Rir is Istighfar i Jenie dan Edy M eiyanto
Fakultas Far masi, UGM , Sekip Utar a Yogyakar ta 5 5 2 8 1
APLIKASI KO-KEM OTERAPI FRAKSI
ETIL ASETAT EKSTRAK ETAN OLIK
DAUN SAM BUN G N YAW A
(GYN URA PROCUM BEN S (LOUR.) M ERR.)
PADA SEL KAN KER PAYUDARA M CF-7
Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. VI, No. 3, Desember 2009, 132 - 141 ISSN : 1693-9883
ABSTRACT
Combination chemotherapy has been an interesting attention in recent years to cure cancer e.g. non-toxic or less toxic phytochemicals are being combined with chemo-therapeutic agents to sensitize cancer cell and to enhance the efficacy of chemothera-peutic agents as well as to reduce its toxicity to normal tissues. The aim of this research is to examine whether ethyl acetate fraction of Gynura procumbens ethanolic extract (SEF) synergizes the therapeutic potential of doxorubicin (Dox) on breast cancer cell line M CF-7. M TT assay were used to measure the growth inhibitory effect of the combination therapy on M CF-7 cells. SEF (5-250 µg/ml) treatment of cell resulted in 15-76% growth inhibition in a dose dependent manner (IC50 85 µg/ml), while Dox (10-100 nM ) treatment did not show any inhibitory effect. The combina-tions of SEF (5-40µg/ml) with Dox (10-75 nM ) seemed to not have any synergistic efficacy towards cell growth inhibition. Nevertheless, this result need further observa-tion regarding the IC
50 of Dox on M CF-7 has not been determined yet. The cell characterization may influence the result. Doxorubicin could induce A kt survival apoptosis pathway in M CF-7 resulting resistancy of the cell towards doxorubicin.
Key words: M CF-7 human mammary cancer cell, Doxorubicin, Sambung Nyawa leaves ethanolic extract, co-chemotherapy.
A BSTRA K
PEN D A HULUA N
Strateg i terap i y ang tersed ia untuk mengobati kanker payudara, termasuk agen sito to ksik (kemo -terapi), telah cukup banyak, namun sampai saat ini belum ada pengobat-an ypengobat-ang tepat untuk kpengobat-anker payudara yang telah metastasis. Doxorubicin (Do x) merupakan salah satu agen kemoterapi yang banyak digunakan d alam terap i kanker. M eskip un demikian ternyata penggunaan agen kemoterapi sistemik bukan saja tidak beg itu efektif nam un jug a tid ak selektif d an sang at to ksik bag i jaring an lain y ang no rm al (1). Pengurangan dosis akan mengurangi efek samping Do x o leh karenanya menjadi suatu tantangan untuk dapat memperbaiki aplikasi klinik agen kemo terap i sup ay a lebih efektif. Salah satu pendekatan yang sedang mendapat perhatian baru-baru ini adalah penggunaan kombinasi kemo-terap i (ko -kem o kemo-terap i), d im ana
pertumbuhan sel M CF-7 oleh adanya perlakuan kombinasi FES-D ox, kemudian ditentukan index kombinasinya (IK) untuk menetapkan apakah efeknya sinergis, aditif atau antagonis. Perlakuan dengan FES (5-250 µg/ml) selama 48 jam menghasilkan penghambatan pertumbuhan sel sebesar 15-76% , dengan IC50 85 µg/ml sedangkan perlakuan dengan Dox (10-100 nM ) belum menghasilkan efek penghambatan. Aplikasi kombinasi FES (5-40 µg/ml)-Dox (10-75 nM ) nampaknya tidak menunjukkan efek yang sinergis, namun demikian hal ini masih perlu diteliti lebih lanjut mengingat IC
50 Dox terhadap sel M CF-7 belum dapat ditentukan. Hasil penelitian kemungkinan dipengaruhi oleh karakteristik sel uji yang digunakan. Doxorubicin diketahui mampu menginduksi jalur survival apoptosis Akt pada sel MCF-7, sehingga sel tersebut menjadi resisten terhadap doxorubicin.
