LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
A. Total protein dan Profil protein menggunakan metode Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
1. Hari / tanggal : Sabtu, 12 Desember 2015
2. Tempat :
Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Muhammadiyah Semarang
3. Tujuan :
a. Agar mahasiswa dapat memahami prinsip dasar elektroforesis SDS-PAGE
b. Agar mahasiswa dapat menggunakan alat elektroforesis dengan benar untuk membaca nilai berat molekul protein dari sampel
c. Agar mahasiswa dapat memahami teknik centrifugasi untuk pemisahan bagian-bagian sel.
d. Agar mahasiswa dapat menentukan protein total dengan metode SDS-PAGE 4. Prinsip kerja :
Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu campuran berdasarkan atas pergerakan partikel koloid yang bermuatan di bawah pengaruh medan listrik.
Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gel Elektroforesis (SDS-PAGE) adalah tehnik
untuk memisahkan rantai polipeptida pada protein berdasarkan kemampuannya untuk bergerak dalam arus listrik.
5. Teori Dasar :
Protein (protos yang berarti ”paling utama”) adalah senyawa organik kompleks yang mempuyai bobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Peptida dan protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus amino dan gugus karboksil. Jika bobot molekul senyawa lebih kecil dari 6.000, biasanya digolongkan sebagai polipeptida.
Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Protein tersusun dari atom C, H, O, dan N, serta kadang-kadang P dan S. Dari keseluruhan asam amino yang terdapat di alam hanya 20 asam amino yang yang biasa dijumpai pada protein. Asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang yang mencirikan gugus-gugusnya. Asam amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat.
Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan dalam air. Protein tersusun atas asam-asam amino melalui ikatan peptide, yaitu ikatan antara gugus karboksil (-COOH) dan gugus amina (-NH2). Oleh karena itu protein
juga disebut polipeptida.Ikatan yang terjadi pada protein selain ikatan peptide antar asam-asam amino penyusunnya, juga terjadi ikatan-ikatan yang lain. Misalnya, ikatan hydrogen yang terjadi pada gugus N-H dan pada gugus O-H, ikatan disulfide yaitu –S – S – menyokong terjadinya ikatan yang kompleks pada protein. Ikatan ion pada protein juga terjadi bila di dalamnya terdapat gugus ion logam, dan ikatan koordinasi, misalnya ikatan koordinasi antara ion Fe3+ dengan hemoglobin pada darah.
Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen. Ketika berada di luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Untuk mempertahankan fungsinya, setiap jenis protein membutuhkan kondisi tertentu ketika diekstraksi dari normal biological milie. Protein yang diekstraksi hendaknya dihindarkan dari proteolisis atau dipertahankan aktivitas enzimatiknya.
Analisa Protein
Untuk menganalisa protein yang ada di dalam sel tersebut, diperlukan prosedur fraksinasi sel yaitu :
Memisahkan sel dari jaringannya.
Menghancurkan membrane sel untuk mengambil kandungan sitoplasma dan organelnya.
Memisahkan organel-organel dan molekul penyusunnya.
Isolasi protein yaitu memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memisahkan protein dengan sifat tertentu dan protein dari protein lain lain yang tidak diinginkan dalam analisa.
Suatu teknik isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat-sifat fisik, kimiawi dan kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan aktifitasnya tidak berubah. Pada tahap awal isolasi, biasanya digunakan metode yang memiliki daya pemisah terendah seperti pengendapan dengan ammonium sulfat. Pengendapan ini dipengaruhi olah berbagai factor antara lain jumlah dan posisi gugus polar, berat molekul, pH dan temperature larutan.
