METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penyemprotan kalsium pada buah manggis dilakukan di sentra produksi manggis yaitu di kampung Cengal, Desa Karacak, Kecamatan Leuwiliang, Kabupaten Bogor. Pengamatan sifat fisik dan kimia buah dilakukan di laboratorium PKBT (Pusat Kajian Buah Tropik). Analisis kandungan kalsium pada perikarp dilakukan di laboratorium Balai Penelitian Tanah (BPT) Bogor. Analisis anatomi sekretori getah kuning manggis di laboratorium Mikroteknik Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Waktu Penelitian Oktober 2009-Januari 2011.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yaitu populasi buah manggis Leuwiliang yang sudah berproduksi, berumur kurang lebih 30 tahun. Bahan untuk penyemprotan antara lain kalsium klorida (CaCl2), kalsium hidroksida (Ca(OH)2), air, asam sitrat,
surfaktan. Bahan kimia yang digunakan antara lain NaOH, indikator phenolftalin, akuades, air bebas ion, NaCl, asam asetat, HCl, larutan Johansen dan parafin.
Peralatan yang digunakan antara lain jangka sorong, neraca analitik, penetrometer, refraktometer, perangkat titrasi, AAS (Atomic Absorption
Spektometer) merk Perkin Elmer-Model 2380, mikrotom, hot plate, mikroskop,
dan peralatan laboratorium yang menunjang.
Rancangan Penelitian
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu rancangan acak kelompok (RAK) dengan blok berupa lereng dari denah lokasi penelitian (Lampiran 4). Perlakuan yang dilakukan dalam penelitian yaitu :
1. Kontrol 2. CaCl2 konsentrasi 0.25 M 3. CaCl2 konsentrasi 0.5 M 4. CaCl2 konsentrasi1 M 5. Ca(OH)2 konsentrasi 0.25 M 6. Ca(OH)2 konsentrasi 0.5 M 7. Ca(OH)2 konsentrasi 1 M
CaCl2 dan Ca(OH)2 dengan konsentrasi 0.25 M, 0.5 M dan 1 M dilarutkan
dengan 1 liter air, kemudian ditambahkan asam sitrat 5 gram (pengkelat) dan
surfactant pro stiker dengan konsentrasi 0.5 ml/l larutan. Penelitian dilakukan
sesuai diagram alir penelitian (Gambar 2).
Gambar 2 Diagram alir penelitian
Pelabelan dilakukan pada saat antesis/bunga mekar (0 MSA). Jumlah pohon yang diperlukan adalah 21 pohon (7 perlakuan dengan 3 ulangan), masing-masing pohon dilabel sebanyak 40 bunga. Penyemprotan dilakukan pada permukaan buah manggis muda yang berumur 2, 4, 6,dan 8 MSA. Penyemprotan larutan kalsium dilakukan dengan menggunakan hand sprayer secara langsung ke buah dengan beberapa kali semprotan sampai seluruh permukaan buah basah dengan volume semprot sekitar 10 ml per buah.
Pengamatan Anatomi Struktur Sekretori Getah Kuning
Pengamatan anatomi struktur sekretori getah kuning dilakukan setelah aplikasi pemberian kalsium secara eksternal mulai 10 dan 15-16 MSA. Sampel
Pemilihan tanaman, persiapan alat dan bahan
Pelabelan pada antesis
Penyemprotan Kalsium Pada Buah berumur 2, 4, 6, 8 MSA
Pemanenan Buah Manggis Umur 10, 13 dan 16 MSA
Pengumpulan data : 1. Anatomi sekretori getah kuning 2. Morfologi buah manggis
3. Fisiologis (kandungan kalsium perikarp)
buah sebanyak 3 ulangan diambil, kemudian diamati struktur sekretorinya pada perikarp buah. Sediaan mikroskopi dibuat dengan menggunakan metode parafin dan pengamatan dengan TEM.
1. Metode Parafin
Metode yang digunakan untuk pengamatan sediaan mikrospis dengan metode parafin (Johansen 1940). Sampel difiksasi dalam larutan FAA (5 ml formalin, 5 ml asam asetat glasial, 90 ml alkohol 70%). Sampel yang telah difiksasi, selanjutnya dicuci dengan alkohol 70%. Proses penghilangan air dari jaringan (dehidrasi) dilakukan dengan merendam sampel dalam larutan seri Johansen (Lampiran 1). Infiltrasi parafin ke dalam jaringan dilakukan secara bertahap dengan menambahkan parafin beku ke dalam wadah berisi sampel, tertier butil alkohol (TBA) dan minyak parafin, lalu dibiarkan terbuka pada suhu ruang selama 1-4 jam dan dilanjutkan dalam oven pada suhu 600C. Setelah melalui infiltrasi jaringan ditanam dalam blok parafin. Kemudian sampel di dalam blok parafin dilunakkan dengan merendam di dalam larutan Gifford (Lampiran 2) selama 3 bulan.
