Deteksi Gen Target INH pada
DNA Sputum Basil Tahan Asam Positif
dengan Teknik Polymerase Chain Reaction
Maria Lina R,* Budiman Bela,** Mukh Syaifudin***
*Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN) **Bagian Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia
***Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi, BATAN
Abstrak: Tuberkulosis, suatu penyakit infeksi yang mengakibatkan kematian terbesar di dunia adalah salah satu emerging infectious disease, yaitu penyakit menular yang masalahnya semakin berkembang hingga kini. Masalah tuberkulosis menjadi rumit dan diperberat dengan adanya kuman Mycobacterium tuberculosis resisten terhadap obat anti tuberkulosis (OAT), seperti isoniazid (INH). Resistensi ini dapat dideteksi dengan menganalisis gen yang menyandi target INH seperti gen kat-G dan kas-A. Penelitian untuk mengetahui keberadaan gen tersebut telah dilakukan pada 25 sampel sputum BTA positif. DNA sputum diekstraksi dengan menggunakan 3 macam metode yaitu metode Boom, proteinase-K, dan pemanasan. Keberadaan gen target INH dideteksi dengan teknik PCR menggunakan 2 pasang primer oligonukleotida masing-masing untuk gen kat-G dan kas-A, yang dilanjutkan dengan proses elektroforesis gel agarosa. Dari hasil penelitian terlihat keberadaan gen kat-G pada 24 sampel dari 25 DNA sampel sputum yang diekstraksi dengan metode Boom maupun proteinase-K, 1 sampel di antaranya menunjukkan hasil negatif (tidak terlihat pita DNA), dan dengan metode pemanasan hasil negatif terlihat pada 3 sampel. Pita DNA terlihat tipis masing-masing pada 1 dan 5 sampel dari 24 sampel positif tersebut dengan menggunakan metode Boom dan proteinase-K. Dari 25 sampel sputum, 24 sampel menunjukkan hasil positif untuk keberadaan gen kas-A dan 1 sampel negatif dengan metode Boom, sedangkan dengan metode proteinase-K dan pemanasan memperlihatkan hasil negatif masing-masing pada 7 dan 16 sampel sputum. Dari hasil tersebut, terlihat bahwa untuk mendeteksi keberadaan gen kat-G dan kas-A pada DNA sputum BTA positif dengan teknik PCR, metode ekstraksi DNA yang terbaik adalah metode Boom. Modifikasi metode ekstraksi DNA yang lebih sederhana yang mendekati metode Boom, perlu untuk dilakukan.
Kata kunci: PCR, gen kat-G, gen kas-A, basil tahan asam, metode Boom, metode proteinase-K, metode pemanasan.
Detection of INH Target Genes on DNA of Positive Acid Fast Stain Sputum Using PCR Technique
Maria Lina R,* Budiman Bela,** Mukh Syaifudin***
*Center for the Application Isotopes and Radiation Technology, National Nuclear Energy Agency **Department of Microbiology, Faculty of Medicine, University of Indonesia
***Center for Radiation Safety and Metrology Technology, National Nuclear Energy Agency
Abstract: Tuberculosis, the world’s major diseases, is one of the emerging infectious diseases .
The tuberculosis problem has become complicated and burdensome due to the emergence of drug resistan such as isoniazid (INH) resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. The resistance can be detected by analyzing the genes which code the INH target genes such as kat-G and kas-A. Research to investigate the existence of the genes has being carried out on 25 positive acid fast stain sputum samples. The extraction of sputum DNA was done by means of three kind of methods including Boom’s method, proteinase-K, and boiling methods. PCR technique with two pairs of the oligonucleotide primers for kat-G and kas-A genes, subsequently continued with the agarose gel electrophoresis process, were used for detecting the existence of the genes. Results revealed that the existence of kat-G gene can be detected on 24 of the 25 sputum samples DNA which extracted by either Boom’s or proteinase-K methods, 1 sample were negative result, and by using boiling method, 3 samples showed the negative results. However, the DNA bands of 1 and 5 samples from 25 positive samples mentioned above, appeared to be thin bands by using Boom’s and proteinase-K, respectively. The existence of kas-A gene showed the positive results on 24 samples of the 25 sputum samples DNA and 1 sample was negative by means of Boom’s method, whereas with proteinase-K and boiling methods , the negative results appeared on 7 and 16 sputum samples, respectively. From the results mentioned above, it can be concluded that the best DNA extraction method is Boom’s method. However, the more simple method that is as same as Boom’s method, is necessary to be carried out.