Kata kunci: Sel kanker payudara MCF-7, Doxorubicin, ekstrak etanolik daun Sambung Nyawa, ko-kemoterapi.
senyawa kemoprevensi yang bersifat no nto ksik atau lebih tid ak to ksik d iko mbinasikan d engan agen ke-m o terap i untuk ke-m ening katkan efikasiny a d eng an m enurunkan toksisitasnya terhadap jaringan yang no rm al. Deng an p ersp ektif ini dilakukan penelitian terhadap agen-agen kemoprevensi untuk mencari kandidat yang memiliki efek sinergis d alam ko m binasi d eng an o bat antikanker.
benzo(a)piren oleh ekstrak etanolik daun Sambung Nyaw a (ESN) pada pertumbuhan tumor paru mencit (2). Penelitian terakhir mengenai ESN menyatakan bahw a fraksi XIX-XX ESN memiliki efek sito to ksik ter-had ap sel kanker serv iks, HeLa, dengan IC50 119 µg/ ml (3). Fraksi tersebut juga menghambat proliferasi sel HeLa d an d apat mengind uksi terjad inya apo pto sis. Berd asarkan hasil-hasil penelitian tersebut tam-p akny a tanam an G . procumbens mempunyai potensi yang besar untuk d ikembangkan sebagai ko kemo -terapi bersama agen kemo-terapi yang telah luas digunakan dalam terapi kanker.
Beberapa agen kemo terapi di-laporkan efektif baik sebagai agen tunggal maupun kombinasi untuk pengo batan berbagai jenis kanker. Kombinasi kemoterapi memberikan hasil yang lebih efektif dibandingkan ketika diberikan dalam bentuk agen tunggal dan bahwa kombinasi yang m eng and ung Do x lebih efektif dibandingkan dengan regimen lain (4). Penelitian ini akan m eng uji apakah G. procumbens mempunyai efikasi yang sinergis dengan agen kem o terap i Do x sehing g a d ap at menurunkan dosis efektifnya yang berarti pula mengurangi toksisitas agen kemoterapi tersebut?
M ETO D O LO G I
Bahan
Do xo rubicin d ip eo leh d ari Ebewe, PT. Ferron Par
Pharmaceuti-cal. Ekstrak etano lik d aun G. pro-cumbens d ip ero leh d engan meng-ekstraksi serbuk kering daun yang d id ap atkan d ari Balai Penelitian Tanam an O bat (BPTO ), Karang -anyar, Surakarta, dengan etanol 96%. Ekstrak etanol ini dilarutkan dengan Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma). Sel kanker payudara MCF-7 diper-oleh dari Prof. Tatsuo Takeya (Nara Institute of Science and Technology, Jep ang). Kultur sel d itumbuhkan dalam media penumbuh D ulbecco’ s modified Eagle’ s medium (DMEM) yang mengand ung Foetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/ v) (Gibco), penisillin-streptomisin 1% (v/ v) (Gibco). Selain bahan-bahan di atas juga digunakan 0,05% trypsin-EDTA (Gibco) dalam HBSS tanpa Ca2+/ Mg2+untuk melepas sel yang melekat pada flask maupun plate, PBS tanp a Ca2+/ Mg2+. U ji M TT. MTT [3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-d ifeniltetraz o lium bro mid a] (Sigma), dengan konsentrasi 5 mg/ ml. Stopper yang digunakan adalah iso p ro p ano l asam y aitu H Cl 4N dalam isopropanol dengan perban-d ing an 1:100. Bahan-bahan y ang digunakan selama penelitian apabila tid ak d ikatakan lain berarti ber-derajat pro analisis.
