UJI TUMBUH BEBERAPA ISOLAT BAKTERI Vibrio BERPENDAR
YANG DIISOL ASI DARI LOKASI BERBEDA
Endang Susianingsih dan Koko Kurniawan Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau
Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi Selatan E-mail: litkan ta_0 5@yahoo.com; e_ sis@yah oo.com
ABSTRAK
Di antara beberapa bakteri patogen, spesies vibrio sudah dikenal sebagai penyakit vibriosis ada udang penaeid. Bakteri vibrio adalah salah satu penyebab pnyakit yang cukup banyak menyerang hewan budidaya seperti udang windu. Beberapa spesies ikan dan kekerangan bahkan juga karang. Beberapa spesies vibrio berpendar seperti Vibrio cholerae (biotype Albensis), V.fischeri, V. harveyi, V. logei, V. splendidus, V.meditteranev, Photobacterium leiognathi, dan P. phosporeum diketahui berhubungan erat dengan beberapa kejadian penyakit pada lingkungan pembesaran hewan budidaya. Vibrio harveyi merupakan bakteri yang membutukan sodium klorida untuk hidupnya, berbentuk curve-rod dan termasuk dalam kelompok bakteri gram negatif yang banyak ditemukan pada lingkungan perairan serta dapat memendarkan cahaya sendiri pada kondisi tertentu. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kurva pertumbuhan dari beberapa isolat bakteri vibrio berpendar yang diisolasi dari lokasi berbeda setelah ditumbuhkan pada media spesifik dengan penambahan rifampisin. Tiga isolat bakteri yang digunakan adalah bakteri isolat 1 (Banyuwangi), isolat 2 (Negare-Bali), serta isolat 3 (Gondol-Bali). Pembuatan mutan resisten rifampisin diakukan dengan menggunakan dosis 50 dan 100 mg/ L. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat 1 dan 2 memperlihatkan puncak pertumbuhan pada jam ke-4 kemudian mengalami penurunan, sedangkan isolat 3 mengalami puncak pertumbuhan pada jam ke-6. Pengetahuan mengenai puncak pertumbuhan bakteri ini dapat dijadikan acuan pada uji patogenisitas.
KATA KUNCI: uji tumbuh, vibrio berpendar, lokasi berbeda
PENDAHULUAN
Pertumbuhan merupakan suatu proses yang bersifat irreversible artinya tidak dapat dibalik kejadiannya. Pertumbuhan didefinisikan sebagai pertambahan kuantitas, konstituen seluler dan struktur organisme yang dapat dinyatakan dengan ukuran, diikuti pertambahan jumlah, pertambahan ukuran sel, pertambahan berat atau massa, dan parameter lain. Pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor
1. suhu, umumnya bakteri tumbuh baik pada suhu antara 25°C-35°C;
2. Kelembaban, lingkungan lembab dan tingginya kadar air sangat menguntungkan untuk pertumbuhan bakteri;
3. Sinar Matahari, sinar ultraviolet yang terkandung dalam sinar matahari dapat mematikan bakteri; 4. Zat kimia, antibiotik, logam berat dan senyawa-senyawa kimia tertentu dapat menghambat
bahkan mematikan bakteri.
Di antara beberapa bakteri patogen, spesies vibrio sudah dikenal sebagai penyebab penyakit vibriosis pada udang penaeid. Bakteri vibrio adalah salah satu penyebab penyakit yang cukup banyak menyerang hewan budidaya seperti udang windu (Karunasagar et al., 1994), beberapa spesies ikan dan kekerangan (Austin & Zhang, 2006) bahkan juga karang (Ben-Haim et al., 2003). Beberapa spesies Vibrio berpendar seperti Vibrio cholerae (biotype albensis), V. fischeri, V. harveyi, V. logei, V. splendidus, V. mediterranei (Farmer & Hickman-Brenner, 1992), V. orientalis (Yang et al., 1983), Photobacterium leiognathi dan P. Phosphoreum diketahui berhubungan erat dengan beberapa kejadian penyakit pada lingkungan pembenihan dan pembesaran hewan budidaya.
