8
III.
MATERI DAN METODE PENELITIAN
A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian
1. Materi Penelitian
1.1. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biakan murni Hypoxylon sp. koleksi CV. Asa Agro Corporation - Cianjur, agar, kentang, ekstrak yeast, ekstrak malt, peptone, makanan anjing kering merk Pedigree, oatmeal instant, dekstrosa, alkohol 70%, akuades dan spirtus.
1.2. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoclave, Laminar Air Flow, labu Erlenmeyer, gelas ukur, alumunium foil, pH indicator strips, water bath, timbangan analitik, stirer, kertas saring, hot plate, oven, pipet ukur, tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, bor gabus, kapas, label, sprayer, penggaris, bunsen, dan plastik pembungkus.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikologi dan Fitopatologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto, pada bulan Oktober-Desember 2014.
B. Metode Penelitian
1. Rancangan Percobaan
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan perlakuan berupa penumbuhan inokulum Hypoxylon sp.pada beberapa macam medium:
M1 = Hypoxylon sp. ditumbuhkan pada medium Malt Yeast Peptone Agar (MYPA)
M2 = Hypoxylon sp. ditumbuhkan pada medium Potato Dextrose Yeast Agar (PDYA)
M3 = Hypoxylon sp. ditumbuhkan pada medium Oatmeal Malt Yeast Agar (OMYA)
9
M4 = Hypoxylon sp. ditumbuhkan pada medium Malt Extract Agar (MEA)
M5 = Hypoxylon sp. ditumbuhkan pada medium Dog Food Agar (DFA) Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali sehingga terdapat 25 unit percobaan. Variabel yang digunakan adalah variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas berupa jenis medium sedangkan variabel tergantungnya yaitu pertumbuhan miselium Hypoxylon sp. Parameter utama yang diamati adalah diameter koloni miselium jamur pada medium padat per hari sedangkan parameter pendukungnya yaitu pH awal medium, kecepatan pertumbuhan koloni miselium dan berat kering miselium.
10 2. Diagram Alir
Sterilisasi alat dan bahan
Pembuatan medium uji Peremajaan isolat Hypoxylon sp. pada
medium PDA
Pembuatan medium Potato Dextrose
Agar (PDA)
Pengukuran pH awal medium
Inokulasi Hypoxylon sp. pada medium uji
Pengukuran diameter koloni miselium
Hypoxylon sp.
Pengukuran berat kering miselium
Hypoxylon sp.
Analisis data
11 3. Cara Kerja
3.1. Sterilisasi Alat (Volk & Wheeler, 1984)
Alat yang digunakan yaitu tabung reaksi, cawan petri, beaker glass yang terlebih dahulu disterilisasi menggunakan autoklaf bertekanan 2 atm dengan suhu 121oC selama 20 menit. Alat yang
terbuat dari bahan logam disterilisasi saat digunakan dengan alkohol 70% kemudian dibakar dengan bunsen.
3.2. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
Pembuatan medium PDA terdapat pada Lampiran 1. 3.3. Peremajaan Isolat Hypoxylon sp. (Kim et al., 2007)
Isolat yang akan diremajakan diambil dengan menggunakan jarum ose kemudian dipindahkan ke dalam cawan petri yang berisi medium PDA yang sudah disterilisasi kemudian ditutup dan dirapatkan dengan plastik pembungkus yang dilakukan secara aseptis di dalam Laminar Air Flow (LAF). Kemudian cawan petri yang berisi isolat Hypoxylon sp. diinkubasi selama 14 hari.
3.4. Pembuatan Medium Malt Yeast Peptone Agar (MYPA)
Pembuatan medium MYPA terdapat pada Lampiran 2.
3.5. Pembuatan Medium Potato Dextrose Yeast Agar (PDYA)
Pembuatan medium PDYA terdapat pada Lampiran 3.
3.6. Pembuatan Medium Oatmeal Malt Yeast Agar (OMYA)
Pembuatan medium OMYA terdapat pada Lampiran 4.
3.7. Pembuatan Medium Malt Extract Agar (MEA)
Pembuatan medium MEA terdapat pada Lampiran 5.
3.8. Pembuatan Medium Dog Food Agar (DFA)
Pembuatan medium DFA terdapat pada Lampiran 6.
3.9. Pengukuran pH awal medium (Petrucci, 1987)
Pengukuran pH awal dilakukan dengan cara kertas lakmus (pH paper) dicelupkan ke dalam medium agar selama 3-5 detik sebelum
12
medium memadat, kemudian kertas lakmus tersebut diangkat dan dicocokkan warna pada strips dengan warna yang ada dalam tabel diinokulasikan pada titik tengah cawan petri berukuran 9 cm. Proses inokulasi dilakukan secara aseptis di dalam Laminar Air Flow (LAF).
3.11. Pengukuran Diameter Koloni Miselium Jamur Hypoxylon sp. (Kalm & Kalyoncu, 2008)
Pengukuran rata-rata diameter koloni dihitung dengan mengukur diameter koloni dari 4 sisi yang berbeda kemudian dibagi 4. Setelah itu data yang diperoleh ditabulasikan. Pertumbuhan diameter koloni pada medium diamati setiap hari hingga salah satu isolat pertumbuhan miseliumnya memenuhi cawan petri.
3.12. Pengukuran Kecepatan Pertumbuhan Koloni Miselium Jamur
Hypoxylon sp.
Pengukuran kecepatan pertumbuhan dilakukan pada saat salah satu isolat pertumbuhan miseliumnya memenuhi cawan petri, dengan cara diameter koloni miselium hari ke-8 dihitung jari-jarinya lalu dibagi empat (D1,D2,D3 dan D4) selanjutnya dibagi 8 agar diketahui kecepetan pertumbuhan koloni miselium per hari.
3.13. Pengukuran berat kering miselium jamur Hypoxylon sp.(Sutton dan Starzyk, 1973)
Pengukuran berat kering miselium dilakukan berdasarkan metode Sutton dan Starzyk (1973). Cawan petri dibuka, kemudian permukaan agar ditetesi dengan akuades hingga menutupi permukaan. Cawan tersebut dipindahkan ke dalam water bath dipanaskan pada suhu 70oC hingga agar mencair. Agar yang telah mencair disaring
13
melalui corong Buchner dengan menggunakan kertas Whatman no.144 yang telah diketahui berat keringnya. Pompa vacum digunakan untuk mempercepat penyaringan. Miselium yang telah disaring kemudian dikeringkan menggunakan oven pada suhu 70OC hingga diperoleh berat yang konstan, lalu ditimbang menggunakan timbangan analitik. Bobot kering miselium adalah bobot yang tertera pada timbangan analitik dikurangi bobot kering kertas whatman.
C. Metode Analisis
Data rata-rata diameter koloni miselium Hypoxylon sp. yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan Analisis Ragam (Uji F), dilanjutkan dengan uji beda nyata jujur (BNJ) pada tingkat kesalahan 5% dan 1% (Steel & Torrie, 1993).