Key words: PCR, kat-G gene, kas-A gene, INH, acid fast stain bacilli, Boom’s method,
proteinase-K method, boiling method.
Pendahuluan
Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi oleh kuman M. tuberculosis, sebagai penyebab kematian terbesar di dunia dan masih menjadi masalah kesehatan masyarakat yang serius di negara berkembang termasuk Indonesia. Menurut laporan WHO, Indonesia menduduki peringkat ke-tiga terbesar kasus tuberkulosis di dunia setelah India dan Cina.1 Bahkan TB menduduki peringkat pertama penyebab
kematian karena penyakit menular. WHO memperkirakan di Indonesia setiap tahunnya terjadi 583 000 kasus baru tuberkulosis dan 140 000 kematian akibat tuberkulosis, khususnya di pedesaan dan perkotaan yang kumuh.2
Masalah tuberkulosis diperberat dengan adanya kuman resisten terhadap obat anti tuberkulosis (OAT). Faktor yang mempengaruhi penderita TB resisten terhadap OAT sangat beragam seperti kepatuhan berobat, pemberian obat yang tidak optimal, serta mutasi (perubahan genetik) bakteri M. tuberculosis. Penderita yang terinfeksi dengan kuman
resisten tersebut merupakan sumber penularan terhadap penderita lain, keluarga, dan para petugas kesehatan yang terlibat.
Isoniazid (INH) diperkenalkan sebagai salah satu obat antituberkulosis sejak tahun 1950 dan merupakan OAT yang mempunyai aktivitas tinggi melawan M. tuberculosis kompleks.3 Isoniazid bersama dengan rifampisin dipakai
sebagai pengobatan utama penyakit tuberkulosis. Resistensi M. tuberculosis terhadap INH karena adanya perubahan asam amino akibat mutasi pada gen-gen yang menjadi target OAT tersebut seperti misalnya gen kat-G, kas-A yang masing-masing menyandi enzim katalase-peroksidase dan β-ketoacyl-ACP-synthase. Mutasi pada gen tersebut menye-babkan inaktivasi enzim yang berfungsi mengaktifkan kerja INH.3,4
Beberapa penelitian menyatakan frekuensi strain bakteri yang resisten INH mengalami mutasi pada gen kat-G sebesar ±60-70%, selebihnya resisten INH disebabkan mutasi pada gen lain.3,4 Data dari RS Persahabatan tahun 1993 menunjukkan
kuman M. tuberculosis resisten INH, serta INH dan rifam-pisin, masing-masing adalah 7,7 % dan 7,2%.5 Berdasarkan
data terakhir hasil penelitian prevalensi resistensi INH di propinsi DKI, Sumatera Barat, dan Sulawesi Selatan berkisar 11,9 % - 15,6 %.3
Beberapa metode ekstraksi DNA yang cepat, sederhana, murah dan sensitif untuk persiapan DNA dicoba dan akan digunakan pada proses PCR untuk mengetahui keberadaan gen yang menyandi target INH (kat-G dan kas-A). Metode molekuler yang meliputi PCR dan hibridisasi dot blot, PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) menggunakan probe (pelacak) berlabel radioaktif merupakan metode yang cepat dan akurat untuk mendeteksi resistensi kuman patogen.6,7 Berbagai hasil penelitian menunjukkan
bahwa metode radioaktif ternyata lebih sensitif daripada metode nonradioaktif. Oleh karena itu, deteksi dini dengan metode tersebut akan membantu dan mempercepat terapi yang tepat pada penderita tuberkulosis resisten OAT yang akan mengurangi resiko kematian penderita
Metode Kerja
Sampel Klinis dan Homogenisasi Sampel
Sampel klinis yang dipakai dalam penelitian ini adalah 25 sampel sputum penderita dengan BTA positif yang diperoleh dari Perkumpulan Pemberantasan Tuberkulosis Indonesia (PPTI), Kebayoran Baru, Jakarta-Selatan yang dilengkapi data dukung meliputi umur dan jenis kelamin . Umur penderita berkisar antara 15 - 70 tahun terdiri dari 11 laki-laki dan 14 perempuan. Sputum dihomogenisasi dan didekontaminasi dengan larutan asetil-L-sistein, NaOH, dan Na-sitrat, lalu disentrifugasi. Pelet sputum dilarutkan dalam air suling steril, kemudian dibagi menjadi tiga bagian dengan volume sama untuk diekstraksi DNA-nya menggunakan metode Boom, proteinase-K, dan pemanasan.
