Gambar 1. Alur penelitian (Road map) plastisitas fenotip kerang darah Anadara granosa.
2 KARAKTERISASI GEN BETA AKTIN PADA KERANG DARAH Anadara granosa L.
Abstrak
Gen aktin adalah gen yang konserve dan memiliki sifat sebagai housekeeping dan constitutive gene. Dengan karakteristiknya yang demikian, gen aktin telah banyak digunakan sebagai kontrol internal untuk menormalisasi ekspresi gen. Informasi mengenai gen aktin pada bivalvia famili Arcidae belum pernah dilakukan, sehingga diperlukan kajian mengenai isolasi dan karakterisasinya untuk keperluan
Perairan intertidal Faktor alami Histologis insang Faktor antropogenik Keragaman fenotip Plastisitas fenotip kerang darah Anadara granosa
Gen protein stres
Ekspresi Gen Hsp70
Gen β-aktin, kontrol internal
ekspresi gen dan bioinformatika. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengeksplorasi ekspresi gen aktin dan menganalisis karakteristiknya pada kerang darah Anadara granosa terhadap induksi logam berat merkuri pada berbagai konsentrasi, sehingga gen aktin dapat digunakan sebagai kontrol internal dalam kajian ekspresi gen target yang diinduksi oleh logam berat merkuri tersebut. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen aktin yang diisolasi dari kerang darah Anadara granosa dapat dijadikan kontrol internal untuk kajian ekspresi gen, disebabkan ekspresinya yang konstan untuk semua sampel yang diinduksi dan kespesifikan sekuennya. Produk pengurutan gen aktin A. granosa menghasilkan sekuen parsial sebanyak 353 pasang basa nukleotida yang menyandikan 117 asam amino.
Kata-kata kunci: gen aktin, ekspresi gen, gen housekeeping.
Abstract
Actin gene is a conserve and constitutive gene. Therefore, it has been used as an internal control to normalize gene expression. Information on actin gene from bivalve of the family Arcidae has not been explored yet. Hence, it is necessary to isolate and characterize the gene in order to analyze gene expression and to study bioinformatics. The objective of this research is to explore actin gene expression on blood cockle Anadara granosa in response to mercury induction at several concentration. This research revearled that the actin gene isolated from blood cockle can be used as an internal control for analysis of gene expression, due to its constant level of expression at all mercury concentrations induced. In addition, sequenced actin gene produced 353 base pairs of nucleotide encoding 117 amino acids.
Keywords: actin gene, gene expression, house keeping gene.
Pendahuluan
Aktin adalah protein yang sangat konserve dan yang menjadi salah satu komponen utama sitoskeleton yang berperan penting pada semua sel eukariotik (Cooper & Crain 1982). Persentase aktin pada sel eukariotik mencakup 50% total seluler protein. Aktin berfungsi pada semua proses seluler, termasuk motilitas sel, kontraktil, mitosis dan sitokinesis, transport intraseluler, dan sekresi sel. Di samping itu pula, aktin berperan dalam regulasi transkripsi gen (Zheng et al. 2009).
Aktin memiliki tiga isoform utama, yaitu alpha, beta, dan gamma. Alpha aktin ditemukan pada sel otot yang merupakan bagian penting dari aparatus kontraktil. Sedangkan beta dan gamma aktin berada pada semua jenis sel sebagai komponen sitoskeleton dan mediator motilitas sel internal. Beta aktin dan gamma aktin masing-masing terletak di kromosom 7 dan 17 pada manusia (Erba et al. 1988). Adapun alpha aktin berada di kromosom 1, 11, dan 15 pada manusia. Berat molekul α, β, dan γ aktin adalah sekitar 42 hingga 43 kDa (Gunning et al. 1984; Beggs et al. 1992).
Beta aktin berperan dalam transkripsi gen, yang erat hubungannya dengan ketiga hal berikut. Pertama, aktin berperan dalam penyusunan benang-benang kromatin yang terikat dengan ATP (Percipalle & Visa 2006). Kedua, membentuk kompleks dengan ribonucleotide protein (RNP) yang mengikat RNA dari inti ke sitoplasma (Percipalle & Visa 2006; Zheng et al. 2009). Ketiga, aktin diperlukan untuk transkripsi oleh tiga polimerase RNA inti, yaitu Polimerase I, II, dan III pada sel inti eukariot (Percipalle & Visa 2006; Zheng et al. 2009).
