PERKEMBANGAN DAN PENGGUNAAN HEWAN TRANSGENIK

PERKEMBANGAN DAN PENGGUNAAN HEWAN

TRANSGENIK

Perkembangan perbaikan genetik dengan transgenesis Æ

lambat

Strategi introduksi gen ke kromosom hewan tk tinggi:

-Gen diinjeksikan ke inti sel telur yang telah dibuahi

-Telur diletakkan di dalam betina reseptif

-Beberapa keturunan membawa gen sasaran

-Hewan yang membawa gen sasaran di dalam sel nutfah

disilangkan untuk mendapat galur baru

Transgenesis pada hewan Æ alat:

-mempelajari ekspresi gen dan perkembangan

-hewan model untuk penyakit manusia

-protein farmasetik bagi manusia (susu dari kelenjar susu)

Perbaikan genetik ternak dan hewan domestik Æ perkawinan

+ seleksi Æ waktu lama & mahal

Produksi protein melalui kelenjar susu: Æ Melalui air susu, karena:

1. dapat diperbaharui

2. dapat diambil terus tanpa membahayakan hewannya

-awal perkembangan transgenesis pada hewan -sejak 1980an: 100an gen Æ galur baru

Kontribusi:

-mengetahui regulasi ekspresi gen, perkembangan sel -mengetahui perkembangan tumor, spesifisitas imunologi -mengetahui proses biologi fundamental

-pengujian kelayakan produksi obat terapetik manusia -model penyakit manusia

Tikus Transgenik

Protein farmasetik yang dihasilkan dalam air susu harus:

1. tidak mempunyai efek sampingan thd proses fisiologi dari hewan transgenik

2. melalui proses pascatranslasi Æ mirip protein manusia

Introduksi DNA sasaran ke dalam sel inang melalui:

1. Vektor retrovirus Æ sel embrio tahap awal Æ betina reseptif

2. Mikroinjeksi ke inti sel sperma yang membesar (pronukleus jantan) dari sel telur yang telah dibuahi

3. Sel batang embrionik Æ embrio stadia awal Æ betina reseptif

Metode vektor retrovirus

-keuntungan: integrasi transgen ke dalam genom efektif

-kerugian:

-transgen ukuran kecil (< 8 kb) shg

transgen kekurangan regulator ekspresi gen

-genom retrovirus dapat melakukan replikasi walaupun menggunakan vektor defektif replikasi

Æ secara komersial jarang (tidak) digunakan

Metode mikroinjeksi DNA Tahapan:

1. Meningkatkan jumlah telur terbuahi Æ stimulasi superovulasi pada betina

donor

Cara: serum kuda hamil Æ injeksi Æ 48 jam: chorionic gonad-otropin

manusia Æ 35 sel telur (normal: 5-10 sel)

2. Betina tsb x jantan Æ telur diambil dari oviduct

3. Telur diinjeksi (segera)

Transgen Æ linier (bebas DNA prokaryot)

4. Telur ditanam di induk betina angkat 5. Identifikasi tikus transgenik

Tikus transgenik x WT Æ integrasi transgen?

Tikus transgenik (lanjutan)

Injeksi sel telur

Mamalia:

Sperma masuk ke sel telur Æ inti sel sperma (pronukleus jantan) terpisah dari inti sel telur. Setelah inti sel telur selesai meiosis Æ pronukleus betina Æ fusi dengan pronukleus jantan (karyogami). Pronukleus jantan > pronukleus betina Æ injeksi dilakukan pada pronukleus jantan (sel telur dapat difiksasi dan diorientasikan)

Penanaman sel telur ke induk betina palsu

25-40 sel telur ditanam di betina angkat (bedah mikro) yang telah dibuat hamil palsu. Hamil palsu: perkawinan dengan jantan mandul (vasektomi) Æ persiapan uterus untuk implantasi

3 minggu Æ lahir anak tikus

Identifikasi tikus transgenik

DNA (ekor/darah) Æ hibridisasi southern atau PCR Tikus transgenik x WT Æ integrasi transgen?