Ekstraksi DNA Sputum
Ekstraksi DNA dengan metode Boom8 dilakukan
dengan menggunakan larutan bufer lisis yang terdiri dari Tris-HCl, GuSCN (guanidine tiosianat) sebagai chaotropic agent, EDTA, dan Triton-X-100. Suspensi diatom digunakan untuk pengikatan DNA, sedangkan untuk presipitasinya dengan aseton dan etanol 70% dingin serta sentrifugasi pada kecepatan tinggi. DNA selanjutnya dielusi dengan bufer TE 1x dan disentrifugasi dengan kecepatan tinggi. Larutan DNA yang diperoleh siap digunakan untuk proses PCR.
Ekstraksi DNA dengan metode proteinase-K dilakukan dengan menambahkan proteinase-K ke dalam larutan pelet sputum sampai konsentrasi akhir 0,1 mg/ml. Larutan di-inkubasi pada suhu 56oC selama 6 jam kemudian dididihkan
selama 10 menit, selanjutnya disentrifugasi pada 12 000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang didapat digunakan sebagai template DNA untuk proses PCR.
Metode pemanasan dilakukan dengan menambahkan NaOH 2% ke dalam larutan pelet sputum dengan volume yang sama, dididihkan selama 2 menit, disentrifugasi pada kecepatan tinggi, kemudian ditambah dengan 1 ml Tris HCl 0,1 M (pH 6,8) disentrifugasi, selanjutnya pelet dilarutkan dalam 100 µl air suling steril, dididihkan selama 5 menit, dan disentrifugasi. Supernatan yang diperoleh dipakai untuk proses PCR.
Amplifikasi dan Deteksi DNA
DNA hasil ekstraksi sputum dan strain standar (M. tu-berculosis H37Rv) sebagai kontrol positif, diamplifikasi dengan metode PCR. Primer oligonukleotida yang dipakai pada proses PCR tersebut terdiri dari 2 pasang. Pasangan pertama adalah primer yang didisain dari bagian gen kat-G yaitu primer RTB59 (TGG CCG CGG CGG TCG ACA TT) dan RTB 36 (TCG GGG TCG TTG ACC TCC CA), sedangkan pasangan yang lain adalah kas-A 51 (ATT GAG TCG GAG AAC CCC GA) dan kas-A 31 ( CCT TCC ATA TCG GTC CGA CT) diambil dari gen kas-A.7
Proses PCR dilakukan dengan mencampur DNA tem-plate dengan campuran pereaksi PCR yang terdiri dari , larutan buffer 1x , 2,0 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,2 µM untuk tiap primer oligonukleotida, dan Taq polimerase 1,5 U/ 50 µl . Amplifikasi DNA dilakukan dengan 35 siklus dan tiap siklus meliputi tahap denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit,
annealing pada suhu 64oC selama 1 menit, dan extension
pada suhu 72oC selama 2 menit. Hasil amplifikasi DNA
dideteksi dengan teknik elektroforesis pada gel agarosa 1,5%, diwarnai dengan larutan etidium bromida, dan divisualisasi dengan UV transilluminator kemudian difoto dengan kamera Polaroid. Besarnya fragmen DNA ditentukan dengan meng-gunakan penanda berat molekul (marker) DNA Ladder.
Hasil
Hasil deteksi keberadaan gen kat-G dengan teknik PCR dan elektroforesis gel agarosa pada DNA sampel sputum hasil ekstraksi dengan tiga metode, dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 menunjukkan dengan menggunakan metode ekstraksi menurut Boom, keberadaan gen kat-G terlihat jelas/ tebal pada 23 sampel sputum, pita DNA terlihat tipis pada 1 sampel, sedangkan pada 1 sampel lain tidak terlihat adanya pita DNA (hasil negatif). Keberadaan gen kat-G pada DNA sputum yang diekstraksi dengan metoda proteinase-K memperlihatkan juga hasil positif pada 24 sampel, namun pada 5 sampel pita DNA terlihat tipis. Dari 25 sampel sputum tersebut yang diekstraksi dengan metode pemanasan, menyatakan hasil positif dengan pita DNA jelas pada 15 sampel sedangkan pita DNA nampak tipis pada 7 sampel, dan 3 sampel menunjukkan hasil negatif. Besarnya fragmen DNA yang menunjukkan keberadaan gen kat-G adalah 804 base pair (bp) (Gambar 1).
