LAPORAN PRAKTIKUM PEMISAHAN dan IDENTIFI

LAPORAN PRAKTIKUM

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

NAMA : YULIANTI

NIM : H311 12 014

KELOMPOK : II (DUA)

HARI / TGL. PERC. : KAMIS / 27 MARET 2014

ASISTEN : SARTIKA

LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Seperti yang telah kita ketahui sebelumnya bahwa secara umum ada tiga gugus yang reaktif pada asam amino yaitu gugus karboksil, gugus amino, dan gugus rantai samping. Ketiga gugus ini dapat diidentifikasi melalui uji spesifik, diantaranya adalah dengan melalui tes ninhidrin, dan sebagainya. Akan tetapi, selain uji spesifik berdasarkan ciri khas reaksi kimianya, asam amino dapat pula diidentifikasi bahkan dipisahkan dengan beberapa metode, salah satunya adalah melalui kromatografi lapis tipis (KLT) (Fessenden dan Fessenden, 1997).

Pemisahan asam amino dengan metode ini didasari oleh kemampuan suatu jenis asam amino yang terlarut dalam suatu campuran pelarut tertentu pada fasa stasioner atau yang lazim disebut sebagai fasa diam, dimana bila suatu zat terlarut yang terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang sama dan tidak saling bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut di dalam kedua pelarut seimbang (Poedjiadi, 1994).

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan 1.2.1 Maksud Percobaan

Maksud dari percobaan ini adalah mengetahui dan memahami cara pemisahan dan identifikasi asam amino dalam suatu sampel melalui metode kromatografi lapis tipis.

1.2.2 Tujuan Percobaan

Tujuan dari percobaan ini adalah :

1. Menghitung nilai Rf dari asam amino glisin, tirosin, asparagin dan larutan sampel. 2. Mengidentifikasi asam amino dalam larutan sampel berdasarkan nilai Rf nya. 1.3 Prinsip Percobaan

Identifikasi asam amino berdasarkan perbedaan nilai Rf dengan menggunakan metode kromatrografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari campuran n-butanol, asam asetat dan air, dan fase diamnya berupa lapisan tipis alumina.

BAB II

Asam amino adalah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam amino sebagai komponen protein mempunyai gugus amina (-NH2) pada atom karbon α dari posisi gugus karboksil (-COOH). Rumus umum asam amino adalah (Poedjiadi, 1994) :

R CH COOH NH2

Gambar 1. Struktur asam amino

Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik non polar seperti eter, aseton, dan kloroform. Kelarutan asam amino ini berbeda dengan asam karboksilat dan amina. Asam amino mempunyai titik lebur yang tinggi bila dibandingkan dengan asam karboksilat dan amina. Hal ini menunjukkan bahwa asam amino cenderung mempunyai struktur yang bermuatan dan mempunyai polaritas tinggi dan bukan sekedar senyawa yang mempunyai gugus –COOH dan gugus –NH2. Hal ini tampak pula pada sifat asam amino sebagai elektrolit (Poedjiadi, 1994).

menunjukkan bahwa asam amino cenderung mempunyai struktur yang bermuatan dan mempunyai polaritas tinggi (Poedjiadi, 1994).

Terdapat dua puluh asam amino alami yang lazim. Kedua puluh asam amino alami yang lazim, memiliki rangka yang terdiri dari gugus asam karboksilat dan gugus yang terikat secara kovalen pada atom pusat (karbon alfa). Dua gugus lainnya pada karbon alfa ialah hidrogen dan gugus R yang merupakan rantai samping asam amino. Sifat kimia gugus rantai sampinglah yang menyebabkan perbedaan sifat asam amino (Fessenden dan Fessenden, 1997).

Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi (Poedjiadi, 1994).