66% telur hidup setelah diinjeksi

25% telur yang ditanam berkembang menjadi anak 25% anak yang lahir adalah transgenik

Î 1000 telur diinjeksi Æ 30-50 anak transgenik Efisiensi

Sel dari embrio stadia blastosis Æ proliferasi Æ sel batang embrionik (ESC)

ES Æ pluripotent Æ direkayasa tetap pluripotent Transgen diintegrasikan ke genom ES Æ blastosis Æ ditanam Æ transgenik

Transfeksi ESC dengan transgen:

-sel dengan integrasi transgen pada situs bukan sasaran

-sel dengan integrasi transgen pada situs sasaran

-sel tidak mengandung transgen

Peningkatan jumlah sel dengan situs sesuai sasaran: seleksi positif – negatif

Seleksi positif: memilih sel dengan integrasi di sembarang situs

Seleksi negatif: membuang sel yang mengandung transgen terintegrasi di sembarang situs

Situs sasaran: di daerah yang bukan penyandi (tidak penting) sehingga perkembangan dan fungsi sel tidak terganggu

1. 2 blok sekuen DNA (HB1 dan HB2) yang homolog dengan situs sasaran 2. Transgen (TG) Æ fungsi baru untuk

resipien

3. Sekuen DNA penyandi resistensi terhadap G418 (NeoR₎

4. 2 gen berbeda untuk thymidine kinase (tk1 dan tk2) dari virus simplex herpes tipe I dan II (HSV-tk1 dan HSV-tk2) Vektor untuk seleksi positif-negatif

Di antara HB: transgen dan gen neoR Di luar HB: gen HSV-tk1 dan HSV-tk2

Jika integrasi terjadi pada situs bukan sasaran Æ salah satu atau kedua HSV-tk terintegrasi kedalam genom sel resipien

Jika integrasi terjadi pada situs sasaran Æ HSV-tk tidak terintegrasi Sel + G418 Æ sel tanpa neoR _{Æ mati (sel hidup punya neo}R_{). +}

gancyclovir Æ sel yang mengekspresikan tk Æ mati (gancyclovir diubah oleh tk menjadi toxinÆ sel mati)

Sel + G418 + gancyclovir Æ sel yang mengandung transgen yang terintegrasi pada situs sasaran

Seleksi dengan PCR

ESC transgenik Æ kultur Æ disisipkan kedalam embrio stadia blastosis Æ ditanam pada betina pembawa (hamil palsu) Æ galur transgenik.

Homozigot: kawin sesama transgenik

Uji ESC yang mengandung transgen pada situs sasaran Æ PCR

Fungsi gen di suatu organisme dapat diganggu melalui penyisipan potongan DNA (biasanya penanda seleksi) ke dalam gen tsb Æ untuk: •mengetahui pengaruh suatu gen terhadap fisiologi dan pertumbuhan organisme ybs

•sistem model untuk mempelajari penyakit manusia secara molekuler Inaktivasi gen = gene disruption = gene knockout

Inaktivasi fungsi gen

Contoh pemanfaatan gene disruption:

Gangguan terhadap gen rhodopsin mencit Æ kerusakan rod cells dari retina ~ retinitis pigmentosa pada manusia Æ digunakan mengetahui degenerasi retina & pengaruh agen terapetik

250 mencit yang mengalami gene knockout Æ model untuk kajian berbagai kelainan pada manusia

Modifikasi genetik dengan sistem rekombinasi Cre-loxP Sistem rekombinasi cre-

loxP

Æ gene knockout

Cre-loxP dari fage P1 (100 kb) Æ linier-sirkuler genom

P1: genom sirkuler Æ replikasi genom viral (siklus lisis), linier (terintegrasi) Æ jarang

Rekombinase Cre (circularization recombination): memotong &

merekombinasi DNA dari situs loxP (locus of crossing over in P1)

Situs loxP: 2 DNA berulang 13 bp yang dipisahkan oleh 8 bp

Hasil rekombinasi tergantung orientasi loxP:

-berbeda arah: daerah pemisah mengalami inversi -searah: daerah pemisah kedua loxP Æ eksisi (hilang) Cre-loxP Æ berfungsi bila kedua situs loxP berjauhan

contoh: mencit yang mempunyai gen yang termodifikasi secara spesifik 1. Tikus transgenik Cre: promoter spesifik sel + gen cre Æ MT1