Gen aktin memiliki tingkat ekspresi yang stabil dan ekspresinya tidak membutuhkan adanya faktor induksi. Dengan sifat gen yang seperti ini, maka aktin disebut sebagai housekeeping dan constitutive gene. Gen yang bersifat housekeeping dan constitutive sangat berguna untuk dijadikan sebagai kontrol internal dalam normalisasi tingkat ekspresi mRNA. Normalisasi diperlukan dalam mengoreksi perbedaan untuk identifikasi adanya keragaman dalam ekspresi gen, disebabkan oleh kondisi sampel dan perlakuan serta induksi dari material yang dipakai (Yperman et al. 2004).
Gen aktin telah digunakan sebagai kontrol ekspresi gen pada manusia (Goidin et al. 2001), domba (Garcia-Crespo et al. 2005), mencit (Ikegami et al. 2002), ikan zebra Danio rerio (Evans et al. 2005; Keller et al. 2008) , dan bivalvia Crassostrea gigas (Farcy et al. 2009). Menurut Nakajima-Iijima et al. (1985), struktur gen aktin pada manusia terdiri dari promoter, enam ekson, lima intron, dan diakhiri dengan terminator, yang digambarkan seperti pada gambar 2 di bawah ini. Promoter gen aktin pada manusia memiliki situs pengikat protein (protein binding site) yaitu CCAAT dan TATA box, masing-masing terletak pada -818 dan -879 upstream. Berdasarkan data GenBank, coding sequence (CDS) gen beta aktin manusia (kode akses NM_001101.3) terdiri dari 1128 nukleotida yang menyandikan asam amino sebanyak 376.
5’ I1 I2 I3 I4 I5 3’
Gambar 2. Struktur gen aktin (Nakajima-Iijima et al. 1985).
Pada penelitian penentuan tingkat ekspresi gen Hsp70 pada Anadara granosa ini, gen aktin digunakan sebagai kontrol internal untuk menormalisasi ekspresi gen. Informasi mengenai gen aktin dari bivalvia famili Arcidae, termasuk A. granosa, sampai saat ini masih belum ada. Oleh karena itu perlu diketahui dengan tepat mengenai karakterisasi gen aktin pada bivalvia famili Arcidae terutama A. granosa sehingga kontrol internal sebagai housekeeping gene lebih akurat dan tepat. Untuk selanjutnya sekuen gen aktin A. granosa yang diperoleh dapat dijadikan rujukan untuk mendisain primer gen aktin dari anggota famili Arcidae lainnya.
Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Mengkarakterisasi gen β-aktin secara parsial di daerah yang relatif konserve untuk kerang darah Anadara granosa.
2. Menganalisis ekspresi gen β-aktin Anadara granosa sebagai kontrol internal yang merupakan housekeeping gene dan standarisasi kualitas dari sintesis cDNA untuk gen-gen target pada kerang darah.
Penelitian ini dirancang dan ditelusuri berdasarkan pertimbangan dengan alur penelitian (Road map) seperti gambar 3 berikut.
Gambar 3. Alur penelitian (Road map) β-aktin Anadara granosa sebagai housekeeping gene.
Bahan Dan Metode Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel kerang darah dilakukan di dua perairan di propinsi Banten, yaitu Bojonegara- Teluk Banten dan Panimbang-Teluk Lada. Kerang darah dibawa ke laboratorium dan ditempatkan pada akuarium yang terpisah yang berisi air laut. Selanjutnya kerang darah diaklimatisasi selama 48 jam sebelum dilakukan cekaman logam berat.