Tabel 1. Hasil Deteksi gen kat-G pada DNA Sputum BTA Po-sitif yang Diekstraksi dengan 3 Macam Metode, Meng-gunakan Teknik PCR
J e n i s Hasil Metode ekstraksi DNA
(umur) B o o m Protein-K Pemanasan
L (39) +1 + + +(tipis) P (43) +1 + +(tipis) + L (25) +1 + + + P (22) +1 + +(tipis) +(tipis) L (23) +2 + + + P (22) +1 - - -P (-) +1 + + + P (25) +3 + + + P (24) +3 + + + L (66) +1 + + + P (24) +3 + + + L (55) +2 + + + P (28) +1 + + +(tipis) L (38) +2 + + + L (34) +2 + + +(tipis) P (-) +1 + + -L (30) +2 + + +(tipis) L (31) +1 + + (tipis) +(tipis) P (32) +1 + + (tipis) -L (50) +1 + + + P (24) +1 + + + P (60) +2 + + + P (28) +3 + + +
L (70) +1 +(tipis) +(tipis) + (tipis)
P (17) +3 + + +
Catatan:
+: Pita DNA terlihat jelas; + tipis: Pita DNA terlihat tipis
Gambar 1. Hasil deteksi keberadaan gen kat-G dengan tek-nik PCR yang dielektroforesis pada gel agarosa 1,5% untuk ketiga jenis metode ekstraksi DNA. Lajur dari kiri ke kanan adalah marker, kontrol positif, sampel no. 19 (metode Boom), sampel no.19 (metode proteinase-K), sampel no.19 (metode pe-manasan), kontrol negatif, kontrol positif, sampel no 15 (metode Boom), sampel no. 15 (metode pro teinase-K), dan sampel no. 15 (metode pemana-s a n )
M K+ 1 9 1 9 1 9 K - K+ 1 5 1 5 1 5
(I) (II) (III) (I) (II) (III)
Hasil deteksi keberadaan gen kas-A dengan meng-gunakan teknik PCR dan elektroforesis gel agarosa pada DNA sampel sputum yang diekstraksi dengan ketiga metode tersebut disajikan pada tabel 2. Metode Boom memper-lihatkan hasil positif pada 24 sampel sputum yang terdiri dari 19 sampel dengan pita DNA terlihat jelas, 5 sampel terlihat tipis, dan 1 sampel menunjukkan hasil negatif. Keberadaan gen kas-A terlihat pada 18 sampel sputum yang diekstraksi dengan metode proteinase-K dan dari jumlah tersebut 6 sampel menunjukkan pita DNA tipis. Hasil negatif terdapat pada 7 sampel. Hasil positif adanya gen kas-A terlihat pada 9 DNA sputum yang diekstraksi dengan metode pemanasan dan pita DNA nampak jelas hanya 1 sampel di antaranya, sedangkan 16 sampel menunjukkan hasil negatif. Fragmen DNA yang menyatakan keberadaan gen kas-A, adalah 1389 bp (Gambar 2).
