6.1 Media Agar
Pada penelitian ini dipilih Mueller Hinton (MH) agar karena media ini telah direkomendasikan oleh FDA dan WHO untuk tes antibakteri terutama bakteri aerob dan facultative anaerobic bacteria untuk makanan dan materi klinis. Media agar ini juga telah terbukti memberikan hasil yang baik dan reprodusibel (reproducibility). Media agar ini mengandung sulfonamida, trimethoprim, dan inhibitor tetrasiklin yang rendah serta memberikan pertumbuhan pathogen yang memuaskan (Acumedia, 2004). Seperti terlihat pada Gambar 5.1, penambahan darah kambing berperan sebagai penyedia senyawa nitrogen, vitamin, karbon, sulfur, dan asam-asam amino. Untuk kasus tertentu, biasanya juga ditambahkan kanji untuk mengabsorbsi metabolit toksik yang dihasilkan. Pemilihan media MH agar dalam penelitian ini juga dilakukan dengan alasan pengujian adalah berdasarkan prinsip penghitungan zona hambatan menggunakan paper discs. Paper discs direndam dalam konsentrasi tertentu larutan uji dan ditempatkan dipermukaan media. Plates diinkubasi dan zona hambatan disekitar disc diukur. Banyak faktor yang dapat berpengaruh terhadap efektivitas hambatan dengan disc ini, seperti konsentrasi inokulum yang merata, ke dalaman agar, kemampaun disc, pH media, dan terbentuknya beta-lactamase oleh bakterinya. Untuk pengujian bakteri streptococci adalah sangat tepat adanya penambahan 5% darah kuda atau kambing (Acumedia, 2004).
6.2 Peremajaan, Uji Grup, Identifikasi, dan Suspensi Isolat
Streptococcus Mutans
Seperti dapat dilihat pada Gambar 5.2 pada penelitian ini telah diperoleh Streptococcus mutans murni. Hal ini dapat tercapai dengan cara peremajaan isolat, yaitu dari stok Streptococcus mutans diambil beberapa koloni digoreskan ke media MH agar darah dan diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 370C. Keesokan harinya diperoleh koloni kecil-kecil, lembut berwarna bening. Hal ini dibuktikan dengan bentuknya yang bulat telur, tersusun seperti rantai dan tidak membentuk spora, sesuai dengan Gambar 2.1. Streptococcus mutans merupakan bakteri gram positf (+), bersifat non motil (tidak bergerak), berdiameter 1-2 µm, bakteri anaerob fakultatif (Samaranayake, 2002; Regina, 2007; Ari, 2008; Manton, 2010). Pada penelitian ini juga dilakukan uji grup Streptococcus mutans memakai Streptococcal grouping kit. Hasil uji grup seperti terlihat pada Gambar 5.3 ternyata yang didapat adalah Streptococcus mutans tipe D. Untuk lebih meyakinkan, selanjutnya Streptococcus mutans yang diperoleh diidentifikasi secara biokimia menggunakan 3 jenis media, yaitu Voges Proskauer, Sorbitol Broth, dan Mannitol Broth. Hasil identifikasi secara keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 5.4. Penggunaan media Voges Proskauer memberikan hasil positif Streptococcus mutans ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna dari kuning setelah diinkubasi menjadi keruh dan penambahan reagen Kovac’ menjadi merah anggur. Selanjutnya uji menggunakan media Sorbitol Broth memberikan hasil positif Streptococcus mutans ditandai dengan perubahan warna dari merah menjadi kuning. Demikian juga uji menggunakan media Mannitol Broth memberikan hasil yang serupa yaitu terjadi perubahan warna dari merah menjadi
kuning yang menunjukkan memang positif Streptococcus mutans. Dari ketiga identifikasi menggunakan media tersebut ternyata memang memberikan hasil positif Streptococcus mutans sehingga lebih meyakinkan untuk digunakan dalam penelitian berikutnya.
Streptococcus mutans biasanya ditemukan pada rongga gigi manusia yang luka dan menjadi bakteri yang paling kondusif menyebabkan karies untuk email gigi (Ari, 2008). Streptococcus mutans bersifat asidogenik yaitu menghasilkan asam asidurik, mampu tinggal pada lingkungan asam, dan menghasilkan suatu polisakarida yang lengket disebut dekstran. Kemampuannya ini, bisa menyebabkan Streptococcus mutans lengket dan mendukung bakteri lain menuju ke email gigi dan asam melarutkan email gigi (Willett dkk., 1991; Jawetz dkk., 2004; Ari, 2008; Maksum, 2009).