2. Klon DNA (termasuk smg) (floxed) diapit 2 loxP searah Æ MT2 3. MT1 x MT2 Æ MT3: rekombinasi antara 2 loxP karena ada rekombinase Cre

Rekombinasi Cre-loxP

Aktivasi gen dengan rekombinasi Cre-loxP

Konstruksi floxed mengandung DNA yang mencegah transkripsi Floxed ditempatkan di antara promoter dan gen penyandi

Cre Æ rekombinasi di loxP Æ DNA yang mencegah transkripsi Æ eksisi (hilang) Æ gen diekspresikan

Transgenesis dengan vektor berkapasitas besar Gen utuh, multigen Æ vektor kapasitas besar Kelompok gen b-globin= 250 kb

Antibodi:

tetramer: rantai berat (H) dan ringan (L)

H: variable (V_H), diversity (D_H), joining (J_H), constant (C_H) di sel B L: tipe λ dan κ Æ V_λ & V_κ, J_λ & J_κ, C_λ & C_κ

Antibodi H manusia: 95 V_H, 30 D_H, 6 J_H dan 5 C (C_α, C_γ, C_δ, C_ε, C_μ) Lokus k: 76 Vκ, 5 Jκ, 1 Cκ

Penyakit alzheimer: kelainan otak, kehilangan ingatan secara progresif, gangguan bicara, lamban

Di dalam neocortex dan hippocampus dari otak pasien alzheimer, serabut neofibril mengakumulasikan di

dalam badan neuron senile plaque yang mengandung badan amyloid dan sel-sel otak (neuron) hilang.

Protein utama badan amyloid Alzheimer: prot 4 kDa Æ Aβ (β-amyloid, protein β, β−amyloid protein atau β/A4): 39-42 aa (terbanyak: Aβ40 & Aβ42) hasil pemotongan proteolitik β-amyloid precursor protein (APP) Æ

disebabkan oleh mutasi pada gen APP (beberapa famili)

Aplikasi tikus transgenik

-model penyakit manusia Æ uji senyawa terapetik

misal: Alzheimer, muscular dysthrophy, tumorigenesis, hypertension, neurodegenerative disorder, endocrinological dysfunction,

-Uji produksi

1. Model penyakit Alzheimer

Model penyakit Alzheimer

Promoter dari virus spesifik otak + gen APP penyandi 100 aa terakhir dari ujung C yang mengandung βA4 Æ histokimia: Alzheimer

Konstruksi model penyakit Alzheimer di tikus transgenik

Alzheimer: APP-177: ValÆPhe; APP-670/671: Lys+Met ÆAsn+Leu

promoter platelet-derived growth factor β + APP-cDNA intron Æ tikus mengandung plaque amyloid, kematian sel neuron, kehilangan ingatan APP-670/671 Æ tikus dg penampakan Alzheimer (kelebihan Aβ42)

APP-177

Val GUU GUC GUA GUG

Phe UUU UUC

APP-670/671

Lys AAA AAG

Asn AAU AAC

Met AUG

2. Model sistem ekspresi/produksi

Produksi susu yang mengandung protein dari transgen

Studi fungsi CFTR (Cystic Fibrosis Trans-membrane

Regulator) dan potensi terapi untuk CF (Cystic Fibrosis):

CFTR perlu jumlah banyak

CF rusak Æ fungsi CFTR rusak (sebagai kanal klorida) Æ

aliran Cl rusak Æ akumulasi lendir di pankreas & paru

Lendir: situs infeksi bakteri Æ sulit dikendalikan dengan

antibiotik

Bakteri mati Æ lendir tebal Æ fungsi organ terganggu:

menyumbat saluran Æ memperburuk efek CF

cDNA CFTR Æ di tengah gen β-casein yang tidak lengkap dari kambing (delesi dari E2 akhir s/d E7 awal) di bawah kontrol promoter dan

terminator β-casein. β-casein diekspresikan di kelenjar susu selama laktasi dan dalam jumlah yang tinggi

Produksi CFTR

Tikus transgenik: susu mengandung protein CFTR yang terikat di

membran dari globule lemak (tidak ada efek negarif bagi induk & anak). CFTR mengalami glikosilasi dan mudah diekstraksi dari fraksi kaya lemak dari susu.

