DEMONTRASI REKAYA GENETIKA BAKTERI DEMONTRASI REKAYA GENETIKA BAKTERI
PRAKTIKUM V PRAKTIKUM V
ISOLASI DAN PENENTUAN POPULASI BAKTERI DAN JAMUR
ISOLASI DAN PENENTUAN POPULASI BAKTERI DAN JAMUR DARI RIZOSFER, FILOSFERDARI RIZOSFER, FILOSFER DAN SPERMOSFIR
DAN SPERMOSFIR
Tujuan Umum: Tujuan Umum:
1.
1. MemisMemisahkaahkan bakteri dan jan bakteri dan jamur yang bermur yang berasal darasal dari alam misai alam misalnya udalnya udara, air,ra, air, tanah, rizosfer, filosfer atau spermosfir, ataupun dari suatu susupensi yang tanah, rizosfer, filosfer atau spermosfir, ataupun dari suatu susupensi yang mengandung beberapa jenis
mengandung beberapa jenis mikroba.mikroba. 2.
2. MengiMengisolasolasi suatsi suatu isolau isolate (genute (genus / spesies / spesies) baktes) bakteri dan jamri dan jamurur 3.
3. MendaMendapatkapatkan biakan biakan murnn murni i yaitu syaitu suatu kuuatu kultur mltur murni yurni yang haang hanya ternya terdiri adiri atastas satu jenis/ iso
satu jenis/ isolate ( Genus/ Speslate ( Genus/ Spesies) bakteri ies) bakteri dan jamurdan jamur.. Teori Umum
Teori Umum T
Tananamaman an dadan n jujuga ga babagigian an tatananamaman n tetertrtenentu tu memerurupapakakan n hahabibitatat t babagigi m
miikkrroooorrggaanniissmmee. . HuHubbuunnggaan n mmiikkrroooorrggaanniissmme e ddeennggaan n ttaannaammaan n ddaappaatt me
mengngununtutungngkakan n mamaupupun un memerurugigikakan n tatananamaman. n. BaBagigian an dadari ri tatananamaman n yayangng be
berarasososisiasasi i spspesesififik ik dedengngan an mimikrkroooorgrgananisisme me adadalalah ah ririzozosfsferer, , fifilolosfsfer er dadann spermosfer.
spermosfer. Ri
Rizozosfsfer er adadalalah ah zozona na kokontntak ak anantatara ra akakar ar dadan n tatananah h yayang ng lalangngsusungng mempengaruhi metabolisme. Zone ini mengandung mikroorganisme lebih banyak mempengaruhi metabolisme. Zone ini mengandung mikroorganisme lebih banyak dar
dari i padpada a zonzone e di di lualuarnyrnya a karkarena ena memengangandndung ung sejsejumlumlah ah ekseksududat at akaakar r sebsebagaagaii sumber nutrisi mikroorganisme.
sumber nutrisi mikroorganisme. Filos
Filosfer fer adaladalah ah daerdaerah ah permpermukaan ukaan tanatanaman man yang yang berhberhubuubungan ngan langlangsungsung dengan udara atmosfer yang meliputi daun, pucuk daun, helai bunga dan kuntum dengan udara atmosfer yang meliputi daun, pucuk daun, helai bunga dan kuntum bung
bunga, a, SperSpermosfmosfir ir adalaadalah h daerdaerah ah yang yang melimelingkupngkupi i permpermukaaukaan n biji biji (ben(benih) ih) yangyang sedang bergerminasi.
sedang bergerminasi.
Isolasi mikroba dapat dilakukan dengan tiga
Isolasi mikroba dapat dilakukan dengan tiga cara:cara: a.
a. MetMetode Gode Goreores (Sts (Streareak Platk Plate Methe Method)od)
Pada metode ini, satu ose suspense dari sumber isolate digoreskan k eatas Pada metode ini, satu ose suspense dari sumber isolate digoreskan k eatas permukaan plat agar. Penggoresan dilakukan beberapa kali dalam satu plat permukaan plat agar. Penggoresan dilakukan beberapa kali dalam satu plat ag
agar ar dedengngan an tutujujuan an memengnghahasisilklkan an kokololoni ni teterprpisisahah. . PlPlat at agagar ar tetersrsebebutut diin
mikroba membentuk koloni. Setiap satu koloni dianggap berasal dari satu sel mikroba.