Sampel diiris menggunakan mikrotom putar dengan ketebalan 10 µm. Pita parafin yang diperoleh direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi dengan perekat albumin-gliserin dan dikeringkan di atas hotplate dengan suhu 400C selama 5-6 jam. Selanjutnya dilakukan pewarnaan rangkap dua yaitu safranin 1% dan fastgreen 0,5%. Preparat yang telah diwarnai ditetesi entelan lalu ditutup dengan gelas penutup kemudian diamati di bawah mikroskop. Parameter yang diamati yaitu diameter saluran getah (400X), panjang dan lebar sel epitel saluran getah (1000X).
2. Pengamatan dengan TEM
Perikarp buah manggis yang berumur 15-16 MSA berukuran 1 x 1 x 1 mm difiksasi menggunakan fiksatif glutaraldehid 2.5% (dalam 0.1 M bufer kakodilat+3% sukrosa) dan postfiksasi menggunakan fiksatif osmium tetroksida 2% (dalam 0. 2.5% K3Fe(CN)6+3% sukrosa) pada suhu 40C selama 2 jam. Sampel
yang sudah difiksasi, kemudian didehidrasi di dalam seri etanol bertingkat mulai dari etanol 10% sampai dengan 100% di atas shaker 40C. Infiltrasi dilakukan secara bertahap dalam campuran etanol:propilen oxide 3:1, 1:1 dan 3:1
masing-masing selama 30 menit. Sampel ditanam dalam spurr’resin, disayat dengan ultra mikrotom setebal 70 nm dengan pisau intan. Sayatan ditempel pada grid berukuran 200 mesh, kemudian diwarnai dengan uranil asetat 2% dan triple lead 4%. Preparat yang telah diwarnai diamati dibawah mikroskop elektron tipe JEM 1010 pada 80 kV. Parameter yang diamati ketebalan dinding sel epitel saluran getah kuning (30000X)
Data Morfologi
Data morfologi meliputi skor getah kuning pada kulit dan aril buah manggis, sifat fisik buah buah manggis yaitu diameter buah, edible portion, ketebalan kulit buah (perikarp), dan kekerasan kulit buah.
1. Pengamatan skor getah kuning pada kulit buah dan aril dilakukan secara langsung dengan menghitung jumlah getah pada permukaan kulit buah dan aril. Pengamatan skor getah kuning mengikuti Kartika (2004).
a. Skor getah kuning pada kulit buah
Skor 1 : baik sekali, kulit mulus tanpa tetesan getah kuning
Skor 2 : baik, kulit mulus dengan 1-5 tetes getah kuning yang mengering tanpa mempengaruhi warna buah
Skor 3 : cukup baik, kulit mulus dengan 6-10 tetes getah kuning yang mengering tanpa mempengaruhi warna buah
Skor 4 : buruk, kulit kotor karena tetesan getah kuning dan bekas aliran yang menguning dan membentuk jalur-jalur berwarna kuning di permukaan buah
Skor 5 : buruk sekali, kulit kotor karena tetesan getah kuning dan membentuk jalur-jalur berwarna kuning di permukaan buah, warna buah menjadi kusam
b. Adapun skor getah kuning pada aril yaitu :
Skor 1 : baik sekali, aril putih bersih, tidak terdapat getah kuning baik di antara aril dengan kulit maupun di pembuluh buah
Skor 2 : baik, aril putih dengan sedikit noda (hanya bercak kecil) karena getah kuning yang masih segar hanya pada satu ujung
Skor 3 : cukup baik, terdapat sedikit noda (bercak) getah kuning di salah satu juring atau diantara juring yang menyebabkan rasa buah menjadi pahit
Skor 4 : buruk, terdapat noda (gumpalan) getah kuning baik di juring, diantara juring atau di pembuluh buah yang menyebabkan rasa buah menjadi pahit
Skor 5 : buruk sekali, terapat noda (gumpalan) baik di juring, diantara juring atau di pembuluh buah yang menyebabkan rasa buah menjadi pahit, warna aril menjadi bening
2. Sifat fisik buah Manggis a. Diameter buah (cm)
Diameter buah diukur secara transversal dan longitudinal, alat yang digunakan jangka sorong dengan satuan cm, diukur secara melintang pada bagian tengah buah, sedangkan diameter longitudinal diukur secara membujur dari ujung sampai pangkal buah.
