ini dicoba modifikasi metoda menurut LEHOTAYet al., 2005), metoda cepat, mudah dan sedikit memerlukan bahan kimia (lebih murah), cukup 2 macam bahan kimia organik (asetonitril dan asam asetat) dan powder magnesium sulfat dan sodium asetat untuk preparasi ekstraknya, kemudian pemurnian ekstrak dengan menggunakan catridge C18 dan siap diinjeksi pada alat
kromatografi gas.
MATERI DAN METODE
Sebagai bahan pemeriksaan yaitu berupa daging sapi asal pasar tradisional di daerah Bogor, kemudian dihomogenkan dengan cara dihancurkan dengan menggunakan alat homogenizer.
Kemudian dilakukan pemeriksaan daging yang telah dihomogenkan tersebut terhadap residu pestisida lindan dengan menggunakan metode yang akan dikembangkan yang terdiri dari 2 tahap, yaitu:
Pengembangan metode
Pengembangan metode dilakukan dengan cara modifikasi metode menurut LEHOTAY et al. (2005) dan diagram metodenya sebagai berikut:
5 g sampel daging + 15 ml 1% asetat dalam asetonitril + 6 g MgSO4 + 1,5g Na- asetat
kocok (alat vortex) selama 5 menit, sentrifuse 2500rpm, selama 10 menit
masukkan filtrat kedalam gelas piala yg berisi 150 mg MgSO4 dan filtratnya masukkan
kecatridge C18 (Sep Pak C18)
eluate dikeringkan dengan alat rotary evaporator dan injeksi pada alat kromatografi
Kondisi alat: suhu kolom: 200οC, suhu detektor: 300oC, suhu injektor: 220oC, kecepatan alir gas: 30ml/menit, detektor: electron capture detector (ECD) dan isis kolom: campuran 1,5% OV17, 1,95%OV 210 chromosorb WHP.
Evaluasi pengembangan metode
Uji perolehan kembali
Dilakukan uji validasi terhadap hasil pengembangan metode, yaitu uji perolehan kembali dan caranya sebagai berikut:
Timbang 5 gram daging yang telah dihomogenkan sebanyak 10 kali (10 sampel daging) dan tambahkan 0,10ug, 0,25ug dan 0,50ug standar lindan yang masing- masing 3 ulangan (9 sampel) dan 1 ulangan untuk blanko (tanpa penambahan standar lindan) dalam tabung sentrifus propylene dan lanjutkan ekstraksi seperti telah dilakukan diatas.
Uji linearitas
Dilakukan injeksi dari larutan standar lindan dengan 5 macam konsentrasi: 0,125, 0,250, 0,500, 1,00 dan 2,00 ppb dengan 3 ulangan untuk masing- masing konsentrasi dan dihitung koefesien korelasinya (r2).
Penetapan limit deteksi (Limit of detection, LOD)
Dilakukan 6 kali injeksi ulang dari konsentrasi standar lindan terendah yang terdeteksi dan hitung simpangan bakunya (Standard Deviation, SD) dari hasil peak areanya.
Presisi
Dilakukan 7 kali injeksi ulang dari konsentrasi standar lindan dengan konsentrasi 2,0 ppb dan hitung deviasi simpangan baku (Relative Standard Deviation, RSD) dari hasil peak areanya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengembangan metode
Metode analisis residu pestisida menurut LEHOTAYet al. (2005) menunjukkan cara kerja yang cepat dan mudah (lihat diagram prosedur), pada tahap preparasi ekstrak cukup dilakukan pengocokan sampel dengan asetonitril yang mengandung asetat yang berfungsi melarutkan lipophilic pesticide dan asetat untuk mengkondisikan p.H supaya stabil. Kemudian tahap pemurniannya cukup penambahan powder MgSO4 dan Na-asetat,
keduanya berfungsi mengikat sisa air dan mengikat komponen-komponen lain. Hasil filtrat ditambahkan sedikit MgSO4 (150 mg)
dan dialirkan melalui catridge C18 (tanpa
kondisi) dengan kecepatan 3 tetes/detik. Catridge ini hanya berfungsi sebagai penyaringan dan berlainan dengan metode
sebelumnya (SCHENCK et al., 1996;
YUNINGSIH dan YULIASTUTI, 2005), bahwa pemakaian catridge harus dikondisikan (penambahan pelarut pestisida) dan berfungsi untuk pengikatan pestisida.
Pemakaian PSA (primary secondary amine) dalam pemurnian terutama untuk sampel yang mengandung lemak tinggi dan lebih efektif untuk pemurnian pada sampel telur yang dapat mengadsorbsi lebih banyak komponen-komponen yang terdapat didalamnya (kolesterol) (LEHOTAY et al., 2001). Begitu juga dengan pemakaian catridge C18 tingkat
kemurnian sampel sangat dipengaruhi oleh kandungan lemaknya, semakin tinggi kandungan lemaknya semakin kecil hasil uji perolehan kembalinya (LEHOTAYet al., 2005). Sementara sampel daging umumnya mengandung lemak rendah maka untuk pemurnian ekstrak cukup pemakaian C18 dan
ternyata memperoleh uji perolehan kembali yang baik (70 – 110%). Disamping itu C18
merupakan adsorben terbaik dalam pemurnian baik dalam bentuk kolom SPE (solid phase extraction) maupun bentuk powder (tidak dipadatkan) dalam kolom SPE (LEHOTAY et al., 2001).