Tabel 2. Hasil Deteksi Gen kas-A pada DNA Sputum BTA Positif yang Diekstraksi dengan 3 Macam Metode, Menggunakan Teknik PCR
J e n i s Metode ekstraksi DNA
(umur) Hasil Boom Proteinase-K Pemanasan
L (39) +1 + +(tipis) -P (43) +1 + +(tipis) -L (25) +1 + +(tipis) +(tipis) P (22) +1 +(tipis) - -L (23) +2 + +(tipis) +(tipis) P (22) +1 - - -P (-) +1 + + -P (25) +3 + + +(tipis) P (24) +3 + + +(tipis) L (66) +1 + +(tipis) +(tipis) P (24) +3 + + +(tipis) L (55) +2 + + +(tipis) P (28) +1 +(tipis) - -L (38) +2 + +(tipis) -L (34) +2 + + -P (-) +1 +(tipis) - -L (30) +2 + + -L (31) +1 +(tipis) - -P (32) +1 + - -L (50) +1 + + + P (24) +1 + + -P (60) +2 + + -P (28) +3 + + -L (70) +1 +(tipis) - -P (17) +3 + + +(tipis) Catatan:
+: Pita DNA terlihat jelas; + (tipis): Pita DNA terlihat tipis Diskusi
Berdasarkan hasil PCR yang mendeteksi keberadaan gen kat-G maupun kas-A dengan 3 metode ekstraksi tersebut, hasil positif gen kat-G lebih besar demikian juga intensitas pita DNA lebih tinggi daripada gen kas-A. Hal ini ke-mungkinan disebabkan besarnya fragmen DNA pada daerah target yang diamplifikasi untuk gen kas-A (1389 bp) lebih besar dari gen kat-G (804 bp), sehingga daerah yang
diam-M K+ 1 5 1 5 1 5 K - K+ 1 9 1 9 1 9
(I) (II) (III) (I) (II) (III)
Gambar 2. Hasil deteksi keberadaan gen kas-A dengan tek-nik PCR yang dielektroforesis pada gel agarosa 1,5% untuk ketiga jenis metode ekstraksi DNA. Lajur dari kiri ke kanan adalah marker, kontrol positif, sampel no. 15 (metode Boom), sampel no. 15 (metode proteinase-K, sampel no.15 (metode pemanasan), kontrol negatif, kontrol positif, sam-pel no 19 (metode Boom), samsam-pel no. 19 (metode proteinase-K), sampel no. 19 (metode pemanasan)
plifikasi lebih sedikit yang menunjukkan intensitas fragmen DNA rendah ataupun hasil negatif (pita DNA tidak terdeteksi). Kemungkinan lain batas deteksi hasil PCR dengan teknik elektroforesis terbatas (secara kasat mata) sehingga hasil negatif. Untuk meningkatkan hasil deteksi, hasil PCR dapat dideteksi dengan menggunakan teknik hibridisasi dengan pelacak DNA spesifik.
Keberadaan gen kat-G dan kas-A pada DNA 1 sampel sputum hasil ekstraksi dengan ketiga metode, yaitu sampel no.6 memperlihatkan hasil negatif. Hasil PCR dengan menggunakan primer oligonukleotida yang disintesis dari bagian insertion sequence M.tuberculsosis (IS6110), yaitu Pt 8 dan Pt 9 untuk mendeteksi adanya M. tuberculosis pada sampel yang sama, menunjukkan hasil positif dengan besar fragmen DNA= 541 bp (data belum dipublikasi). Beberapa kemungkinan yang menyebabkan adalah baik gen kat-G maupun kas-A masing-masing terdapat 1 kopi dalam 1 genom M. tuberculosis, sedangkan sebagian besar M. tuberculosis mempunyai 8-15 kopi IS6110 bahkan beberapa strain mempunyai 27 kopi IS6110,9,10 dan 16 kopi dalam M.
tuber-culosis H37Rv.11 Makin banyak kopi fragmen DNA target,
sensitivitas PCR makin tinggi yang dinyatakan dengan hasil positif yang makin besar. Keberadaan gen rpoß (RNA polimerase subunit ß) yang merupakan gen target rifampisin
pada M. tuberculsosis pada sampel yang sama memper-lihatkan juga hasil positif, dengan besarnya produk PCR = 158bp.12 Hal yang memungkinkan seperti telah dijelaskan di
atas, fragmen DNA yang menjadi daerah target kecil sehingga daerah yang diamplifikasi lebih banyak dinyatakan dengan terdeteksinya fragmen DNA tersebut (hasil positif).