Sebaran dan perkembangan hidup A.granosa Data genbank
gen β aktin
β aktin pada manusia (kode akses genbank
NM_001101.3)
Produk PCR gen β-aktin parsial pada Anadara
granosa
β aktin parsial menggunakan primer dari gen β
aktin manusia
Sekuensing gen β-aktin parsial Anadara granosa
(353 bp)
Kontrol internal (sebagai
housekeeping gene) untuk
ekspresi gen target dari hasil cDNA Alignment gen β aktin parsial A. granosa dengan manusia dan hewan akuatik Purifikasi RNA Anadara granosa Sintesa cDNA Anadara granosa
Indukasi HgCl2
Sampel kerang darah dipaparkan pada tiga konsentrasi HgCl2, yaitu 1, 2, dan 10 ppm selama 24 dan 48 jam. Kerang darah kontrol dibiarkan tanpa perlakuan merkuri. Jumlah kerang darah pada setiap perlakuan masing-masing tiga individu. Ukuran kerang darah yang dianalisis 2.753 ± 0.427 cm. Rancangan percobaan yang diterapkan adalah rancangan acak kelompok (RAK). Pada akhir periode perlakuan merkuri, insang kerang darah diambil dan dibilas untuk digunakan pada analisis histologi insang dan isolasi RNA.
Isolasi RNA
Insang diekstraksi untuk analisa RNA total, dengan menggunakan GeneJet RNA Purification Kit (Thermo Scientific Inc.) Prosedur isolasi mengikuti manual pabrik. Integritas RNA diperoleh dengan memasukkan sample ke dalam gel agarose 1,2% dan dilarikan pada mesin elektroforesis. Sampel RNA dimonitor di bawah UV transluminator. Kemurnian RNA diukur dengan spektrofotometer.
Sintesis cDNA
Transkripsi balik cDNA dilakukan dengan menggunakan RevertAid Transcriptase (Thermo Scientific Inc.). Prosedur Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ini mengikuti manual pabrik. Sampel hasil sintesis cDNA digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi cDNA dari gen β-aktin.
Amplifikasi cDNA gen β-aktin
Pasangan primer yang digunakan adalah S-ACT dan A-ACT (Tabel 1). Primer ini didisain dari gen β-aktin manusia (Wan et al. 2008). Komposisi bahan-bahan PCR terdiri dari 3 µl cDNA ditambah dengan buffer Kapa2G Fast 5 µl; MgCl2 2.5 µl; dNTP, primers, and DMSO masing-masing 1 µl; Taq polymerase 0.2 µl, dan double distilled water sampai campuran mencapai volume 25 µl (Kapa Biosystem). PCR dilakukan dengan menggunakan mesin AB Verity dan Biometra. PCR dilakukan pada kondisi pra denaturasi 940C (3 menit), denaturasi 940C (45 detik). Penempelan primer β-actin pada suhu 610C, dengan waktu penempelan 1,5 menit. Pemanjangan 720C (1 menit). PCR dilakuan sebanyak 35 siklus. Pasca PCR 720C (7 menit), dan pendinginan 150C (10 menit). Produk PCR dimasukkan pada 1,2% gel agarose yang dijalankan dengan menggunakan mesin elektroforesis selama 60 menit. Integritas produk PCR kemudian dilihat dibawah UV transluminator.
Tabel 1. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen β-aktin dari cDNA Anadara granosa.
Nama primer Sekuen Primer
Produk PCR (bp) No akses GenBank S-ACT 5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3' 353 NM_001101 .3 A-ACT 5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3'
Pengurutan DNA dan Analisis Urutan DNA Pengurutan sampel DNA gen β
dilakukan dengan menggunakan mesin sekuenser. Pengurutan (
masing-masing sampel lengkap dua arah baik forward maupun reversenya. Pengerjaannya dilakukan di Laboratorium First Base, Singapura. Analisa kesejajaran gen β-aktin dilakukan dengan menggunakan pro
(Tamura et al. 2007). Rekonstruksi kedekatan antar sampel dilakukan dengan membuat pohon filogeni berdasarkan jarak genetik antar nukleotida (nt) maupun asam amino (AA) secara berpasangan menggunakan nilai
Rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan Neighbor Joining (NJ) yang diulang dengan menggunakan metoda Bootstrap 1000x (Tamura
Hasil
Hasil
Isolasi RNA Total
RNA total telah berhasil diisolasi dari kerang darah
telah diberi cekaman logam berat merkuri pada konsentrasi 1, 2, dan 10 ppm, serta kontrol 0 ppm. Gambar 4 menunjukkan pita RNA dengan dua pita RNA ribosomal, yaitu 28S rRNA dan 18S rRNA. Pengukuran kemurnian RNA dengan spektrofotometer menunjukkan nilai kisaran antara 1,
integritas dan kemurnian RNA total yang tinggi ini, maka sample dapat digunakan sebagai cetakan untuk sintesa cDNA total.