Uji ko-kemoterapi menggunakan metode M TT
PBS, kemudian ditambahkan 100 µl med ia kultur y ang meng and ung DMSO 0,5% v/ v saja (kontrol) atau sampel baik dalam bentuk tunggal yaitu ekstrak atau dox saja maupun gabungan ked uanya (ko mbinasi), inkubasi selama 48 jam. Pada akhir inkubasi, m ed ia kultur y ang mengandung sampel dibuang, dicuci d engan 100 µl PBS. Kemud ian ke d alam m asing -m asing sum uran d itambahkan 100 µl med ia kultur yang mengandung MTT 5 mg/ ml, inkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 370C. Sel yang hidup akan bereaksi d eng an M TT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Setelah 4 jam, media yang mengandung MTT dibuang, dicuci dengan PBS, kemu-dian ditambahkan larutan asam iso-propanol untuk melarutkan kristal formazan. Digoyang di atas shaker selama 10 menit kemudian dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm.
A nalisis hasil
Data y ang d ip ero leh berup a absorbansi masing-masing sumuran dikonversi ke dalam persen sel hidup d an d ianalisis untuk mengetahui signifikansi perbedaan antara kelom-pok kontrol dengan kelomkelom-pok per-lakuan. Persen sel hidup dihitung menggunakan rumus:
Kemudian dihitung konsentrasi IC50 yaitu konsentrasi yang menye-babkan kematian 50% populasi sel sehingga d apat d iketahui po tensi sitotoksisitasnya. Selanjutnya diana-lisis dengan tes A nova, dilanjutkan dengan tes Tukey dan student ttest m eng g unakan SPSS 11.0, untuk mengetahui signifikansinya dengan ko ntro l. Sito to ksisitas sinergistik d itetap kan d eng an m eng hitung indeks kombinasi (IK atau Combina-tion Index, CI) antara agen kemo -terap i d eng an ekstrak Sam bung Nyawa, menggunakan persamaan:
CI= (D)1/(Dx)1+ (D)2/(Dx)2
Dimana D x adalah konsentrasi d ari satu seny aw a tung g al y ang dibutuhkan untuk memberikan efek (dalam hal ini adalah IC50 terhadap pertumbuhan sel kanker payudara) d an ( D )1, ( D )2 ad alah besarny a ko nsentrasi kedua senyaw a untuk memberikan efek yang sama (5). Angka CI atau indeks kombinasi yang diperoleh diinterpretasikan sebagai berikut:
< 0.1 sinergis sangat kuat 0.1–0.3 sinergis kuat
> 3.3 antagonis kuat-sangat kuat
HA SIL DA N PEM BA HA SA N
Uji Ko-kemoterapi Ekstrak Etanolik D aun G . pro cumbens (ESN ) dan D oxorubicin (dox) Terhadap Sel M CF-7
Sel MCF-7 merupakan sel kanker p ayud ara yang mengeksp resikan reseptor estrogen (ER +) dengan wild type p53 sehingga sensitif terhadap agen kemoterapi (6), oleh karenanya ingin diketahui terlebih dahulu bagai-mana respo n sel MCF-7 terhad ap p erlakuan ko -kemo terap i ekstrak etanolik daun G. procumbens (ESN) dan doxorubicin (dox). Pada aplikasi tunggal nampak perlakuan ESN (10-300 µg/ ml) belum mampu meng-hambat p ertumbuhan sel MCF-7, demikian pula pada aplikasi tunggal dox (1,8-90 nM) (Gambar 1).
Selanjutnya d ilakukan uji ko -kemo terapi untuk melihat efikasi kombinasi keduanya terhadap peng-hambatan pertumbuhan sel MCF-7, yaitu apakah sinergis, ad itif atau antago nis. Hasilnya menunjukkan bahwa kombinasi ESN (75, 150, dan 250 µg/ ml) dan dox (1,8, 9, dan 18 nM) belum mamp u menghambat pertumbuhan sel MCF-7.