6. Alat :
a. Mikropipet b. Mikrotube c. Bluetip d. Yellowtipe
e. Whitetip f. Centrifus g. Alat penggerus h. Spektrofotometer i. Beaker glass j. Erlenmeyer k. Alat elektroforesis 7. Bahan :
a. 1,5 Tris/HCL (pH 8,8), tidak butuh pengaturan pH Tris base : 36,8 gr
1N HCL : 45 ml
H2O (akuades) : Sampai volume 200 ml
b. 1M Tris/HCL (pH 6,8) Tris base : 24,2 gr H2O (akuades) : 150 ml
*atur pH sampai 6,8 menggunakan HCL sampai volume 200 ml
c. 5x Tris /Glysin Electrode Buffer (final 25 mM Tris, 250 mM glysin, 0,1% SDS) Tris base : 15,1 gr
Glysin : 94 gr 10% SDS : 50 ml
H2O : Sampai volume 100 ml
d. 2x Loading Buffer (NAIST)
1M Tris/HCL (pH 6,8) : 1 ml 10% SDS : 4 ml Bromophenol Blue : 20 mg Glycerol : 2ml H2O (akuades) : sampai 9 ml e. 30% Larutan Acrylamid Acrylamid : 14,5 gr Bisacrylamid : 0,5 gr H2O : Sampai volume 50 ml f. Larutan staining CBB Comassie blue 0,1% : 0,1 gr Metanol : 40 ml
Asam acetat glacial : 10 ml H2O (akuades) : 50 ml
*total volume 100 ml g. Larutan Destaining
Metanol 50% : 500 ml
Asam acetat glacial 10% : 100 ml H2O (akuades) : 400 ml *total volume 1000 ml h. PBS (>>>...) 5X pH 7,4 NaCl : 42,4 gr Na2HPO4 : 6,6 gr NaH2PO4 : 1,72 gr dH2O : Sampai volume 1000 ml Preparasi Gel a. Separating gel 12% Polyacrylamid 30% 6,0 ml (6000 µl) 1,5 M Tris (pH 8,8) 3,8 ml (3800 µl) 10% SDS 0,15 ml (150 µl) dH2O 4,9 ml (4900 µl) Temed 0,006 ml (6 µl) 10 APS 0,15 ml (150 µl)
b. 5% stacking gel dH2O 2,7 ml (2700 µl) Acrylamid 30% 0,67 ml (670 µl) 1,0 Tris (pH 6,8) 0,5 ml (500 µl) 10% SDS 0,04 ml (40 µl) 10% APS 0,04 ml (40 µl) Temed 0,004 (4 µl) Sampel a. Daging ayam b. Daging sapi c. Daging kambing d. Daging ikan belanak e. Telur ikan belanak
8. Cara kerja :
a. Cara kerja pembuatan Total Protein
Dipotong sampel daging ayam, kambing dan sapi, kemudian haluskan. Tambahkan NaCl fisiologis kemudian homogenkan. Dimasukkan daging kedalam mikrotube sebanyak 1500 µl, Kemudian centrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit pada suhu 4˚C. Daging yang telah di centrifus kemudian diambil supernatannya. Dibaca menggunakan alat spektrofotometer.
b. Cara kerja pembuat Separating Gel
Dipipet akuades steril 4900 µl, polyacrylamid 30% 6000 µl, 1.5 M tris (pH 8,8) 3800 µl, 10% SDS 150 µl, 10% APS 150 µl dan TEMED 6 µl masukkan kedalam erlenmeyer, homogenkan. Masukkan gradien gel ke dalam glassplate dengan cepat agar gel tidak membeku. Hindari gelembung , untuk meratakan permukaan gel tambahkan iso-propanol (butanol). Setelah berubah menjadi gel, butanolnya dibuang. Cuci permukaan gel menggunakan akuades
c. Cara kerja pembuatan stacking gel 5%
Dipipet akuades steril (dH2O) 2700 µl, polyacrylamid 30% 670 µl, 1,0 M Tris (pH 6,8)
500 µl, 10% SDS 40 µl, 10% APS 40 µl dan Temed 4 µl masukkan kedalam ke dalam erlenmeyer. Masukkan larutan stacking gel kedalam glassplates. Masukkan sisir secara perlahan, hindari gelembung. Setelah beku, ambil sisir dari stacking gel hingga terbentuk cetakan. Siapkan elektrode buffer 1x sebanyak 1000 ml. Ketika polimerasi sudah sempurna, siapkan tangki elektroforesis.
