BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Dalam analisis kimia suatu bahan, maka akan sering
dihadapkan pada pekerjaan-pekerjaan seperti menghilangkan
konstituen pengganggu atau mengisolasikannya maupun
memekatkan konstituen yang dikehendaki sebelum dilakukuan
identifikasi maupun pengukuran jumlahnya. Untuk melakukan
analisis kimia tersebut maka kita harus menggunakan suatu
metode agar dapat menentukan hasil yang tepat, kromatografi salah
satunya, dan dapat pula digunakan sebagai analisa secara kuantitatif.
Kromatografi Lapis Tipis merupakan teknik pemisahan cara
lama yang digunakan secara luas, terutama dalam analisis campuran
yang rumit dari sumber alam. Tetapi dalam kuantisasi belakangan ini
kromatografi lapis tipis digantikan oleh “HPLC” (High Performance
Thin-layer Chromatography) atau Kromatografi Lapis Tipis Kinerja
Tinggi.
Salah satu metode pemisahan yang memerlukan biaya paling
murah dan memakai peralatan sangat sederhana ialah kromatografi
lapis tipis preparatif (KLTP). Walaupun KLTP dapat memisahkan
dalam jumlah gram,sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan metode isolasi
yang sudah lama popular karena metode ini telah digunakan secara
universal oleh mahasiswa dan peneliti-peeliti bahan alam. Selain itu
metode ini tidak memerlukan biaya pengerjaan yang mahal. Ini
menjadi nilai tambah dari metode kromatografi lapis tipis preparative.
Prinsip kerja dari metode kromatografi lapis tipis preparatif,
adalah dimana proses isolasi berdasarkan perbedaan daya serap
dengan kecepatan yang berbeda sehingga terjadi pemisahan.
B. Rumusan Masalah
1. Apa defenisi umum dan bagaimana prinsip kerja dari Kromatografi
Lapis Tipis Preparatif ?
2. Apa hasil yang dapat diperoleh dari metode Kromatografi Lapis
Tipis Preparatif ?
C. Maksud dan Tujuan Praktikum
1. Maksud
Adapun maksud dari praktikum ini yaitu Untuk mengisolasi
komponen kimia dengan menggunakan metode Kromatografi Lapis
Tipis Preparatif pada daun bagore (Caesalpinia crista L.)
2. Tujuan
Adapun tujuan percobaan ini yaitu untuk memisahkan
senyawa kimia fraksinasi kasar daun bagore (Caesalpinia crista L.)
menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif berdasarkan
D. Manfaat Praktikum
Adapun manfaat dari praktikum ini yaitu praktikan dapat
mengetahui prinsip dan mekanisme kerja Kromatografi Lapis Tipis
Preparatif dalam memisahkan senyawa dengan berbagai
perbandingan eluen dari kepolaran rendah hingga kepolaran yang
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Uraian Tanaman
Klasifikasi Ilmiah (Itis,Gov,2014)
Kingdom : Plantae (Tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)
Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji)
Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)
Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)
Sub Kelas : Rosidae
Ordo : Fabales
Famili : Caesalpiniaceae
Genus : Caesalpinia
Spesies : Caesalpinia crista L.
Nama simplisia : Daun Bagore
Kandungan kimia : Alkaloid, karbohidrat, glikosida, tannin,
flavonoid, dan kumarin
B. Metode Isolasi
Isolasi adalah proses pemisahan komponen kimia yang
terdapat dalam suatu ekstrak. Hal ini dilakukan ketika ingin mengambil
bahan aktif dari ekstrak kasar (crude extract) (Skalika-Wozniak et al,
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana
analit-analit dalam sampel terdistribusi antara dua fase, yaitu fase
diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa bahan padat atau
porus dalam bentuk molekul kecil atau dalam bentuk cairan yang
dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada
dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas
digunakan sebagai fase gerak, maka prosesnya dikenal sebagai
kromatografi gas. Dalam kromatografi cair dan juga kromatografi lapis
tipis, fase gerak yang di gunakan selalu cair (Rohman,2009).
Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam,
tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada
mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi
(Rohman, 2009):
a. Kromatografi adsorbsi
b. Kromatografi partisi
c. Kromatografi pasangan ion
d. Kromatografi penukar ion
e. Kromatografi ekslusi ukuran
f. Kromatografi afinitas
Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran
berdasarkan perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh
senyawanya. Perbedaan yang dapat dimanfaatkan meliputi kelarutan
komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fase diam akan
berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang
berbeda-beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan
jenis fase, namun semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada
asas yang sama (Bresnick, 2012).
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa
secara cepat, dengan menggunakan zat penjerap berupa serbuk
halus yang dipaliskan serta rata pada lempeng kaca. Lempeng yang
dilapis, dapat dianggap sebagai “kolom kromatografi terbuka” dan
pemisahan dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian atau
gabungannya, tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan
lapisan zat penyerap dan jenis pelarut. Kromatografi lapis tipis dengan
penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa
lama yang digunakan secara luas, terutama dalam analisis campuran
yang rumit dari sumber alam. Tetapi dalam kuantisasi belakangan ini
Thin-layer Chromatography) atau Kromatografi Lapis Tipis Kinerja
Tinggi (Munson, 2010).