Pada penelitian ini dibuat suspensi Streptococcus mutans dari koloni yang tumbuh pada media MH agar darah dan sudah diidentifikasi memang benar positif Streptococcus mutans seperti yang telah diuraikan di atas. Gambar 5.2 menunjukkan koloni yang tumbuh pada media MH agar darah dan diambil 1-2 koloni dimasukkan ke dalam media NaCl 0,9% yang kekeruhannya setara dengan 0,5 Mac-Farland. Lidi kapas steril dicelupkan ke dalam suspensi tersebut dan diperas pada dinding tabung supaya cairan yang diambil tidak berlebihan. Kemudian dioleskan secara merata 3 radian pada media MH agar darah.
Pada penelitian ini, terdapat empat jenis perlakuan, yaitu perlakuan kontrol menggunakan akuades, perlakuan menggunakan garam dapur tanpa merk yang diproduksi secara tradisional, perlakuan menggunakan garam dapur bermerk, dan perlakuan menggunakan larutan iodium. Konsentrasi masing-masing garam yang digunakan adalah 4, 6, dan 8%. Hal ini dilakukan dengan menimbang masing-masing 4, 6, dan 8 g garamnya dilarutkan masing-masing-masing-masing ke dalam 100 ml akuades. Untuk lebih mendapatkan data yang valid masing-masing garam yang dibuat dianalisis kandungan iodiumnya secara iodatometri. Untuk perlakuan menggunakan larutan iodium, konsentrasi iodiumnya dibuat sama dengan konsentrasi iodium untuk garam bermerk.
Konsentrasi iodium garam tanpa merk dan bermerk disajikan pada Tabel 5.1. Secara menyeluruh untuk garam tanpa merk konsentrasi 4, 6, dan 8% diperoleh kandungan iodiumnya secara berurutan adalah 1,51; 2,26; dan 3,01 ppm. Sedangkan untuk garam bermerk konsentrasi 4, 6, dan 8% diperoleh kandungan iodiumnya secara berurutan adalah 2,19; 3,29; dan 4,38 ppm. Dengan demikian, pada penelitian ini dibuat larutan iodium berkonsentrasi 2,19; 3,29; dan 4,38 ppm sama seperti garam bermerk.
Seperti kita ketahui garam dapur sebenarnya merupakan gabungan dua unsur, yaitu natrium (Na) dan klorida (Cl). Natrium dan klorida biasanya berhubungan erat baik sebagai bahan makanan maupun fungsinya di dalam tubuh. Dalam tubuh manusia seperti halnya dalam makanan, sebagian Natrium bergabung dengan klorida sama dengan garam dapur membentuk garam meja, yaitu Natrium klorida. Istilah garam pertama kali dikemukakan oleh Sir Humphry
Davi, dan sampai sekarang, garam merupakan kebutuhan vital bagi manusia (Winarno, 1992).
Garam dapur beriodium merupakan garam konsumsi atau garam dapur biasa yang diberi tambahan senyawa iodium dan biasanya dalam ikatan senyawa kalium iodat/KIO3 (Winarno, 1992). Iodium efektif sebagai pembasmi bakteri (germisida), pada perbandingan 1:20.000 dalam larutan iodium mampu membunuh bakteri dalam waktu 1 menit dan membunuh spora dalam waktu 15 menit. Di samping bersifat bakterisida dan sporasida juga merupakan fungisida, protozoasida, cystisida, dan virusida yang bekerja efektif terhadap bakteri gram-positif dan gram-negatif (Gilman dkk., 1985).
Zat dan senyawa yang terkandung dalam garam dapur tidak hanya NaCl saja, tetapi masih banyak senyawa-senyawa yang lainnya, seperti: CaSO4, MgSO4, MgCl2, SiO2, Fe2O3, Al2O3, dan lain-lain (Winarno, 1992).
6.4 Efektifitas Larutan Garam Dapur Beriodium Terhadap Streptococcus Mutans
Pada penelitian ini digunakan metode zona hambatan untuk mengukur efektifitas larutan garam dapur terhadap Streptococcus mutans. Metode zona hambatan menggunakan paper disc yang sebelumnya direndam selama 60 detik dalam larutan garam dapur tanpa merk maupun bermerk konsentrasi 4%, 6%, dan 8%, kontrol negatifnya dipakai akuades steril. Pada penelitian ini juga diteliti efektivitas larutan iodium yang konsentrasinya setara dengan konsentrasi iodium garam bermerk 4, 6, dan 8%. Selanjutnya disc tersebut ditempelkan di atas media
MH agar darah kambing yang sudah diinokulasikan Streptococcus mutans, selanjutnya diinkubasi pada suhu 370C selama 18- 24 jam. Keesokan harinya zona bening yang tampak diukur menggunakan jangka sorong seperti terlihat pada Gambar 5.6.