d. Cara kerja isolasi protein
Dipipet 5 µl sampel, masukkan ke lubang sumuran cetakan. Setelah semua sampel dimasukkan ke dalam sumuran, alat elektroforesis dihidupkan dengan 100 volt sampai blue dye mencapai dasar stacking gel, rubah 200 volt saat blue dye sampai pada gradient gel, setelah blue dye mencapai dasar gradient gel matikan alat elektroforesis
2 3 4 5 6 7 8 9 1
Glassplate 1 (sampel acak) 1. Loading buffer 2. Marker 3. Kambing 1 (K1) 4. Ayam 4 (A4) 5. Sapi 3 (S3) 6. Ayam 2 (A2) 7. Kambing 2 (K2) 8. Kambing 3 (K3) 9. Ayam 3 (A3) 10. Sapi 1 (S1) 11. Kosong 12. Loading buffer
Setelah selesai proses elektroforesis, sampel kemudian distaining dan didestaining. Lepaskan gel dari glassplate. Rendam gel dalam larutan Comassie Briliant Blue (CBB). Diinkubasikan selama 30 menit pada suhu ruang. Pindahkan gel pada larutan destaining,inkubasikan pada suhu ruang sambil digoyang menggunakan rotator sampai pita protein tampak jelas Setelah pita protein tampak jelas kemudian rendam menggunakan asam asetat 10% (*proses destaining 16.30 – 20.00 ± 3 ½ jam). Pengeringan gel, Gel kemudian dibungkuskan dengan plastik rokok yang sebelumnya dibasahi menggunakan akuadest, usahakan tidak ada gelembung di dalamnya, tunggu hingga mengerasdan mengering (*proses pengeringan dimulai jam 10.10 – 08.00 ± 22 jam)
Gambar. Hasil isolasi Protein menggunakan metode SDS-PAGE B. Penentuan Berat Molekul Protein
1. Hari / tanggal : Sabtu, 12 Desember 2015
2. Tempat :
Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Muhammadiyah Semarang
3. Tujuan :
a. Menentukan berat molekul sub unit protein
b. Membuat kurva standart berat molekul protein dan menginterpretasi grafik
4. Bahan :
Hasil SDS-PAGE total protein bakteri anggota Enterobacteriaceae dan strain acuan
Salmonella typhi NCTC 786 M
5. Cara kerja :
Setelah gel sudah ditutup dengan plastik, kering dan mengeras, gel discan menguunakan scanner kemudian divisualkan menggunakan aplikasi Coral Draw. Dihitung jarak pergerakan warna dari tempat awal dan jarak pergerakan protein dari tempat awal.
6. Hasil :
b. Perhitungan
1. Perhitungan Rf Marker Rf dihitung dengan rumus :
a.
Marker 1 = = 0.07b.
Marker 2 = = 0.12c.
Marker 3 = = 0.16d.
Marker 4 = = 0.22e.
Marker 5 = = 0.26f.
Marker 6 = = 0.36g.
Marker 7 = = 0.86h.
Marker 8 = = 0.52i.
Marker 9 = = 0.66j.
Marker 10= = 0.80k.
Marker 11= = 0.99 2. Perhitungan Rf sampel no 1 Rf dihitung dengan rumus :Band 1 = = 0.12 Band 12 = = 0.64 Band 2 = = 0.22 Band 13 = = 0.66 Band 3 = = 0.26 Band 14 = = 0.71 Band 4 = = 0.29 Band 15 = = 0.74 Band 5 = = 0.31 Band 16 = = 0.80 Band 6 = = 0.34 Band 17 = = 0.87 Band 7 = = 0.36 Band 18 = = 0.92 Band 8 = = 0.41 Band 19 = = 0.93 Band 9 = = 0.44 Band 20 = = 0.95 Band 10 = = 0.48 Band 21 = = 0.98 Band 11 = = 0.52 Band 21 = = 1.00 0.6 8.61 8.6 1.4 8.61.9 8.6 2.2 8.6 3.2 8.6 3.5 8.6 4.5 8.6 5.7 8.6 6.9 8.6 8.5 8.6 1 8.6 1.5 8.6 2.2 8.6 2.5 8.6 2.7 8.6 2.9 8.63.1 8.6 3.5 8.63.8 8.6 4.1 8.64.5 8.6 5.5 8.6 5.7 8.6 6.1 8.6 6.4 8.66.9 8.67.5 8.6 7.7 8.68.0 8.68.2 8.6 8.4 8.68.6 8.6
c. Dari Rf Sampel yang diketahui, hasil diplotkan ke grafik yang dibuat dari Rf dan BM Marker. Didapatkan data sebagai berikut :
MARKER Rf BM 0.07 200 0.12 150 0.16 120 0.22 100 0.26 85 0.36 70 0.41 60 0.52 50 0.66 40 0.80 30 0.99 25
d. BM protein sampel setelah diplotkan pada kurva marker
Rf BM Protein ( kDa ) Keterangan