Perbandingan jarak perambatan suatu zat dengan jarak
perambatan fase bergerak di hitung dari titik penotolan larutan zat,
dinyatakan dengan Rf (Retondary factor) zat tersebut. Perbandingan
perambatan suatu zat dengan jarak perambatan zat pembanding
dinyatakan dengan Rr (Anonim, 2012).
Jarak perambatan noda
Rf =
Jarak perambatan eluen
Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Egon
Stahl dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga
merupakan lapis tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat
juga merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi
air dari udara (Sudjadi, 1986).
Ada beberapa macam silika gel yang beredar, diantaranya
(Sudjadi, 1986) :
1. Silika gel dengan pengikat.
2. Silika gel dengan pengikat dan indikator fluoresensi.
3. Silika gel tanpa pengikat.
4. Silika gel tanpa pengikat tapi dengan indikatorberfluoresensi.
Metode identifikasi. Untuk melihat senyawa tak berwarna pada
lempeng, biasanya digunakan metode berikut (Sudjadi, 1986) :
1. Metode kromatogram di bawah sinar ultraviolet (254 atau 366 nm).
a. Pada lapisan berflouresensi,misalnya Silica Gel GF254,
bercak muncul sebagai noda hitam.
b. Untuk senyawa berflouresensi digunakan lapisan biasa,
bercak terlihat berflouresensi.
2. Menyemprot dengan pereaksi yang menghasilkan warna dan atau
berflouresensi.
Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) adalah salah satu
metode yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai
peralatan paling dasar. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan
dalam jumlah gram, sebagian besar pemakainya hanya dalam jumlah
miligram.KLTP bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka,
masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi mengenai isolasi
bahan alam (Hostettmann, 2006).
Ketebalan penjerap (adsorben) yang paling sering dipakai pada
KLTP adalah sekitar 0,5-2 mm. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20
x 20 cm atau 20 x 40 cm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran
pelat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan
dengan KLTP. Penjerap yang paling umum digunakan ialah silika gel
dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun
Cuplikan pada KLTP dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum
ditotolkan pada pelat KLTP. Pelarut yang baik adalah pelarut atsiri
( heksana, diklorometana, etil asetat), karena jika pelarut kurang atsiri
akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5%
-10%. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin
karena pemisahan tergantung pada lebar pita (Szekely 1983).
KLTP klasik mempunyai beberapa kekurangan, kekurangan
yang utama adalah pengambilan senyawa dari pelat yang dilanjutkan
dengan pengekstrasian dari penjerap. Jika senyawa beracun harus
dikerok dari pelat, dapat menimbulkan masalah yang serius (misalnya
Adolf dkk. 1982). Kekurangan yang lainya ialah jangka waktu yang
diperlukn untuk pemisahan dan adanya pencemar dan sisa dari pelat
sendiri setelah pengekstrasian pita yang mengandung senyawa yang
dipisahkan dengan pelarut (Szekely 1983).
Untuk mengatasi beberapa masalah tersebut, beberapa
pendekatan yang melibatkan kromatografi sentrifugal telah dicoba.
Pada prinsipnya kromatografi sentrifugal adalah kromatografi klasik
dengan aliran fase gerak yang dipercepat oleh gaya sentrifugal
BAB III
PROSEDUR KERJA
A. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat yang digunakan adalah batang pengaduk panjang, botol
UC Bekas, cawan porselin, chamber KLTP, corong kaca, gelas
kimia, gelas ukur, kertas saring, lempeng 7 x 0,5 cm, lampu UV 254
dan 366 nm, lempeng KLTP, pipa kapiler, pipet tetes, statif,
timbangan analitik, vial.mistar, dan sendok tanduk besi.
2. Bahan
Bahan yang digunakan adalah aluminium foil, fraksi
methanol daun bagore (Caesalpinia crista L.), etil-Asetat, kapas,
kertas saring, methanol, n-Hexan, silica gel kasar dan halus, tisu.
B. Prosedur Kerja
Disiapkan alat dan bahan. Dipilih hasil fraksi yang terelusi
dengan baik pada kromatografi kolom konvensional dan kromatografi
kolom cair vakum. Kemudian masing-masing fraksi yang telah dipilih
dilarutkan dengan eluen dan ditotolkan pada lempeng KLTP
menggunakan pipa kapiler. Selanjutnya dielusi dalam chamber yang
berisi eluen n-heksan:etil (8:2) yang telah jenuh. Kemudian dibiarkan
terelusi, selanjutnya diamati penampakan bercak noda pada lampu
UV 254 dan 366 nm. Dan dilakukan uji antioksidan dengan pereaksi
BAB IV
a. Gambar dari fraksi KKK dan KCV
UV 366
Dari gambar pengamatan tersebut diperoleh 2 pita untuk fraksi
KKK dan 2 pita juga dari Fraksi KCV yang bersifat antioksidan
dimana ditandai dengan pita warna kuning dengan latar belakang
ungu setelah disemprotkan DPPH. KK
K
C. PEMBAHASAN
Kromatografi Lapis Tipis merupakan teknik pemisahan cara lama
yang digunakan secara luas, terutama dalam analisis campuran yang
rumit dari sumber alam. Tetapi dalam kuantisasi belakangan ini
kromatografi lapis tipis digantikan oleh “HPLC” (High Performance
Thin-layer Chromatography) atau Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi.