Setelah masa inkubasi satu atau dua hari, plat agar akan ditumbuhi berbagai jenis koloni dengan pola pertumbuhan koloni sesuai dengan alur goresan
kultur. Setelah kita beda- bedakan koloni yang tumbuh berdasarkan sifta-sifat koloninya (warna, konfigurasi/ bentuk, margin/ tepian dan elevasi.
Dengan metode ini, koloni yang terpisah pindahkan ke media agar miring untuk dimurnikan danmemperoleh biakan murni. Metode ini tidak dapat menghitung populasi mikroba dalam suatu substrat.
b. Metode tuang (pour Method) atau metode pengenceran plat (Dilution plate method)
Pada metode ini media agar steril yang belum membeku (temperature tidak lebih dari 450c) Kedalam cawan petri steril yang mengandung suspense mikroba pada volume dan pengenceran tertentu. Pada suhu ini agar belum membeku dan mikroba ini tidak mati. Cawan petri yang berisi suspense mikroba dan media agar digerakkan ke kiri, ke kanan dan diputar beberapa kali agar suspense bakteri tersebar merata dalam media biarkan membeku, kemudia inkubasikan selama 1-2 hari dengan petridisk diletakkan terbalik. Setelah inkubasi akan terlihat beberapa jenis koloni mikroba yang tumbuh menyebar. Populasi mikroba dihitung berdasarkan jumlah koloni yang terbentuk. Koloni yang terpisah dapat dimurnikan untuk memperoleh biakan murni.
Pengenceran
Pengenceran suatu sumber isolat dilakukan untuk menurunkan konsentrasi sel mikroorganisme di dalam substrat/ sumber isolate sehingga dengan metode tuang akan didapatkan koloni terpisah di atas plat agar dengan jumlah antara 30-300 per plat agar.
c. Metode Replika bahan tanaman
Pada metode ini kita menempelkan bahan tanaman seperti daun, biji, atau batang ke tatas plat agar selama 5 menit. Mikroba yang menempel di atas plat akan tumbuh setelah masa inkubasi 1- 3 hari.
5.1 ISOLASI DAN PENENTUAN POPULASI BAKTERI DAN JAMUR RIZOSFIR DENGAN METODE TUANG
Tujuan:
Teori:
Metode penghitungan ini adalh metode tidak langsung yang banyak digunakan untuk menentukan populasi mikroba di dalam tanah. Langkahnya diawali dengan pengenceran suspense tanah, lalu menumbuhkan mikroba yang ada dalam suspense tanah di dalam plat aga. Jumlah koloni yang tumbuh menggambarkan mikroba yang terdapat di dalam suspense sehingga satuan dalam penghitungan adalah CFU( colony Forming Unit).
Dengan metode ini diasumsikan bahwa satu koloni berasal dari satu sel mikroba. Jumlah mikroba dalam satu gram tanah contoh (CFU/gr) dihitung dengan membagi jumlah koloni yang tumbuh dengan factor pengenceran. Metode inihanya
menghitung bakteri hidup, dan tidak selamanya satu koloni berasal dari satu sel bakteri. Selain itu, tidak semua mikroba tanah dapat tumbuih pada media yang di pakai.
Bahan dan Alat
1. Tanah rizosfer tanaman pangan / sayuran 2. Akuades Steril
3. Pipet steril ukuran 1,0 dan 10 ml, tabung reaksi steril 18 ml, cawan petri, kuas
4. Media agar nutrisi ( 3 gram beef extract, 5 gram agar, 1L akuades)
5. Media potato dextrose agar (PDA) (200 g kentang, 10 g dekstrosa, 15 g agar-agar, 0,2 g CaCO3, 0,2 gr MgSO47H2O, 1L akuades)
Cara kerja
1. Koleksi tanah rizosfer dengan cara mengambil tanah yang menempel di perankan dengan bantuan kuas. Tanah non rizosfer diambil dari tanah di luar perakaran
2. Suspensikan 1 gram tanah ke dalam 9 ml akuades sehingga dapat suspense tanah dengan pengenceran 10-1. Kocok selama lima menit dan biarkan selama 15 detik.
3. Denagn pipet steril ambil 1 ml suspense tanah 10-1 dan pindahkan ke tabung berisi 9 ml aquades steril(10-2) kocok sampai merata.
5. Dari pengenceran 10-6,10-7 ambil masing-masing 0,5 ml suspensi masukkan ke dalam dua cawan petri steril. Tuangkan 15 ml media agar nutrisi untuk perhitungan bakteri. Goyangkan cawan petri steril.. Goyangkan cawan petri supaya suspense dan media tercampur homogen.