0.12 150 Minor 0.22 100 Minor 0.26 85 Mayor 0.29 77 Mayor 0.31 73 Mayor 0.34 72 Minor 0.36 70 Mayor 0.41 60 Minor 0.44 56 Mayor 0.48 53 Minor 0.52 50 Mayor 0.64 41 Mayor SAMPEL Rf BM 0.12 150 0.22 100 0.26 85 0.29 77 0.31 73 0.34 72 0.36 70 0.41 60 0.44 56 0.48 53 0.52 50 0.64 41 0.66 40 0.71 36 0.74 34 0.80 30 0.87 28 0.90 27 0.93 26.5 0.95 26 0.98 25.5 1.00 25
0.66 40 Mayor 0.71 36 Minor 0.74 34 Mayor 0.80 30 Mayor 0.87 28 Mayor 0.90 27 Mayor 0.93 26.5 Minor 0.95 26 Minor 0.98 25.5 Minor 1.00 25 Minor
Metode sodium Dodecyl Polyacrilamide Gell Electrophoresis ( SDS-PAGE ), dapat memisahkan protein menjadi sub unit yang didasarkan pada berat molekul melalui matrix polyacrilamide yang dialiri medan listrik.
Penentuan berat molekul protein sampel dilakukan dengan menggunakan kueva standart pada marker proteinnya.
Hasil sparasi dengan SDS-PAGE 12 % yang diperoleh menunjukkan sampel No.1 memilki 22 pita protein yang terdiri dari 12 pita tebal dan 10 pita protein tipis ( minor )
Protein terpisah menjadi sub unit – sub unit protein karena ada proses parasi. Protein terpisah menjadi molekul protein berbentuk pita dengan panjang yang sama diberi gaya listrik untuk melewati medium berisi gel Polyacrilamide.
Molekul – molekul protein akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif berdasarkan berat molekul dalam sebuah medan listrik.
LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKULER
ISOLASI DNA DARAH
1. Tanggal
Praktikum
: 19 Desember 2015
2. Mata Kuliah : Biomolekuler
3. Materi
Praktikum
: Isolasi DNA Darah .
4. Tujuan : Untuk mengetahui dan mendapatkan DNA pada
Darah.
5. Metode : Elektroforesa Agarrose
6. Prinsip
Analisa
: Sel dilisiskan dengan Buffer Lysis kemudian dimurnikan dan dibuat muatan menjadi negative dengan penambahan SDS diekstraksi dengan Phenol diendapkan dengan Ethanol Absolut
dingin
7. Dasar Teori : Teknik Pemisahan Molekul di bawah pengaruh medan listrik, DNA dialirkan dialirkan dari kutub negative menuju kutub positif.
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam suatu matriks yang dipengaruhi oleh medan listrik. Komponen atau molekul tersebut dapat berupa DNA, RNA, maupun Protein dari pengotor lain. Elektroforesis menyediakan informasi mengenai ukuran, muatan, dan jenis komponen yang dielektroforesis (Fairbanks & Andersen 1999: 280). Aplikasi elektroforesis yaitu untuk uji paternitas dan identifikasi pelaku kejahatan (DNA fingerprinting). Elektrofo resis juga berperan dalam human genome project.
Terdapat lima jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA yaitu gel poliakrilamida, gel alkalin agarosa, gel agarosa, pati, dan cellulose acetat. Gel poliakrilamida berfungsi untuk menganalisis hasil ekstensiprimer. Gel alkalin agarosa berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. Gel agarosa berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar, pati dan cellulose acetat digunakan untuk memisahkan protein (Amersham biosciences 1999 : 6). Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat molekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul yang digunakan dalam praktikum elektroforesis adalah molekul DNA yang bermuatan negatif. Molekul akan bermigrasi menuju kutub positif
atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekulmolekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) DNA memiliki muatan negatif karena mengandung gugus O. Oleh karena itu, arah migrasi DNA adalah dari kutub negatif ke kutub positif (Kusuma 2010 : 11).