Peningkatan produksi CFTR Æ mamalia besar (sapi, kambing, domba) In vitro, produksi CFTR rendah (akumulasi di membran).

Penanggulangan: membran diambil (produksi tinggi, purifikasi mudah) Sel kelenjar susu Æ sekresi lemak yang dibungkus oleh membran

Pengklonan ternak melalui transfer inti

Kelenjar susu: bioreaktor Æ sapi sangat berpotensi (10.000 l/th, dengan 35 g protein/l susu)

Modifikasi mikroinjeksi pada tikus

Penggunaan prosedur tanpa pembedahan dalam implantasi embrio: 2 sapi transgenik dari 2470 oocyte Æ tidak efisien Perbaikan: uji sel embrio Æ embrio transgenik Æ implantasi Salah satu tujuan: mengubah kandungan susu

Keju Æ κ-casein Æ over ekpresi transgen κ-casein

Ekspresi lactase di kelenjar susu Æ susu bebas laktosa

Transgenesis pada sapi Æ lambat (2 th dari telur terbuahi s/d anak sapi)

Untuk ternak Æ resistensi terhadap bakteri, virus, parasit Imunisasi in vivo: introduksi transgen penyandi antibodi untuk antigen spesifik

-penekanan pada kelenjar susu sebagai bioreaktor Æ protein farmasetik

-metode: seperti tikus dengan promoter spesifik kelenjar susu -kambing, domba Æ protein (manusia) yang disekresikan ke dalam susu mengalami glikosilasi, dan punya aktivitas

-Ekspresi GH dengan promoter metallothionein di babi Æ besar, tapi timbul penyakit bernanah di saluran pencernaan, terganggunya fungsi ginjal, hati.

-potensi: produksi hemoglobin (darah) manusia dari babi?

Daerah regulator β-globin manusia + 2 gen α1-globin manusia + 1 gen βA_{-globin manusia Æ}

hemoglobin man

Mikroinjeksi ke telur yang sudah terbuahi sulit:

-Fertilisasi: beberapa sperma masuk ke dalam sel telur Æ sulit mengidentifikasi pronukleus jantan yang akan berfusi dengan pronukleus betina

-Injeksi DNA ke sitoplasma Æ DNA tidak terintegrasi ke genom sel telur -Setelah fertilisasi Æ telur cepat berkembang, diselimuti membran yang

kuat, diliputi oleh albumin yang tebal, dan dilapisi membran cangkang dalam dan luar

Unggas Transgenik

Inokulasi embrio pada stadia blastoderma dengan vektor retrovirus yang defektif replikasi dan gen penanda Æ ayam, puyuh transgenik Æ retrovirus?

Keturunan: campuran sel (donor+resipien) Æ kimera

Seleksi kimera Æ sel nutfah transgenik Æ persilangan

Radiasi (540-660 rad) terhadap embrio resipien Æ meningkatkan rasio donor Ayam transgenik:

-resistensi penyakit -efisiensi pakan

-penurunan kadar lemak dan kolesterol dalam telur

-kualitas daging

ESC unggas Æ belum diidentifikasi?

Sel blastoderma Æ liposom (lipid kation) + transgen Æ introduksi ke subgerminal embrio dari telur

Mikroinjeksi DNA kedalam sel telur terbuahi: salem

Pronukleur tidak terlihat dengan mikroskop Æ DNA linier diinjeksikan kedalam sitoplasma sel telur yang sudah dibuahi atau ke embrio

stadia awal (4 sel). Telur ikan berkembang di luar induk Æ suhu lingkungan diatur

Setelah injeksi, 35-80% embrio hidup Æ transgenik 10-70%

Identifikasi transgen Æ PCR dengan cetakan DNA dari sel darah merah

Transgenesis : GH

Promoter gen penyandi protein antibeku dari ocean pout + cDNA GH salem + terminator gen antibeku dari ocean pout Æ salem atlantik Salem transgenik: tumbuh cepat dan lebih besar (pada kondisi air dingin Æ ekspresi GH sangat tinggi)