Gambar 4. Hasil elektroforesis RNA total dari kerang darah menunjukkan dua pita RNA
Amplifikasi cDNA dari gen β-aktin
Amplifikasi untuk mendapatkan cDNA
aktin manusia menghasilkan fragmen cDNA dengan ukuran 353 pb (Gambar 5). Selanjutnya fragmen ini dinamakan dengan fragmen gen a
Pengurutan DNA dan Analisis Urutan DNA
Pengurutan sampel DNA gen β-aktin dari individu yang berbeda an menggunakan mesin sekuenser. Pengurutan (sequencing masing sampel lengkap dua arah baik forward maupun reversenya. Pengerjaannya dilakukan di Laboratorium First Base, Singapura. Analisa
aktin dilakukan dengan menggunakan program MEGA4 2007). Rekonstruksi kedekatan antar sampel dilakukan dengan membuat pohon filogeni berdasarkan jarak genetik antar nukleotida (nt) maupun asam amino (AA) secara berpasangan menggunakan nilai p distance
ni berdasarkan Neighbor Joining (NJ) yang diulang dengan menggunakan metoda Bootstrap 1000x (Tamura et al. 2007).
Hasil dan Pembahasan
RNA total telah berhasil diisolasi dari kerang darah Anadara granosa yang man logam berat merkuri pada konsentrasi 1, 2, dan 10 ppm, serta kontrol 0 ppm. Gambar 4 menunjukkan pita RNA dengan dua pita RNA ribosomal, yaitu 28S rRNA dan 18S rRNA. Pengukuran kemurnian RNA dengan spektrofotometer menunjukkan nilai kisaran antara 1,582 sampai 1,902. Dengan integritas dan kemurnian RNA total yang tinggi ini, maka sample dapat digunakan sebagai cetakan untuk sintesa cDNA total.
Gambar 4. Hasil elektroforesis RNA total dari kerang darah Anadara granosa menunjukkan dua pita RNA ribosomal 28S dan 18S.
aktin Anadara granosa dengan PCR
untuk mendapatkan cDNA gen β-aktin dengan primer beta aktin manusia menghasilkan fragmen cDNA dengan ukuran 353 pb (Gambar 5). Selanjutnya fragmen ini dinamakan dengan fragmen gen aktin Anadara granosa
28S 18S
aktin dari individu yang berbeda sequencing) masing sampel lengkap dua arah baik forward maupun reversenya. Pengerjaannya dilakukan di Laboratorium First Base, Singapura. Analisa
gram MEGA4 2007). Rekonstruksi kedekatan antar sampel dilakukan dengan membuat pohon filogeni berdasarkan jarak genetik antar nukleotida (nt) maupun p distance. ni berdasarkan Neighbor Joining (NJ) yang diulang
yang man logam berat merkuri pada konsentrasi 1, 2, dan 10 ppm, serta kontrol 0 ppm. Gambar 4 menunjukkan pita RNA dengan dua pita RNA ribosomal, yaitu 28S rRNA dan 18S rRNA. Pengukuran kemurnian RNA dengan 582 sampai 1,902. Dengan integritas dan kemurnian RNA total yang tinggi ini, maka sample dapat digunakan
aktin dengan primer beta aktin manusia menghasilkan fragmen cDNA dengan ukuran 353 pb (Gambar 5).
1 2 3 4 M
Gambar 5. Amplifikasi gen AgACT 353 bp. (1: 0 ppm; 2: 1ppm; 3: 2 ppm, 4: 10ppm; M: DNA marker 100 bp)
Hasil amplifikasi gen aktin dari Anadara granosa yang berukuran 353 bp, memperlihatkan bahwa pita-pita yang dihasilkan memiliki ketebalan yang sama. Ketebalan pita yang merata menunjukkan bahwa gen aktin memiliki ekspresi yang sama pada ketiga level konsentrasi HgCl2 yang diinduksi. Dengan demikian gen aktin dari A.granosa layak dijadikan kontrol internal bagi ekspresi gen target pada penelitian ekspresi famili gen Hsp70. Urutan primer yang digunakan dari disain sekuen gen β-aktin manusia (NM_001101.3) menempel 62 % untuk primer forward dan 100% untuk primer reverse, sehingga untuk selanjutnya pasangan primer yang dapat mengamplifikasi gen β-aktin A. granosa dengan baik adalah Forward 5’- GTTTGTTGTTGACAAAGGGTT-3’ dan Reverse 5’- CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’.