Migrasi DNA tersebut dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu ukuran molekul DNA, konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, poripori gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Pertama, ukuran molekul DNA. Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar. Kedua, konsentrasi gel. Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekulmolekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar. Ketiga bentuk molekul. Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat. Keempat densitas muatan. Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah. Kelima, poripori gel. Semakin kecil poripori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul
DNA. Keenam, voltase. Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA. Ketujuh, larutan buffer elektroforesis. Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA (Pláteník 2009 : 3).
Aparatus elektroforesis memiliki beberapa komponen yang terdiri dari Comb, Tray,
Chamber, dan sumber listrik. Comb digunakan
untuk membentuk well pada gel agarosa. Tray digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.
Chamber digunakan sebagai wadah gel agarosa.
Sumber listrik digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis (The biotechnology education 2003 : 911).
Hasil DNA elektroforesis harus dibandingkan denga DNA marker. Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. DNA Marker yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi (Thompson & Fritchman 2012: 124 – 144). Lokasi fragmen DNA yang terbentuk seperti pita – pita pada elektroforesis dapat diamati secara spesifik dengan menggunakan pewarna. Pewarna tersebut dapat berupa etidium bromida atau gel red. Etidium bromida memiliki kelebihan yaitu mudah digunakan dan akan menghasilkan warna terang apabila terpapar sinar UV. Kelebihan gel red yaitu tidak memiliki sifat mutagen seperti etidium bromida (Babec 2012 13).
8 Alat dan Bahan : a. Alat. - Sentrifuge - Conical - Vortex - Pipet
- Pisau dan Gunting - Blue tip & Yellow tip - Refrigerator - Elektroforesis - Rotator - Neraca Analitik. b. Bahan / reagen - Daging Kambing - Buffer lisis - Proteinase K - Phenol CIAA - Ethanol absolute - Ethanol 70 % - Reagen TE 9. Prosedur Kerja
a. Ambil darah 5 cc dengan Spuit 5 cc
b. Pindahkan jaringan ke dalam Conical 15 ml c. Tambahkan Buffer Lysis 2 ml
d. Centrifuge 2000 rpm. 20 menit 4 C e. Tambahkan Proteinase K 20 ul (10mg/ml) f. Vortex, inkubasi 55 C selama 1 jam
g. Tambahkan phenol CIAA 2 ml ( 1:1) h. Gojog 15-30 menit
i. Sentrifuge 2000 rpm selama 20 menit pada suhu ruang j. Pindahkan lapisan atas ke dalam conical 15 ml
k. Tambahkan Ethanol Absolut dingin 1 : 1 atau 1 : 2
l. Pindahkan benang-benang DNA dalam 500 ul Ethanol 70 % m. Sentrifuge 12000 rpm selama 10 menit
n. Kering anginkan
o. Tambahkan TE 250 ul ,simpan pada suhu ruang selama 1 jam p. DNA siap digunakan
10. Hasil Analisa :
Tampak bercak hasil isolasi DNA Darah.
11. Pembahasan :
DNA yang bermuatan negative akan bergerak menuju kotub positif melalui pori agarose.
Deteksi DNA daging kambing dengan penambahan Ethidium bromide bila terkena sinaar UV maka akan terjadi pendaran fluoresensi orange.
Menggunakan marker DNA 12. Kesimpulan :
DNA darah tredeteksi.
13. Pustaka
- Modul Praktikum Biomolekuler D4 Analis Kesehatan Unimus 2015
- Fatchiyah. Polimerase Chain Reaction,Brawijaya University : Malang.2012. - Fatchiyah,Auningtyas E L,Widyarti S dannsi orange.
- Rahayu S, Biologi Molekuler: Prinsip dasar Analisis.Airlangga : Jakarta. 2011 - Fatchiyah,Auningtyas E L,Widyarti S dan Rahayu S,Buku Praktikum : Teknik