Ada beberapa macam kromatografi diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (KLT), dan kromatografi penukar ion. Kromatografi lapis tipis (KLT) biasanya menggunakan aluminium oksida, serbuk selulosa atau silika gel sebagai absorben yang berupa ½ lapis tipis yang diletakkan di atas selembar kaca. Seperti halnya pada kromatografi kertas, larutan yang mengandung beberapa asam amino diteteskan di atas adsorben dan dibiarkan bergerak. Pemisahan asam amino didasarkan pada perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada pH tertentu. Harga Rf yaitu ciri khas suatu asam amino pda pelarut tertentu. Penentuan macam asam amino dapat pula dilakukan dengan menghitung harga Rf masing-masing asam amino, kemudian dibandingkan harga Rf asam amino yang terdapat pada tabel yang telah ada (Poedjiadi dan Supriyanti, 2007).

Fase stasioner dapat berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase bergerak dapat berupa cairan maupun gas. Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom, dan tentu saja laju pemisahan terletak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan yang berbeda. Harga Rf dapat disefenisikan sebagai berikut (Day dan Underwood, 2002) :

Harga Rf = Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal_{Jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal}

1. Strukur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan. 2. Sifat dari penyerapan dan derajat aktifitasnya. 3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap. 4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase gerak.

5. Derajat kejenuhan dari uap dalam mana bejana pengembangan yang digunakan. 6. Teknik percobaan.

7. Jumlah cuplikan yang digunakan. 8. Suhu.

9. Kesetimbangan.

Analisis asam amino primer dapat menggunakan derivatisasi prakolom. Tetapi ini hanya untuk asam amino primer sehingga tidak mungkin dilakukan oksidasi asam amino sekunder menjadi asam amino primer sebelum melalui kolom. Bila oksidasi ini dilakukan, dapat terjadi kerusakan (Rediatning dan Kartini, 1987).

Glisin merupakan asam amino yang paling sederhana dan dapat berdisosiasi membentuk suatu anion glisin H2N-CH2-CO2-_{, yang dapat bertindak sebagai ligan} terhadap kation logam transisi. Glisin digolongkan kepada ligan bidentat, ligan semi, dan ligan negatif, karena mempunyai pasanganelektron bebas dalam atom N dan pasangan elektron dalam atom O sebagai kelebihan elektron (Sudjana dkk., 2002).

Lebih dari dua protein asam amino, alanin dan glisin, yang dibiosintesis oleh eksploitasi α-pusat PLP kimia. Pada dasarnya asam α-amino dapat dibuat dari asam α-keto jika sesuai dengan aminotransferase yang tersedia. Piruvat merupakan suatu metabolit yang ada dimana-mana dan sesuai dengan asam amino, alanin tersedia dari transaminasi menggunakan aminotransferase khusus yang sesuai (Hughes, 2009).

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan

Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah larutan sampel, larutan glisin 0,01 M, larutan tirosin 0,01 M, larutan asparagin 0,01 M, eluen (n-butanol-asam asetat-air), larutan ninhidrin 0,2 %, plat kromatografi lapis tipis (KLT), aseton, selotip dan tissue roll.

3.2 Alat Percobaan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah chamber, pipa kapiler, gelas ukur 10 mL, botol semprot, pinsil, penggaris, gunting, inkubator, pingset, gegep dan pipet tetes.

3.3 Prosedur Percobaan 3.3.1 Pembuatan eluen

Dibuat larutan eluen dengan menggunakan larutan n–butanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v. Kemudian eluen dimasukkan ke dalam chamber, dikocok sebentar, kemudian ditutup dan ditunggu sampai jenuh ± 30 menit.

3.3.2 Penotolan Sampel

plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler yang sebelumnya berada dalam aseton. Selanjutnya dikeringkan pada suhu kamar.