Analisis pengurutan fragment gen AgACT
Pengurutan fragment gen β-aktin Anadara granosa terkoreksi yang berasal dari individu yang berbeda menghasilkan basa nukleotida 353 pb yang menyandikan 117 asam amino (Lampiran 1 dan 2). Persentase perbedaan gen β-aktin antar Anadara granosa sebesar 0.000 – 0.013 nukleotida dan 0.000 – 0.040 asam amino (Tabel 2 dan 3). Persentase ketidakmiripan fragmen nukleotida gen β-aktin Anadara granosa dengan gen aktin bivalvia lainnya berkisar antara 0.225 – 0.251. Berdasarkan analisa kesejajaran asam amino menunjukkan bahwa ketidakmiripan asam amino gen aktin kerang darah dengan bivalvia lainnya sebesar 0.210 – 0.226.
Persentase ketidakmiripan nukleotida dan asam amino antara gen β-aktin Anadara granosa dengan gen aktin dari spesies bivalvia lainnya menunjukkan bahwa β-aktin A. granosa yang telah diisolasi dari Anadara granosa adalah kandidat gen aktin. Sampai saat ini belum pernah ada isolasi gen aktin untuk bivalvia famili Arcidae, terlebih spesies Anadara granosa. Dengan demikian, gen aktin akan sangat penting bagi kontrol positif dalam analisa ekspresi gen pada A. granosa.
Tabel 2. Persentase ketidakmiripan (p-Distance) nukleotida sekuen gen β-aktin. 1: kontrol; 2: 1ppm/24jam; 3: A.granosa-1ppm/48jam; 4: A. granosa-2ppm/24jam; 5: A.granosa-2 ppm/48jam; 6: A.granosa-10 ppm/24jam; 7: M. yessoensis; 8: H. cumingii
Takson Takson 1 2 3 4 5 6 7 2 0.000 3 0.000 0.000 4 0.008 0.008 0.008 5 0.008 0.008 0.008 0.000 6 0.013 0.013 0.013 0.011 0.011 7 0.225 0.225 0.225 0.227 0.227 0.233 8 0.243 0.243 0.243 0.246 0.246 0.251 0.126
Tabel 3. Persentase ketidakmiripan (p-Distance) asam amino sekuen gen β-aktin. 1: kontrol; 2: 1ppm/24jam; 3: A.granosa-1ppm/48jam; 4: A. granosa-2ppm/24jam; 5: A.granosa-2 ppm/48jam; 6: A.granosa-10 ppm/24jam; 7: M. yessoensis; 8: H. cumingii
Takson Takson 1 2 3 4 5 6 7 2 0.000 3 0.000 0.000 4 0.024 0.024 0.024 5 0.024 0.024 0.024 0.000 6 0.040 0.040 0.040 0.032 0.032 7 0.210 0.210 0.210 0.210 0.210 0.226 8 0.210 0.210 0.210 0.210 0.210 0.226 0.000 Hasil analisis filogenetik menunjukkan baik urutan nukleotida maupun asam amino gen β-aktin Anadara granosa membentuk kelompok yang terpisah dari gen β-aktin spesies bivalvia lainnya (Gambar 6 dan 7). Sedangkan antar individu-individu Anadara granosa terbentuk pengelompokan. Individu-individu kontrol dan yang diberi perlakuan induksi logam berat merkuri konsentrasi 1 ppm membentuk kelompok tersendiri dengan kemiripan 89% baik untuk urutan nukleotida maupun asam amino. Kelompok pertama tersebut terpisah dengan individu-individu yang diberi perlakuan induksi merkuri konsentrasi 2 dan 10 ppm.