Evaluasi pengembangan metode
Uji perolehan kembali
Setiap evaluasi pengembangan metode harus diuji keabsahannya (valid), dengan cara uji perolehan kembali terhadap pengembangan metode tersebut.
Hasil uji perolehan kembali dari hasil pengembangan metode dengan penambahan 0,10 ug, 0,25 ug dan 0,50 ug larutan standar lindan (3 ulangan), menunjukkan rata-rata: 78,29, 102,67 dan 106,33% (lihat Tabel 1.), dan ketiganya masuk dalam kisaran kriteria analisis residu pestisida yang diterima (70 – 110%) (SINGLE LABORATORY VALIDATION ACCEPTANCE CRITERIA, 2006).
Uji linearitas
Setiap evaluasi pengembangan metode diperlukan uji keabsahan (uji validasi) dari larutan standar yang dipergunakan dengan mengetahui keberadaan hubungan antara luas peak dengan konsentrasinya (variasi konsentrasi) larutan standar. Telah dicoba injeksi 5 variasi konsentrasi larutan standar lindan (3 ulangan) dan hasil luas peaknya terlihat pada Tabel 2. Kemudian hasil
Tabel 1. Hasil perolehan kembali setelah penambahan larutan standar lindan Ulangan Penambahan standar
lindan (ug) Hasil perolehan kembali (ug) Hasil perolehan kembali (%) Rata-rata perolehan kembali (%) 1 0,10 0,0969 96,90 2 0,10 0.0727 72,70 78,29 3 0,10 0,0653 65,30 1 0,25 0,200 80,00 2 0,25 0,280 112,00 102,67 3 0,25 0,290 116,00 1 0,50 0,520 104,00 2 0,50 0,550 110,00 106,33 3 0,50 0,525 105,00 Blanko - - - -
perhitungan nilai koefisien korelasi (r2) yang terbaik adalah: 0,9862 (mendekati nilai 0,99), yang menunjukkan adanya hubungan yang linear antara konsentrasi standar lindan dengan luas peak, maka kondisi (kualitas) larutan standar lindan cukup baik (valid).
Tabel 2. Hasil luas peak dari injeksi 5 variasi konsentrasi standar lindan (3 ulangan)
Luas peak Konsentrasi lindan (ng/ml) 1 2 3 0,125 36950 36840 34650 0,250 87490 90930 83730 0,500 15152 14899 14134 1,000 30249 30506 30388 2,000 49222 49540 49004 r2 0,9862 0,9859 0,9857
Limit deteksi (Limit of Detection, LOD) Konsentrasi terkecil dari larutan standar lindan yang dapat terdeteksi oleh alat atau nilai limit deteksi (LD) adalah pada konsentrasi 0,0625 ng/ml dengan volume injeksi 2 ul (0,03125 ng/ml dalam 1 ul). Untuk memperoleh ketepatan nilai dari konsentrasi limit deteksi tersebut telah dilakukan 6 kali injeksi ulang dan dihitung standar deviasinya
(SD) dari hasil luas peaknya. Sementara rumus limit deteksi: LD ± 3SD, maka limit deteksinya: 0,03125 ± 3 x 0,0074= 0,03125 ± 0,0023 ng/ml (lihat Tabel 3).
Tabel 3. Luas peak dari konsentrasi larutan standar lindan terkecil yang terdeteksi (6x injeksi ulang) Ulangan Konsentrasi standar lindan terkecil yang terdeteksi (ng/ml) Luas peak 1 0,0625 1864 2 0,0625 2064 3 0,0625 2048 4 0,0625 1762 5 0,0625 2234 6 0.0625 1692
Rata- rata (luas peak) 1944
SD (luas peak) 222
SD (ng/ml) 0,0074
3 SD (ng/ml) 0,0223
LD (ng/ml) 0,03125 ± 0,0223
Nilai limit deteksi: 0,03125 ± 0,0223 ng Presisi
Kestabilan larutan standar dapat diketahui dengan menentukan besar standar deviasi dan relative standar deviasi (RSD) luas peak dari hasil injeksi ulang larutan standar tersebut. Hasil luas peak dari 8 kali injeksi ulang dari larutan standar lindan dengan konsentrasi 2,0 ng/ml (volume injeksi 2 ul) menunjukkan nilai RSD: 2,66% (2072,5 : 77796 x 100%) (lihat Tabel 4), yang jauh di bawah 15% sebagai ketentuan kriteria RSD yang diterima (SINGLE LABORATORY VALIDATION ACCEPTANCE CRITERIA, 2006).