3.3.3 Proses Elusi

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Pada percobaan ini, dilakukan pemisahan dan identifikasi asam amino pada suatu larutan sampel dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis. Dari percobaan yang telah dilakukan diperoleh data sebagai berikut :

Tabel 1. Data hasil pengamatan N

O Larutan Sampel Jarak Eluen (cm) Jarak Noda (cm) Rf (cm)

1. Glisin 4 0,8 0,2

2. Tirosin 4 1,1 0,275

3. Asparagin 4 1,2 0,3

4. Sampel 4 0,8 0,2

4.2 Reaksi

Reaksi yang terjadi adalah :

C C C O O OH OH

R CH COOH

NH2 ninhidrin C C C O O HO H R CH O

NH3 CO2

C C C O

OH N

C

C

C O

O

biru

3H2O

4.3 Pembahasan

Pada percobaan ini, tahap pertama yang dilakukan adalah kertas kromatografi digunting dengan ukuran 3 x 7 cm, Pada kertas kromatografi kita membuat garis yang digunakan sebagai tempat menotol larutan asam amino dan sampel yang berjarak 1 cm dari tepi bawah kertas kromatografi. Kertas kromatografi ini adalah fase diam dalam percobaan ini. Lalu dikeringkan dalam inkubator, tujuannya yaitu untuk mengaktifkan lapisan KLT agar kertas tersebut benar-benar kering karena suspensi absorbannya terbuat dari air (fase diam).

sifat kimianya berdasarkan pada warna yang timbul ketika disemprot dengan larutan ninhidrin.

Asam amino glisin, tirosin, asparagin dan sampel ditotolkan pada kertas kromatografi yang berjarak 1 cm dari bawah kertas dengan menggunakan pipa kapiler. Penotolan sampel dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler yang sebelumnya telah dibilas dengan aseton. Aseton merupakan salah satu larutan yang sering digunakan untuk membersihkan alat sebab sifatnya yang nonpolar sehingga dapat membersihkan bahan-bahan nonpolar pada alat. Selain itu, sifatnya yang mudah menguap dapat mempercepat pengeringan alat, sehingga sangat membantu

[[

Noda yang terbentuk pada plat tidak terpisah dengan baik, hal ini disebabkan karena penotolan yang dilakukan terlalu banyak.

Berdasarkan hasil perhitungan nilai Rf, maka diperoleh nilai Rf yang bervariasi antara satu asam amino dengan asam amino yang lainnya. Nilai Rf praktek untuk setiap asam amino glisin adalah 0,2 cm, tirosin adalah 0,275 cm, asparagin adalah 0,3 cm dan larutan sampel adalah 0,2 cm. Sedangkan, Rf standar yaitu asam amino glisin adalah 0,26 cm, tirosin adalah 0,45 cm dan asparagin adalah 0,50 cm. Dengan demikian terdapat perbedaan antara nilai Rf teori dengan nilai Rf praktek. Hal ini mungkin disebabkan karena kurang telitinya pada saat melakukan pratikum, dan juga karena alat-alat serta bahan-bahan percobaan yang digunakan kurang steril sehingga terdapat perbedaan antara praktek dengan teori.

Dari hasil perhitungan nilai Rf dapat dilihat bahwa pada sampel hanya asam amino glisin yang teridentifikasi, sedangkan asam amino tirosin dan asparagin tidak teridentifikasi.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan

Dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan :

1. Nilai Rf untuk asam amino glisin adalah 0,2 cm, asam amino tirosin adalah 0,275 cm, asam amino asparagin adalah 0,3 cm dan larutan sampel adalah 0,2 cm 2. Berdasarkan nilai Rf yang diperoleh, maka dapat diidentifikasi bahwa larutan

5.2 Saran

5.2.1 Saran Untuk Laboratorium

Bahan yang sudah mau habis sebaiknya di siapkan misalnya asam asetat.

5.2.2 Saran Untuk Percobaan

Sebaiknya digunakan juga metode yang lain untuk mengidentifikasi asam amino, agar pengetahuan yang diperoleh lebih banyak.

5.2.3 Saran Untuk Asisten

Sebaiknya jangan bepergian selama praktikum, agar praktikan dapat menanyakan hal yang tidak diketahui selama praktikum berlangsung.

DAFTAR PUSTAKA

Day, R.A., dan Underwood, A.L., 2001, Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam, Penerbit Erlangga, Jakarta.