Gambar 6. Filogenetik gen beta aktin antara A.granosa dan bivalvia lainnya berdasarkan urutan 353 nukelotida.
Gambar 7. Filogenetik gen beta aktin antar A.granosa dan bivalvia lainnya berdasarkan urutan 117 asam amino.
Pembahasan
Gen aktin bersifat conserve dan ubiquitous pada organisme eukariot. gen aktin terlibat dalam struktur sitoskeletal, motilitas seluler, mobilitas permukaan sel, transport intraseluler, dan mitosis. Dengan karakteristik tersebut, maka gen aktin banyak dimanfaatkan sebagai housekeeping gene (Morga et al. 2010). Sebagai agen molekuler, gen β-actin selanjutnya dimanfaatkan untuk kontrol internal dalam banyak analisis RNA (Thellin et al. 1999).
Penelitian ini menghasilkan ketebalan pita hasil PCR yang konstan dari gen β-aktin Anadara granosa yang diinduksi oleh berbagai konsentrasi merkuri. Dengan demikian, ekspresi gen β-aktin Anadara granosa tidak terpengaruh oleh adanya induksi merkuri. Di lain pihak, beberapa penelitian menunjukkan bahwa ekspresi gen β-aktin sensitif terhadap adanya perubahan stimulant. Morga et al. (2010) menemukan ketidakkonstanan ekspresi gen β-aktin pada bivalvia Ostrea edulis yang diinfeksi oleh parasit Bonamia ostreae. Parasit Bonamia ostreae
A. granosa 0 A. granosa 1/48 A. granosa 1/24 A. granosa 10/24 A. granosa 2/48 A. granosa 2/24 M. yessoensis H. cumingii 78 100 89 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 A. granosa 0 A. granosa 1/48 A. granosa 1/24 A. granosa 10/24 A. granosa 2/48 A. granosa 2/24 M. yessoensis H. cumingii 100 77 89 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 HM045420 GU596498
nampaknya berpengaruh terhadap ekspresi gen aktin tersebut, yang dalam hal ini gen aktin terlibat dalam struktur sitoskeleton yang berperan fagositosis dan pembungkusan sel. Ekspresi gen β-actin juga ditemukan pada ikan Ictalurus punctatus yang diperlakukan terhadap stressor seperti kekurangan pakan dan rendahnya tinggi permukaan air. Kondisi fisiologis ikan nampaknya memberikan pengaruh terhadap ekspresi gen di dalam jaringan (Small et al. 2008). Ekspresi gen β-actin yang beragam juga terlihat pada katup jantung domba (Yperman et al. 2004), ayam yang diinduksi suhu tinggi (Banerji et al, 1986), dan jalur pernapasan penderita asma (Glare et al. 2002). Dengan demikian, penelitian-penelitian terdahulu tersebut tidak berhasil menjadikan gen β-actin sebagai kontrol internal.
Menurut Morga et al. (2010), suatu gen yang memiliki ekspresi stabil dapat dijadikan sebagai kontrol internal untuk menormalisasi ekspresi gen target. Pada penelitian ini, gen β-actin dari Anadara granosa menunjukkan respon yang sama terhadap induksi merkuri, sehingga gen β-actin A. granosa ini dapat dijadikan sebagai standard untuk menormalisasi ekspresi gen target yang dalam hal ini adalah gen Hsp70.
Berdasarkan hasil sekuen, sekuen gen gen β-aktin di antara sample kerang darah bersifat conserve, baik urutan nukleotidanya maupun asam aminonya (Lampiran 1 dan 2). Baik berdasarkan urutan nukleotida maupun asam amino, hanya ada enam situs yang berbeda. Walaupun demikian, terbentuk pengelompokan antara kelompok kerang darah kontrol dan induksi merkuri 1 ppm sebagai kelompok pertama dengan kemiripan 89%, dan kelompok yang diinduksi dengan merkuri 2 dengan kemiripan dan 10 ppm sebagai kelompok lainnya. Pengelompokkan ini seperti adanya pengaruh dari konsentrasi merkuri yang diinduksi. Namun demikian, keragaman genetik individu dapat terjadi pada organisme yang memiliki kemampuan penyebaran (dispersal ability) yang tinggi (Frankham et al. 2002). Sebagai perenang pasif, dispersi larva bivalvia yang tinggi tergantung pada arus pasang surut dan gelombang laut. Jika tidak ada penghalang fisik dan kimia, larva dapat mencapai habitat yang menjauhi tempat stok induknya. Dengan adanya penghalang fisik dan kimia dapat membatasi dispersi larva (Butet 1997). Penghalang tersebut dapat membatasi aliran gen (gene flow) yang dapat berakibat pada rendahnya keragaman genetik (Frankham et al. 2002) dan peremajaan populasi berasal dari sumber genetik yang sama. Teori dispersal tersebut dapat diaplikasikan pada penelitian ini. Diduga sebaran larva kerang darah Anadara granosa tinggi, sehingga terjadi aliran gen menyebabkan keragaman gen β-aktin. Dengan demikian, keragaman gen β-aktin kerang darah yang diinduksi merkuri berasal dari keragaman genetik individu.