Uji Ko-kemoterapi Fraksi Etil A setat Ekstrak Etanolik Daun G.
procum-bens (FES) dan D oxorubicin (dox)
Terhadap Sel M CF-7
Ekstrak kemudian difraksinasi dengan etil asetat untuk medapatkan golongan flavonoid yang terkandung d i d alam ny a. Fraksi etil asetat diharapkan mampu meningkatkan efikasi dox karena diketahui bahwa
flavonoid mampu mensensitisasi sel kanker m elalui p eng ham batan Pgp.(7). Sebelum diaplikasikan untuk uji ko kemo terapi, masing-masing fraksi yang diperoleh (yaitu fraksi heksan, etil asetat d an air) d iuji sitotoksisitas terlebih dahulu untuk membandingkan potensinya pada sel MCF-7. Berdasarkan nilai IC50 yang diperoleh tampak bahw a fraksi etil asetat (FES) merupakan fraksi yang p aling p o ten d i antara ketiganya (Tabel 1). Oleh karena itu fraksi etil asetat yang diteruskan untuk diuji aplikasi kokemoterapinya.
Aplikasi tunggal FES (5-250 µg/ ml) mampu menghambat
pertum-Gambar 2. Efek aplikasi ko-kemoterapi ESN-Dox pada sel kanker payudara MCF-7. Pengamatan efek kombinasi ESN (75-250 µg/ml)-Dox (1,8-18 nM) terhadap sel MCF-7 dilakukan sebagaimana yang dijelaskan pada metodologi. Kombinasi keduanya belum mampu menghambat pertumbuhan sel MCF-7. Ini menunjukkan bahwa ESN tidak meningkatkan efikasi Dox pada sel kanker payudara MCF-7.
buhan sel MCF-7 sebesar 15-76% namun ap likasi d o x (10-100 nM ) belum m enunjukkan efek p eng -hambatan (Gambar 3). Lebih lanjut, hasil uji ap likasi ko -kem o terap i ked uanya ternyata tid ak menun-jukkan efikasi yang sinergis (Gambar 4).
Tabel 1. Potensi fraksi heksan, etil asetat, dan air terhadap penghambatan
pertumbuhan sel MCF-7
No Fraksi Nilai IC50 (mg/ml)
1. Heksan 94
2. Etil asetat 85
Gambar 3. Aplikasi tunggal FES dan dox pada sel MCF-7. Untuk melihat efikasi FES dan Dox sebagai agen tunggal pada sel MCF-7, sel ditanam sebanyak 5000 sel/sumuran dalam plate 96 sumuran, kemudian diberi perlakuan baik dengan FES (5-250 µg/ml) maupun Dox (10-100 nM) (dalam bentuk tunggal) sebagaimana dijelaskan dalam metodologi. FES mampu menghambat pertumbuhan sel MCF-7 dengan IC50 sebesar 85 µg/ml, sedangkan aplikasi Dox belum menunjukkan efek penghambatan. Tanda bintang (*) menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap kontrol (DMSO 0,25% v/v) dengan taraf kepercayaan 95% (P<0,05). Grafik merupakan nilai rata-rata + SD dari 3 percobaan.
Baik ekstrak maupun fraksi etil asetat daun G. procumbens ternyata belum mampu meningkatkan efikasi d o x terhad ap sel MCF-7, bahkan pada penelitian ini aplikasi tunggal d o x yang d iujikan belum mampu m eng ham bat p ertum buhan sel MCF-7, sehingga belum dapat diten-tukan IC50-nya. Meskipun demikian penelitian ini akan menjadi menarik untuk d iujikan p ad a sel kanker payudara yang lain karena masing-masing sel memiliki karakteristik mo lekuler yang berbed a sehingga akan dapat dibandingkan responnya terhadap aplikasi kokemoterapi.
A p likasi tunggal d o x d engan konsentrasi 10-100 nM pada MCF-7 belum menimbulkan respon peng-hambatan pertumbuhan sel sehingga d ip erkirakan IC50 d o x p ad a sel
responsif terhadap stimulasi estro-gen. Penelitian Welshons et al. me-nyebutkan bahw a phenol red suatu indikator pH yang terdapat media penumbuh kultur sel bersifat genik dan terhadap stimulasi estro-gen dari phenol red ini
MCF-7 lebih responsif daripada T47D (sel kanker payudara lain yang juga ER +)(9).