Pada percobaan ini dilakukan identifikasi sampel ektrak Daun
bagore menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif. Dimana
metode ini KLTP klasik mempunyai beberapa kekurangan, kekurangan
yang utama adalah pengambilan senyawa dari pelat yang dilanjutkan
dengan pengekstrasian dari penjerap. Jika senyawa beracun harus
dikerok dari pelat, dapat menimbulkan masalah yang serius.
Pada pengerjaan pertama, alat dan bahan yang akan digunakan
siapkan agar dapat meminimalisir dan memperlancar proses pengerjaan.
selanjutnya penyiapan pelarut dari n-heksan: etil (8:2). Hal ini dilakukan
agar dapat mengetahui apakah sampel dapat membentuk fraksi yang baik
atau terelusi dengan baik.
Pada metode Kromatogrfi kolom konvensional dipilih fraksi pada
vial nomor 22 sebagai fraksi yang akan ditotolkan di Lempeng KLTP. Dan
pada metode kromatografi cair vakum dipilih fraksi pada perbandingan 6:4
sebagai fraksi yang akan ditotolkan di Lempeng KLTP.
Selanjutnya disiapkan serangkaian alat kromatografi kromatografi
menampung eluen dengan panjang 20x20 cm untuk membentuk pita
noda, yang akan diambil atau dikeruk sebagai isolate.
Pada percobaan ini, merupakan percobaan berkelanjutan, dimana
hasil penetolan eluen yang cocok berdasarkan data hasil pengamatan
pada percobaan kromatogrfai cair vakum yaitu pada fraksi ke 4 dengan
menggunakan eluen n-heksan: etil (1:1). Selanjutnya digunakan lempeng
kltp untuk mendeteksi pembentukan pita yang sebelumnya telah ditotolkan
hasil campuran fraksi dan eluen n-heksan: etil (8:2). Setelah itu dielusi
pada chamber dan menghasilkan pita noda.
Kemudian diamati pada lampu UV. Dari hasil pengamatan noda
atau pita dapat terlihat pada lampu UV 254 dan juga UV 366. Terdapat 2
pita yang terbentuk pada lempeng KLTP untuk metode KKK dan KCV
setelah disemprotkan dengan DPPH. Kemudian pada metode KKK dan
KCV dikeruK lurus pita panjang berwarna kuning pada bagian yang tidak
di semprotkan dengan DPPH.
Hasil pengerukan kemudian disimpan kedalam vial dan hasil
pengamatan pada percobaan KLTP akan dilanjutkan pada percobaan
selanjutnya dengan cara sentrifuge untuk mengetahui dengan pasti
BAB V
KESIMPULAN
A. Kesimpulan
Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa dengan
menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif 2 noda atau
pita yang terbentuk dengan optimal yaitu dengan menggunakan eluen
n-heksan: etil perbandingan (8:2) pada sampel ekstrak daun bagore.
B. Saran
Sebaiknya alat-alat di laboratorium harus ditambah agar dapat
meminimalkan dan mengefisienkan waktu praktikum. Terutama alat
DAFTAR PUSTAKA
Anonim., 2012, ”Penuntun dan Buku Kerja Praktikum Fitokimia 2”, Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Indonesia, Makassar.
Anonim., 2015, ”Penuntun dan Buku Kerja Praktikum Fitokimia 2”, Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Indonesia, Makassar.
Bresnick, Stephen., 2002. Intisari Fisika.Hipokrates.Jakarta
Ditjen POM., 1979 ” Farmakope Indonesia edisi III Depkes Ri : Jakarta
Munson, James,W., 2010. Analisis Farmasi. Airlangga University Press: Surabaya
Sudjadi, Drs., 1986, “Metode Pemisahan”, UGM Press, Yogyakarta.
Hostettmann. M, Hostettmann. K, Marston. A., cara kromatografi preparatif, 1995. ITB Bandung
Rohman, Abdul., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. : Jakarta
Skalicka-Woźniak, 200, Isolation of the new minor constituents dihydropyranochromone and furanocoumarin from fruits of Peucedanum alsaticum L. by high-speed counter-current chromatography, Journal of Chromatography A 1216 (30) : 5669- 5675
Http :// www.itis.com
LAMPIRAN
Gambar 1. Metode Kromatografi cair vakum