b. Edible portion (%)
Edible portion (porsi yang dapat dimakan) merupakan bobot daging buah
(selisih antara bobot aril dengan bobot biji) yang dinyatakan dalam satuan persen (%). Edible portion dirumuskan sebagai berikut :
𝐸𝑑𝑖𝑏𝑙𝑒 𝑝𝑜𝑟𝑡𝑖𝑜𝑛 =(bobot aril − bobot biji)
bobot buah utuh X 100%
c. Ketebalan kulit buah (mm)
Pengamatan ketebalan kulit buah (mm) dilakukan dengan cara membelah kulit manggis secara transversal, kemudian kulit buah diukur dengan jangka sorong.
d. Kekerasan kulit buah (mm/kg)
Kekerasan kulit buah diukur dengan menggunakan penetrometer. Pengukuran kekerasan kulit buah meliputi bagian ujung, tengah dan pangkal buah. Kekerasan kulit buah dihitung dari nilai rata-rata dari bagian ujung, tengah dan pangkal buah.
3. Sifat kimia buah Manggis a. Padatan Total Terlarut (PTT)
Padatan total terlarut (0brix) diukur dengan menggunakan refraktometer, dilakukan dengan meletakkan air perasan daging buah pada refraktometer dan angka dibaca melalui lensa refraktometer
b. Total Asam Tertitrasi (TAT)
Total Asam Tertitrasi (%) dihitung melalui asam tertitrasi mengacu AOAC (2007). Sejumlah 10 g hancuran buah ditambahkan akuades hingga 100 ml lalu disaring. Sejumlah 25 ml filtrat ditambahkan 2-3 tetes indikator phenolftalin (pp) dititrasi dengan NaOH 0,1 N sehingga terjadi perubahan warna menjadi merah jambu yang stabil. Titrasi dilakukan duplo. Total
asam tertitrasi dihitung dalam bentuk persentase asam organik yaitu asam sitrat, dengan rumus :
TAT (%) = ml titran × N NaOH × fp × BE × 100% bobot contoh (g)
N : Normalitas larutan NaOH Fp : Faktor pengenceran (100/25) BE : bobot ekivalen = 64
Pengumpulan Data Fisiologis
Data fisiologis dikumpulkan dengan cara mengukur kandungan kalsium perikap buah manggis umur 10 dan 15-16 MSA. Metode penentuan kalsium terlarut dan kalsium terikat menurut Suwwan dan Poovaiah (1978), sedangkan ekstraksi kalsium terikat dilakukan secara bertingkat mengikuti prosedur ekstraksi metode Chen dan Uetomo (1976) (Gambar 3.)
Gambar 3 Prosedur ekstraksi berbagai bentuk kalsium yang berbeda dalam jaringan tumbuhan (Chen & Oetomo 1976).
Endapan suspensi ditambah dengan 2% larutan asam asetat selama 2 jam Endapan suspensi ditambah dengan 1 mol/l larutan NaCl selama 2 jam
Endapan suspensi ditambah dengan 0.6 mol/l larutan HCl selama 2 jam
Endapan– kalsium silikat
Sentrifugasi supernatan – kalsium larut dalam air Jaringan Tumbuhan
Dihaluskan dalam air bebas ion selama 2 jam
Sentrifugasi supernatan – kalsium pektat
Sentrifugasi supernatan – kalsium fosfat
Sampel yang berupa buah manggis dibersihkan, perikarp dipisahkan dari aril dan biji, kemudian dikeringkan dalam oven suhu 600C sampai kering dan dihancurkan sampai berukuran 50 mesh. Sampel ditambahkan air bebas ion, kemudian dikocok selama 1 jam dan disentrifugasi pada kecepatan 4.000 rpm selama 15 menit. Supernatan disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman no 541 untuk memisahkan filtrat dan pelet. Filtrat dianalisis kalsium terlarutnya dengan alat AAS. Filtrat yang telah dipisahkan dari supernatan sesuai prosedur Chen dan Oetomo (1976) dianalisis dengan AAS pada panjang gelombang 422,7 nm untuk mendapatkan data kalsium pektat, kalsium fosfat dan kalsium oksalat. Pengukuran kalsium total mengunakan metode standar pengabuan basah (BPT, 2009).
Analisis Data
Data dianalisis secara statistik dengan analisis sidik ragam (ANOVA) dan diuji lanjut dengan Duncan Multiple‘s Range Test (DMRT) pada taraf 5% menggunakan software SPSS.