Pada penelitian ini didapatkan bahwa kandungan iodium pada masing-masing garam dapur tanpa merk konsentrasi garamnya 4, 6, 8, dan 8% adalah berturut-turut 1,51; 2,26; dan 3,01 ppm. Sedangkan untuk garam dapur bermerk dengan konsentrasi yang sama 4, 6, dan 8% memberikan konsentrasi iodium berturut-turut adalah 2,19; 3,29; dan 4,38 ppm. Untuk mengetahui apakah zona hambatan terhadap Streptococcus mutans sepenuhnya akibat dari pemberian iodium, maka pada penelitian ini juga diamati pengaruh dari larutan iodium murni dengan konsentrasi yang sama dengan garam dapur bermerk, yaitu 2,19; 3,29; dan 4,38 ppm.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan antara perlakuan penggunaan garam dapur tanpa merk, bermerk, dan larutan iodium, serta kontrol ditunjukkan dengan nilai p < 0,05. Untuk mengetahui besarnya perbedaan dilakukan Post Hoc Test Tamhane (uji non-parametrik), resume hasilnya disajikan pada Tabel 5.3. Secara keseluruhan hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan larutan garam dapur konsentrasi 4% baik garam dapur tanpa merk maupun bermerk belum memberikan zona hambatan yang signifikan dibandingkan dengan kontrol. Namun demikian, untuk larutan iodium dengan konsentrasi setara dengan 4% larutan garam dapur telah memberikan zona
hambatan yang signifikan sebesar 22,16 mm ditunjukkan dengan nilai p < 0,05 (Tabel 5.3).
Peningkatan konsentrasi garam dapur tanpa merk maupun bermerk menjadi 6%, juga belum memberikan zona hambatan terhadap Streptococcus mutans. Pola yang sama masih teramati untuk perlakuan menggunakan larutan iodium yang setara dengan garam dapur bermerk 6% memberikan perbedaan zona hambatan yang signifikan sebesar 26,33 mm dibandingkan dengan kontrol (p < 0,05). Selanjutnya, peningkatan konsentrasi garam dapur tanpa merk dan bermerk menjadi 8% memberikan hasil terdapat perbedaan yang signifikan sebesar 8,33 mm untuk garam dapur bermerk dibandingkan dengan kontrol ditunjukkan dengan nilai p < 0,05. Demikian juga untuk larutan iodium yang setara dengan larutan garam bermerk 8% memberikan perbedaan zona hambatan yang signifikan sebesar 24,33 mm dibandingkan dengan kontrol ditunjukkan dengan nilai p < 0,05.
Pada penelitian ini ditemukan bahwa, walaupun garam dapur tanpa merk dan garam dapur bermerk kesemuanya telah mengandung iodium, namun belum memberikan zona hambatan terhadap Streptococcus mutans seperti perlakuan larutan iodium, kecuali untuk garam dapur bermerk 8% menunjukkan adanya zona hambatan terhadap bakteri tersebut. Seperti kita ketahui garam dapur bermerk merupakan garam konsumsi atau garam dapur biasa yang diberi tambahan senyawa iodium dan biasanya dalam ikatan senyawa kalium iodat/KIO3 (Winarno, 1992). Iodium diketahui efektif sebagai pembasmi bakteri (germisida), pada perbandingan 1:20.000 dalam larutan iodium mampu membunuh bakteri dalam waktu 1 menit dan membunuh spora dalam waktu 15 menit, disamping
mempunyai sifat bakterisida dan sporasida juga merupakan fungisida, protozoasida, cystisida, dan virusida yang bekerja efektif terhadap bakteri gram-positif dan gram-negatif (Gilman dkk., 1985). Demikian juga, telah ditemukan bahwa berkumur menggunakan larutan garam faal steril (NaCl) 0,9% dapat menurunkan jumlah bakteri sebanyak 35% (Soeparmin, 1991). Lopez (2002) juga mendapatkan bahwa berkumur menggunakan iodium 10% dapat mencegah karies gigi pada anak-anak.
Pada penelitian ini ditemukan bahwa larutan iodiumnya memberikan zona hambatan yang lebih tinggi dibandingkan dengan garam dapur bermerk pada semua konsentrasi 4%, 6%, dan 8%, walaupun kandungan iodiumnya sama. Hal ini, dapat disebabkan efek antagonis dari kedua senyawa, NaCl dan iodium sehingga efek bakterisidanya saling meniadakan atau tidak saling memperkuat.
Hasil analisis regresi linier menunjukkan bahwa konsentrasi garam bermerk dapat digunakan sebagai prediktor zona hambatan terhadap Streptococcus mutans.