Tabel 4. Hasil luas peak dari 8x injeksi ulang larutan standar lindan dengan konsentrasi 2,0 ng/ml Ulangan Konsentrasi standar lindan (ng/g) Luas peak Simpangan baku 1 2,0 80852 3062 2 2,0 74776 3020 3 2,0 79837 2041 4 2,0 77860 64 5 2,0 72526 5270 6 2,0 78372 576 7 2,0 78519 723 8 2,0 79620 1824 Rata-rata 77796 SD 2072,5 RSD 2,66%
Metode ini lebih mudah, murah dan cepat dalam tahapan ekstraksinya bila dibandingkan dengan metoda sebelumnya yaitu analisis residunya melalui 2 tahap, ekstraksi fase padat (solid phase extraction, SPE) dan pemurnian melalui kolom florisil dan deteksi dengan alat khromatografi gas SCHENK and WAGNER (1995). Kemudian metoda menurut YUNINGSIH dan YULIASTUTI (2005), yaitu modifikasi metoda menurut SCHENK dan WAGNER (1995) tersebut dengan cara menghilangkan jenis bahan kimia yang tidak sesuai dengan kelarutan pestisida lindan dalam pemurniannya dan prinsip dalam analisis residu pestisida adalah ekstrak asetonitril sebagai pelarut pestisida dan pemurnian melalui catridge C18
dan florisil kolom. Kemudian sebagai perbandingannya dalam pemakaian bahan
kimia dengan metoda sebelumnya sebagai berikut: Metode sebelumnya Pengembangan metode Preparasi ekstraksi asetonitril asetonitril+ MgSO4+ Na asetat Pemurnian C18 dan florisil MgSO4 dan
C18
Pada metode sebelumnya dalam tahap pemurnian membutuhkan 3 macam bahan kimia (petroleum, aseton, metanol) untuk kondisi C18 dan bahan florisil yang cukup
mahal, sedangkan pada pengembangan metoda hanya membutuhkan MgSO4 dan Na asetat
yang cukup murah dan C18 hanya berfungsi
sebagai penyaringan (tanpa kondisi).
KESIMPULAN
Hasil evaluasi pengembangan metode (modifikasi metode), dengan uji perolehan kembali rata-rata: 78,29, 102,67 dan 106,33% (mendekati 100%), linearitas larutan standar lindan r2: 0,9862 (mendekati 0,99), kemudian RSD: 2,66% (jauh di bawah 15%), maka dapat diambil kesimpulan bahwa pengembangan metode analisis residu pestisida lindan dalam daging cukup baik (valid) dengan limit dteksinya: 0,03125 ± 0,0223 ng/ml. Pengembangan metode residu pestisida lindan ini cukup mudah, cepat dan efektif baik dalam penggunaan bahan kimia maupun waktu analisisnya.
DAFTAR PUSTAKA
INDRANINGSIH, Y. SANI, R. WIDIASTUTI, E. MASBULAN and BONWICK. 2004. Minimalization of pesticide resdiues in animal products. Pros. Seminar Nasional Parasitologi dan Toksikologi Veteriner. Balai Penelitian Veteriner dan Department for International Development, hlm. 105 – 126.
KOMISI PESTISIDA. 1997. Pestisida Higiene Lingkungan. Komisi Pestisida, Departemen Pertanian, Jakarta. hlm. 1.
KUSPARTOYO. 1991. Daging asal ternak bisa tercemar pestisida? Ayam dan Telur 69: 33 – 35.
LEHOTAY, S.J., A.R. LIGHTFIELD, J.A. HARMAN-FETCHO dan D.J. DONOGHUE. 2001. J. Agric. Food Chem.49: 4589 – 4596.
LEHOTAY, S.J., K. MASTOVSKA dan S.J. YUN. 2005. Evaluation of Two Fast and Easy Methods for Pesticide Residue Analysis in Fatty Food Matrixes. J. AOAC International. 88(2): 630 – 638.
SAHAGUN ,A.M., M.T. TERAN, J.J. GARCIA, M. SIERRA, N. FERNAMNDEZ dan M.J. DIEZ. 1998. Organochlorine pesticide residues in muscle tissue of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, taken from four fish farmsin Leon, Spain.
Food Addit Contam.15(5): 501 – 505. SCHENCK, F.J., L. CALDERON and L.V.
PHODORNIAK. 1996. Determination of Organochlorine Pesticide and Polychlorinated Biphenyl Residues in Fatty Fish by Tandem Solid-Phase Extraction Cleanup. J. AOAC Int. 79(5): 1209 – 1214.
SCHENK, F.J. and R. WAGNER. 1995. Screening procedure for organochlorine and organophosphorus pesticide residues in milk using matrix solid phase dispersion (MSPD) extraction and gas chromatographic determination. Food Additives and Contaminants.12(4): 535 – 541.
SINGLE LABORATORY VALIDATION ACCEPTANCE CRITERIA. 2006. Method Validation. http:// www.aoac.org/dietsuppl/dietary-supplement-web-site/slv-criteria-pdf.
YUNINGSIH dan S. YULIASTUTI. 2005. Analisis cepat residu pestisida lindan (insektisida organoklorin) dalam produk ternak (daging dan susu) dengan teknik ekstraksi fase padat dan khromatografi gas. JITV 10(1): 79 – 83.