Setelah mengaksenasi ketiga metode ekstraksi yang digunakan terlihat bahwa metode Boom lebih baik dari pada metode yang lain pada proses PCR, baik untuk menentukan keberadaan gen kat-G maupun gen kas-A. Bufer lisis yang mengandung GUSCN sebagai chaotropic agent melisis sel pada sampel sehingga akan mengeluarkan DNA, merupakan tahap pertama dalam metode ini. GuSCN dalam konsentrasi tinggi mengakibatkan DNA akan terikat pada diatom (fosil dari dinding sel alga uniselular) yang akan diendapkan dengan sentrifugasi. Presipitasi DNA selanjutnya dilakukan dengan etanol 70%, aseton, dan dikeringkan. DNA kemudian dielusi dengan buffer sehingga melalui tahapan tersebut akhirnya didapat DNA dalam larutan yang diharapkan murni. Pada penelitian ini, hasil PCR positif dari DNA sputum yang diekstraksi dengan metoda Boom ini, umumnya pita DNA terlihat tebal. Hal ini disebabkan DNA hasil ekstraksi relatif murni sehingga tidak ada/sedikit inhibitor pada proses PCR. Metode ekstraksi DNA dengan menggunakan protein-ase-K didasarkan pada daya larut DNA M. tuberculosis karena perlakuan dengan proteinase-K. Sel M. tuberculosis mengandung beberapa protein yang sebagian terikat dengan lipid dan polisakarida.13 Metode ini lebih sederhana
diban-dingkan dengan metode Boom. Beberapa peneliti telah menggunakan metode ini dengan penambahan nonionic detergent seperti triton X-100, untuk mengekstraksi DNA M. tuberculosis.14,15 Perlakuan proteinase-K dengan nonionic
detergent untuk mengekstraksi DNA yang dapat diamplifikasi apabila suspensi ataupun sampel mengandung 103 atau lebih
sel mikroorganisme.16 Dalam penelitian ini, ekstraksi DNA
dilakukan lebih sederhana yaitu hanya dengan penambahan proteinase-K tanpa nonionic detergent. Penelitian Arias-Bouda et al17 menggunakan metode ini untuk deteksi
lipo-arabinomannan (LAM) M. tuberculosis dengan teknik ELISA. Metode alternatif lain yang sederhana untuk ekstraksi DNA adalah metode pemanasan. Pemanasan suspensi sel bakteri M. tuberculosis melisiskan ± 95% sel .18 Metode ini
juga telah dilakukan untuk ekstraksi DNA M. tuberculosis dalam sampel sputum.19 Dengan pemanasan, sel bakteri dalam
buffer lisis akan terlisis dan DNA akan terekstraksi. Gambar 1 dan 2, juga memperlihatkan perbedaan intensitas fragmen/ pita DNA keberadaan gen kat-G dan kas-A hasil PCR dengan menggunakan 3 metode ekstraksi DNA.
Penelitian masih dilanjutkan dengan analisis mutasi bagian gen kat-G dan kas-A yang menyandi target INH untuk mengetahui M. tuberculosis resisten INH. Teknik yang digunakan adalah hibridisasi dengan pelacak DNA berlabel radionuklida/non radionuklida atau dengan teknik SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) dengan
radioaktif maupun non radioaktif yang dilanjutkan dengan teknik sequencing.
Kesimpulan
Keberadaan gen kat-G dengan teknik PCR dapat terdeteksi pada 24 sampel dari 25 sampel sputum dengan menggunakan metode ekstraksi DNA Boom maupun pro-teinase-K. Intensitas pita/fragmen DNA rendah (pita DNA tipis) pada 1 sampel dan 5 sampel masing-masing dengan metodae Boom dan proteinase-K. Dengan metode pema-nasan, 3 sampel menunjukkan hasil negatif, dan 22 sampel dapat terdeteksi dengan 7 di antaranya mempunyai intensitas rendah (pita tipis).
Hasil deteksi keberadaan gen kas-A dengan menggu-nakan metode ekstraksi DNA menurut Boom, proteinase-K, dan pemanasan berturut-turut memperlihatkan hasil positif pada 24 , 18, dan 9 sampel sputum.
Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa metode ekstraksi DNA Boom memang lebih baik daripada kedua metode ekstraksi yang lain. Namun prosedur pelaksanaannya cukup panjang dan memerlukan berbagai reagen kimia yang relatif banyak. Metode proteinase-K juga cukup baik, akan tetapi perlu dicari modifikasi metodenya sehingga hasilnya dapat lebih baik.
Daftar Pustaka
1. Dye C, Scheele S, Dollin P. Global burden of tuberculosis. JAMA 1999;282:677-86
2. Direktorat Jendral Pemberantasan Penyakit Menular dan
Penyehatan Lingkungan Pemukiman, Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Pedoman Pemberantasan Tuberkulosis Paru. Jakarta; 2000.