6. Dengan pengenceran 10-3,10-4 ambil masing- masing 0,5 ml susupensi masukan ke dalam dua cawan petri steril . Tuangkan 15 ml media PDA untuk perhitungan jamur. Goyangkan cawan petri steril.. Goyangkan cawan petri supaya suspense dan media tercampur homogen.
7. Inkubasikan 24 jam di dalam incubator pada suhu 300c
8. Tentukan isolate bakteri atau jamur yang tumbuh berdasarkan karekteristik koloni
9. Hitung koloni bakteri / jamur di permukaan atau sedikit di bawah permukaan media. Jumlah koloni yang memenuhi syrat adalah 30- 300 CFU/ plat agar. 10.Hitung koloni bakteri / jamur per gram tanah adalah
Rata- rata kolon Pengenceran
Contoh: jika pada pengenceran 10-6 terdapat 150 koloni maka jumlah bakteri per gram tanah adalh
150: 10-6= 15 x 106 CFU/g
Mikroba CFU/ g tanah pada pengenceran Populasi total (CFU /g)
10-3 10-4 10-6 10-7
Bakteri Jamur
Pengamatan: Katakteristik isolate bakteri dan jamur Isolat Bakteri berdasarkan karakteristik koloni
Isolat 1 Isolat 2 Isolat 3 Isolat 6
Isolat 5 Isolat 6
Isolat Jamur berdasarkan karakteristik koloni Isolat 1 Isolat 2 Isolat 3 Isolat 6 Isolat 5 Isolat 6
5.2ISOLAT BAKTERI DAN JAMUR DARI SUSPENSI CAMPURAN DENGAN METODE GORES
Tujuan:
Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi dan memperoleh biakan murni bakteri dan jamur dari rizosfer beberapa jenis tanaman.
Bahan dan alat:
1. Susupensi tanah dengan pengenceran 10-2
2. Media Nutrisi agar (NA) dan Potato dextrose agar (PDA) steril. 3. Ose, pertridish steril Lmpu spirtus
4. Media Agar miring NA dan PDA
Cara kerja:
1. Taung 10 ml media Nutrisi agar (NA) steril yang masih panas/ mencair ke dalam petridish steril secra a aseptic. Biarkan membeku.
2. Lakukan prosedur yang sama dengan media PDA
3. Ambil satu ose suspense tanah, lalu buat goresan-goresan pada permukaan plat agar NA dengan cara simple streak.
4. Lakukan prosedur Pada point 3 ke permukaan plat agar PDA
5. Inkubasi selam 24- 48 jam sampai koloni bakteri dan jamur tumbuh. Amati koloni yang tumbuh. Setiap koloni yang terpisah adalah satu isolate.
6. Ambil isolate dengan menggunakan ose, tanamkan pada agar miring NA untuk bakteri dan pada agar miring PDA untuk jamur. Penanaman dilakukan dengan membuat goresan sebanyak mungkin di permukaan agra miring
7. Inkubasikan paing sedikit 24 jam, hasilnya adalah biakan murni bakteri dan jamur
Pengamatan:
Isolat Karakteristik koloni bakteri 1
2 3
Isolate Karakteristik koloni jamur 1
2 3
5.3Isolat bakteri dan jamur dari filosfer dan spermosfer metode replica Tujuan:
Untuk membuat ataun memperoleh biakan murni bakteri dan jamur dari filosfer beberapa jenis tanaman
Bahan dan alat:
1. Daun dan biji tanaman yang masih segar 2. Media nutrisi Agar (NA) dan PDA steril
3. Pinset steril, cawan petri steril, ose steril, lampu spirtus Cara kerja:
1. Tuangkan 10 ml media Nutrisi agar steril yang masih panas/ cair ke dalam cawan petri steril secara aseptic. Biarkan membeku