Fessenden, R.J., dan Fessenden, J.S., 1997, Dasar- Dasar Kimia Organik, Erlangga, Jakarta.

Hughes, A.B., 2009, Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry,

WILEY-VCH, Australia.

Rediatning, W., dan Kartini, N., 1987, Analisis Asam Amino Dengan Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi Secara Derivatisasi Prakolom dan Pascakolom,

Proceedings ITB, 20(1,2): 41-59.

Sudjana, E., Abdurachman, M., dan Yuliasari, Y., 2002, KarakteriSasi Senyawa Kompleks Logam Transisi Cr, Mn, dan Ag Dengan Glisin Melalui Spektrofotometri Ultraungu dan Sinar Tampak, Jurnal Bonatura, 4(2): 69-86.

Toha, A., dan Hamid, A., 2001, Biokimia : Metabolisme Biomolekul, Alfabeta, Bandung.

MAKASSAR, 15 APRIL 2014

ASISTEN PRAKTIKAN

SARTIKA YULIANTI

Lampiran I Bagan Kerja

1. Pembuatan Eluen

 Dipipet dengan perbandingan 2,5 ml : 0,6 ml : 2,6 ml ke dalam tabung reaksi

 Dikocok sebentar

 Ditutup dan ditunggu sampai jenuh selama 30 menit

2. Penotolan Sampel

 Digunting sesuai ukuran chamber ( 3 x 7 cm )

 dikeringkan kemudian dibuat garis batas bawah dan batas atas ± 1 cm

 dibuat titik-titik pada garis batas bawah yang merupakan tempat penotolan larutan asam amino glisin, tirosin, asparagin, dan sampel

 Larutan asam amino dan sampel ditotolkan pada titik yang telah dibuat pada plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler yang sebelumnya berada dalam aseton.

 Dikeringkan pada suhu kamar.



3. Proses Elusi

 Dielusi ke dalam chamber berisi eluen yang telah jenuh dengan hati-hati agar garis batas bawah tidak tercelup ke dalam eluen

 Dihentikan jika eluen menempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya

 Plat dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan

 Kromatogram disemprot dengan larutan ninhidrin

 dikeringkan dalam inkubator dengan suhu ± 60 0_{C selama beberapa menit}

 Setelah kering diberi tanda pada noda yang timbul pada kromatogram dengan pensil

Eluen

Plat KLT

Plat KLT yang telah ditotol

 Ditentukan nilai Rf dari masing-masing noda pada kromatogram.

Lampiran 2

Perhitungan Nilai Rf

Hasil yang diperoleh :

Jarak eluen = 4 cm

Jarak noda

Glisin = 0,8 cm

Tirosin = 1,1 cm

Asparagin = 1,2 cm Larutan Sampel = 0,2 cm

Perhitungan

Rf =

Jarak yang ditempuh eluen 0,8 cm

Rf glisin =  = 0,2 cm 4 cm

1,1 cm

Rf tirosin =  = 0,275 cm 4 cm

1,2 cm Rf sampel I=  = 0,3 cm

4 cm 0,8 cm Rf sampel =  = 0,2 cm

4 cm

Lampiran 3

Tabel nilai Rf 20 asam amino

No Asam Amino Nilai Rf

1 Histidin 0.11

2 Glutamin 0.13

3 Lisin 0.14

4 Arginin 0.20

5 Asam aspartat 0.24

6 Glisin 0.26

8 Asam glutamat 0.30

9 Treonin 0.35

10 Alanin 0.38

11 Sistein 0.40

12 Prolin 0.43

13 Tirosin 0.45

14 Asparagin 0.50

15 Metionin 0.55

16 Valin 0.61

17 Triptofan 0.66

18 Fenilalanin 0.68

19 Isoleusin 0.72

20 Leusin 0.73

Lampiran 4

Foto Hasil Percobaan

Gambar 2. Plat KLT hasil pengamatan

Tirosin Asparagin

Sampel Batas elusi