3. Alamsjah B. Epidemiologi genetik serta faktor risiko
Mycobac-terium tuberculosis yang resisten INH dan atau rifampisin. Disertasi Program Doktor Ilmu Kesehatan Masyarakat, Program Pascasarjana, Fakultas Kesehatan Masyarakat, Universitas Indo-nesia; 2003.
4. Ramaswamy SV, Reich R, Dou SJ, Jasperse L, Pan X, Wanger A,
et al. Single nucleotide polymorphisms in genes associated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicro-bial Agents and Chemotherapy 2003;47:1241-50.
5. Basri C. Program nasional pemberantasan tuberculosis, Seminar Nasional “Quality Assurance Programme for Molecular-Based Diagnosis of Hepatitis C and Tuberculosis.” Jakarta; 2003.
6. Victor TC, Jordaan AM, van Rie A, van der Spuy GD, Richardson
M.van Holden PD, et al. Detection of mutation in drug resis-tance genes of Mycobacterium tuberculosis by a dot-blot hybrid-ization strategy. Tubercle and Lung Disease 1999; 79:343-8. 7. Morris S, Bai GH, Suffys P, Portillo-Gomez L, Fairchok, Rouse
D. Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical
isolates of Mycobacterium tuberculosis . The J of Infec Dis 1995;171:954-60.
8. Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, Jansen CL, Wertheim-van
illen PME, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J Clin Microbiol. 1990;28:495-03.
9. Rish JA, Eisenach KD, Cave MD, Reddy MV, Gangadharam
PRJ, Bates JH. Polymerase chain reaction detection of
Myco-bacterium tuberculosis in formalin-fixed tissue. Am J Respir Crit Care Med 1996;153:1419-23.
10. Fomukong NG, Tang TH, Al-Maamary S, Ibrahim WA, Ramayah S, Yates, et al. Insertion sequence typing of Myco-baacterium
tuberculosis: characterization of a widespread subtype with a single copy of IS6110. Tubercle and Lung Disease 1994;75:435-40.
11. Philipp WJ, Poulet S, Eiglmeier K, Pascopella L, Balasubramanian V, Hyem B. et al. An integrated map of the genome of the tubercle bacillus, ycobacterium tuberculosis H37Rv, and
compari-son with Mycobacterium leprae. Proc Natl Acad Sci 1996; 93:3132-7.
12. Maria Lina R, Suprihadi T, Syaifudin M, Bela B. Deteksi gen rpoß dengan teknik polymerase chain reaction pada sputum basil tahan positif. Prosiding Presentasi Ilmiah Keselamatan Radiasi dan Lingkungan X, Puslitbang Keselamatan Radiasi dan Biomedika Nuklir, BATAN; 2004.
13. Brooks GF, Butel JS, Ornston LN, Jawets E, Melnick Jl, Adelberg EA. Medical Microbiology. 20 th edition. Norwalk, Connecticut: Appleton & Lange; 1995.p.263-71.
14. Kolk AHJ, Kox LFF, van Leeuwen J, Kuijper S. Polymerase chain reaction for the Mycobacterium tuberculosis complex. Amsterdam, The Netherland. Laboratory of Tropical Hygiene, Department of Biomedical Research Royal Tropical Institute; 1995:1-35.
15. Pierre C, Lecossier D, Boussougant Y, Bocart D, Joly V, Yeni P et al. Use of reamplificaion protocol improves sensitivity of detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by amplification of DNA. J Clin Microbiol 1991;29:712-7. 16. Bulk GE, O’Hara LC, Summersgill JT. Rapid, simple method for
treating clinical specimens containing Mycobacterium
tubercu-losis to remove DNA for polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1992;30:1331-4
17. Arias-Bouda LMP, Nguyen LN, Ho, Lym, Kuijper S, Jansen HM, Kolk AHJ. Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples. J Clin Microbiol 2000;38:2278-83.
18. Nolte FS, Metchock B, McGowan Jr JE, Edwards A, Okwumabua O, Thurmond C. Direct detection of Mycobacterium
tuberculo-sis in sputum by polymerase chain reaction and DNA hybridiza-tion. J Clin Microbiol 1993;31:1777-82.
19. Kocagoz T, Yilmaz E, Ozkara S, Kocagos S, Hayran M, Sachedeva M. et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples by polymerase chain reaction using a simplified proce-dure. J Clin Microbiol 1993;31:1435-8.