2. Ambil satu lembar daun atau satu biji benih, dan letakkan berdampingan di permukaan agar.
3. Tekan permukaan daun dan biji, tutup kembali cawan petri dan biarkan selama 5 menit
4. Angkat daun dan biji. Tutup kembali cawan petri
5. Kultur inkubasi selama 1-2 hari dengan posisi tutup cawan di bagian bawah
6. Amati pertumbuhan bakteri di permukaan agar, isolate bakteri diisolasi koloni yang terpisah
7. Lakukan langkah 1-5 dengan menggunakan media PDA untuk isolasi jamur
Pengamatan:
6. Gambarkan penyebaran koloni bakteri dan jamur dari filosfer dan spermosfir di atas media agar
7. Tentukan jenis koloni yang ada berdasrkan karakteristik koloni 8. Hitung jumlah koloni jika memungkinkan
PRAKTIKUM VI
UJI METABOLISME BAKTERI FOTOSINTETIK PADA KONDISI GELAP DAN TERANG
Tujuan:
1. Membandingkan populasi sianobakteri (bakteri fotosintesis) yang di tumbuhkan pada kondisi tanpa dan dengan sinar matahari
2. Membandingkan morfologi mikroskofis sianobakteri yang tumbuh pada kondisi gelap dan terang
Teori:
Tipe metabolisme Fotoautotroph terdapat pada sianobakteri yang memiliki pigmen klorofil untuk menangkap energy cahaya dalam bentuk foton. Pada tipe metabolisme ini, bakteri memfiksasi Co2 menjadi C6H12O6 melalui proses fotosintesis. Berbeda dengan tanaman tinggi, fotosintesis bakteri hijau hanya berlangsung dalam satu tahap fotosistem.
Di daerah tropis beberapa sianobakteri hidup di permukaan tanah yang lembab dan ditanah sawah dengan intensitas cahaya tinggi. Populasi terbanyak terdapat di lapisan tanah dekat permukaan tanah lembab. Sianobakteri dianggap penting karena berperan sebagai produsen makanan melalui fotosintesis,dan beberapaspesies dapat memfiksasi nitrogen udara.
Metode untyuk menentukan kemampuan proliferasi bakteri hijau adalah perhitungan tidak langsung untuk menduga populasi sianobakteri adalah metode most probable number. Pada metode ini suspense tanah diencerkan dan ditumbuhkan pada media cair yang selektif sehingga hanya alga yang bersifat fotosintetik yang dapat tumbuh selama inkubasi di tempat yang mendapat cahaya. Bahan dan Alat:
1. Contoh tanah sawah segar dari lapisan aerob (0-3 cm dari opermukaan tanah)
2. Akuades steril
3. Pipet steril 0.1 ml dan 10 ml, 30 tabung reaksi 100 ml gelas objek dan gelas penutup
4. Medium Gerlof dengan N untuk menghitung sianobakteri total. Cara kerja:
1. Buat pengenceran tanah sampai 10-6 dengan metodeyang dijelaskan pada praktikum 5
2. Pindahkan dari pengenceran 10-1, 10-2 dan 10-3 masing- masing 0.5 ml kedalam 5 buah tabung reaksi berisi ml medium cair Gerlof
3. Susun ke 15 tabung di rak sesuai dengan pengencerannya
4. Buat dua seri kultur. Inkubasisatu seri di tempat gelap dan lainnya di tempat terang selama 2 minggu.
5. Amati pertumbuhan sianobakteri setiap minggu dengan mengidentifikasi warna hijau di dalam larutan ataupun didasar permukaan larutan.
6. Catat jumlah tabung pertumbuhan positif dari setiap deret pengenceran 10-1,
10-2 dan 10-3
7. Pendugaan populasi alga ditentukan dengan metode MPN dibawah ini.
8. Ambiol beberapa tetes larutan dari tabung yang menunjukan pertumbuhan, pindahan ke gelas objek dan amati morfologi sianobakteri.
Metode MPN
1. Hitung dan catat jumlah tabung setiap pengenceran yang menunjukan terjadinya pertumbuhan alga.
2. Bandingkan dengan table probabilitas. Catat bahwa daftar kolom sebagai kode yang terdiri atas tiga buah angka. Angka tersebut menunjukkan jumlah nilai positif pada setiap pengenceran tuga kali berturut- turut.
3. Kode berhubungan dengan nilai 40 pada table probabilitas. Nilai ini merupakan most probale number untuk mikroba pada pengenceran kedua yang ditentukan menurut teori probabilitas tertentu.
4. Berdasarkan table tersebut maka MPN untuk alga dalam 1 ml pengenceran 10-2 adalah 40 sehingga MPN sianobakteri/ g tanah asal adalah 100 x 40 = 4000 MPN/g
Pengamatan
Jumlah tabung positif pada setiap pengenceran
a pengencran
10-1 10-2 10-3
Terang 5 5 5
Morfologi sianobakteri di tempat terang Morfologi sianobakteri di tempat gelap MPN sianobakteri di tempat terang: >1600 x 100=
>160000 MPN/g
MPN sianobakteri di tempat gelap: <1.8 x 100 = 180 MPN / g