Walaupun ada beberapa situs nukleotida dan asam amino yang conserve dari gen β-aktin kerang darah dan bivalvia lainnya, hubungan kekerabatan keduanya jauh. Sekuen gen β-aktin menunjukkan perbedaan sekuen nukleotida dan asam aminonya. Dengan demikian, gen β-aktin yang diisolasi dari kerang darah dapat diperhitungkan sebagai kandidat gen β-aktin untuk kerang darah khususnya dan untuk bivalvia famili Arcidae umumnya. Sehingga gen β-aktin kerang darah menjadi penting untuk digunakan sebagai kontrol positif dalam analisa ekspresi gen.
Simpulan
Berdasarkan kekonstanan pita PCR, gen β-aktin dari Anadara granosa dapat digunakan sebagai kontrol internal dalam analisis ekspresi gen target. Hasil sekuen gen β-aktin menunjukkan kekhasan gen tersebut.
Primer spesifik gen β-aktin untuk Anadara granosa adalah Forward AgACT Forward 5’- GTTTGTTGTTGACAAAGGGTT-3’ dan Reverse AgACT 5’- CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’. Dari primer ini dapat digunakan sebagai sarana amplifikasi gen β-aktin yang merupakan kontrol internal pada hewan-hewan bivalvia lainnya.
3 KARAKTERISASI DAN EKSPRESI GEN HEAT SHOCK PROTEIN 70 PADA KERANG DARAH Anadara granosa L. SEBAGAI RESPON
TERHADAP INDUKSI MERKURI
Abstrak
Sebagai organisme intertidal dan subtidal, kerang darah Anadara granosa setiap menghadapi lingkungan yang selalu berubah yang seringkali menimbulkan stres. Stres yang distimulasi biasanya dikendalikan oleh gen-gen protein stres. Ada banyak gen protein stres, diantaranya gen heat shock protein (Hsp) seperti Hsp70 yang berfungsi sebagai molecular chaperone dan terekspresi pada kondisi stres. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi dan menganalisis ekspresi gen Hsp70 pada kerang darah sebagai respon terhadap induksii merkuri. Hasil dari penelitian ini mendapatkan bahwa gen Hsp70 kerang darah bersifat spesies spesifik dan berbeda dengan spesies lainnya. Selain itu penelitian ini membuktikan bahwa merkuri mampu menginduksi ekspresi gen Hsp70 yang mana levelnya meningkat pada konsentrasi merkuri tertentu. Hal ini membuktikan bahwa kerang darah memiliki plastisitas yang tinggi dalam mentoleransi logam berata terutama cemaran merkuri. Dengan demikian, gen Hsp70 selanjutnya dapat dimanfaatkan sebagai marka molekuler untuk perairan tercemar.
Kata-kata kunci: gen Hsp70, Anadara granosa, molecular chaperone, acquired character.
Abstract
As an intertidal and subtidal organism, blood cockle Anadara granosa must cope with the ever-changing environment. It constantly generates stress controlled by stress protein genes. There are many stress genes that play an important role in cell protection. Hsp70 gene becomes one of the genes which function as a molecular chaperone and be expressed under stress condition. The research aimed at exploring the expression of Hsp70 gene in blood cockle responding to mercury induction. The research revealed that mercury was able to induce Hsp70 gene expression which level increased at certain mercury concentration. This