Di samping itu stimulasi estrogen ternyata meningkatkan konsentrasi P-gp pada MCF-7 namun tidak demi-kian pada sel T47D (10). Hal tersebut diduga berkaitan dengan subtipe dari reseptor estrogen yang diekspresikan oleh kedua sel. MCF-7 mengekspre-sikan reseptor estrogen subtipe alpha
Gambar 4. Efek aplikasi ko-kemoterapi FES-Dox pada sel kanker payudara MCF-7. Pengamatan efek kombinasi FES (5-40 µg/ml)-Dox (10-75 nM) terhadap sel MCF-7 dilakukan sebagaimana yang dijelaskan pada metodologi. Kombinasi keduanya belum mampu menghambat pertumbuhan sel MCF-7. Ini menunjukkan bahwa FES tidak meningkatkan efikasi Dox pada sel kanker payudara MCF-7.
KESIM PULA N
Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun G. procumbens belum mampu meningkatkan efikasi dox terhadap sel kanker payudara MCF-7. Bahkan efikasi d o x tung g al terhad ap sel MCF-7 belum dapat ditentukan (nilai IC50-nya lebih besar dari konsentrasi yang dicobakan pada penelitian). Hal ini terutama dipengaruhi oleh karak-teristik sel MCF-7, yang pada akhir-ny a m eng urang i sensitiv itas sel tersebut terhadap agen kemoterapi. Aplikasi kokemoterapi G. procumbens perlu diteliti lebih lanjut terhadap sel kanker payudara yang lain sehingga d apat d iband ingkan hasilnya d an d ip elajari m ekanism e aksiny a. Masing-masing sel kanker memiliki karakteristik mo lekuler yang ber-beda, oleh karena itu sangat mungkin respon yang timbul akibat aplikasi ko-kemoterapi juga berbeda.
UCA PA N TERIM A KA SIH
Terimakasih d isampaikan ke-pada seluruh anggo ta Cancer Che-moprevention Research Center (CCRC) Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada yang telah mendukung dan membantu kelancaran penelitian ini.
DA FTA R A CUA N
1. Wattanapitayakul SK, L Chula-ro jm o ntri, A H erunsalee, S Charuchongkolwongse, S Nium-sakul, JA Bauer. 2005. Screening of Antioxidants from Medicinal
Plants for Cardioprotective Ef-fect against Doxorubicin Toxic-ity, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, vol. 96, 80.
2. Sugiyanto , B Sud arto , E Mei-yanto, A E Nugroho, UA Jenie. 2003. Aktivitas Antikarsinogenik Seny aw a y ang Berasal d ari Tumbuhan, M ajalah Farmasi Indo-nesia, 14 (4):216-225.
3. Meiyanto E and EP Septisetyani. 2005. Efek A ntiproliferatif dan Apoptosis Fraksi Fenolik Ekstrak Etanolik Daun Gynura procumbens (Lour.) Merr. terhadap Sel HeLa, A rtocarpus, Vol. 5, No.2, Hal. 74 - 80.
4. Sharma G, AK Tyagi, RP Singh, DCF Chan, R A garw al. 2004. Synergistic Anti-Cancer Effect of Grape Seed Extract and Conven-tional Cytotoxic Agent Doxoru-bicin Against Human Breast Car-cinoma Cells, Breast Cancer Re-search and Treatment, 85:1-12. 5. Reynolds CP, BJ Maurer. 2005.
Evaluating Response to Antine-oplastic Drug Combinations in Tissue Culture Models, M ethods M ol. M ed., 110: 173-183.
6. Craw ford KW and WD Bow en. 2002. Sigma-2 Receptor Agonists Activate a Novel Apoptotic Path-way and Potentiate Antineoplas-tic Drugs in Breast Tumor Cell Lines, Cancer Research, 62, 313-322.
8. A mund so n SA , TG My ers, D Scudiero, S Kitada, JC Reed, AJ Fornace Jr. 2000. An Informatics Approach Identifying Markers of Chemosensitivity in Human Can-cer Cell Lines, Canc. Res., 60, 6101-6110.
9. W elsho ns W V , M F W o lf, CS Murphy, VC Jordan. 1988. Estro-genic activity of phenol red, M ol Cell Endocrinol, 57(3):169-78.