Penyakit vibriosis pada budidaya udang dapat menyebabkan penurunan produksi yang cukup besar. Seperti diketahui bahwa kemampuan bakteri dalam menginfeksi inangnya juga dipengaruhi
tingkat patogenisitasnya juga dapat digunakan untuk mendeteksi adanya kontaminasi bakteri tersebut sehingga akan sangat membantu dalam penanganan dan pencegahan awal yang tepat waktu untuk mengurangi kematian udang.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini terdiri atas 2 tahap menggunakan 3 isolat bakteri Vibrio sp. berpendar yaitu isolat 1 yang diisolasi dari Banyuwangi, isolat 2 dari Negare Bali, dan isolat 3 dari Gondol, Bali. Masing-masing tahapan tersebut adalah sebagai berikut:
1. Pembuatan mutan dari masing-masing isolat bakteri; 2. Uji pertumbuhan mutan masing-masing isolat bakteri.
Pembuatan Mutan dari Masing-masing Isolat Bakteri Uji
Pembuatan mutan dari masing-masing isolat dimaksudkan untuk merubah sifat bakteri tersebut dari sensitif terhadap suatu antibiotik menjadi resisten. Hal ini bertujuan untuk memberikan penanda pada bakteri agar mudah dikenali pada saat isolasi ulang bakteri tersebut pada prosedur postulat Koch.
Proses pembuatan mutan tersebut dilakukan dengan cara:
- Isolat bakteri yang akan diuji (isolat 1, 2, dan 3) masing-masing diinokulasi ke dalam media tumbuh Nutrient Broth (NB), yang dibuat dengan cara melarutkan sebanyak 8 g NB ke dalam 1 L aquadest steril dan diberi penambahan NaCl sebanyak 1,5 %, dihomogenkan dan kemudian dibagi ke dalam 6 tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 mL. Sterilisasi terhadap media tersebut dilakukan dengan menggunakan autoclave pada suhu 121°C tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah steril dan suhunya telah sesuai dengan suhu ruang, inokulasi masing-masing bakteri uji dilakukan dengan memasukkan sebanyak 1 ose bakteri ke dalam media NB tersebut. Penumbuhan dan homogenisasi dilakukan menggunakan shaker pada 150 rpm selama 4 jam. - Setelah 4 jam (penentuan 4 jam berdasarkan uji tumbuh yang dilakukan pada isolat bakteri
yang WT/wild type) bakteri tersebut ditanam (diinokulasi) ke dalam media TCBS (Thiosulfat Ctrate Bile Sucrose Agar). Media TCBSA dibuat dengan cara menimbang sebanyak 89 g TCBSA dan dilarutkan ke dalam 1.000 mL aquadest steril. Larutan ini kemudian dimasak hingga mendidih dan disterilkan menggunakan autoclave. Setelah steril dan suhunya telah sesuai dengan suhu ruang kemudian dituang ke plate (petri dish) steril masing-masing sebanyak 20 mL/plate. Inokulasi bakteri pada media TCBSA dilakukan dengan cara mengambil sebanyak 100 mikron (0,1 mL) biakan bakteri dalam NB dan disebarkan secara merata ke media TCBSA tersebut.
- Untuk mengetahui sensitifitas bakteri terhadap antibiotik rifampicin, maka dilakukan uji hambatan menggunakan rifampisin 5, 10, 50, dan 100 mg/L, dengan cara merendam papper disk (kertas cakram) ke dalam masing-masing konsentrasi rimfampisin kemudian di letakkan (ditempatkan) pada media TCBSA sesuai penomoran yang telah diberikan (Gambar 1). Sebelumnya dilakukan penanaman bakteri Vibrio sp. dengan metode sebar pada media TCBS yang akan dijadikan me-dia uji hambat.
- Uji resistensi bakteri Vibrio sp. dilakukan dengan menanam biakan bakteri yang telah dipadatkan melalui proses sentrifugasi pada media TCBS yang telah ditambahkan antibiotik rifampicin 50 dan 100 mg/L. Koloni bakteri Vibrio sp. yang berhasil tumbuh pada media TCBSA +rif 50 mg/L selanjutnya ditumbuhkan lagi pada media TCBSA + rif 100 mg/L. Koloni bakteri yang tumbuh pada media TCBSA + rif 100 mg/L selanjutnya diisolasi dan merupakan isolat bakteri Vibrio sp. resisten rifampicin.
Setelah bakteri mutan (resisten terhadap rifampisin) diperoleh maka selanjutnya dilakukan uji tumbuh untuk masing-masing isolat bakteri tersebut.
Uji Pertumbuhan Mutan Masing-masing Isolat Bakteri
Uji tumbuh ini dimaksudkan untuk melihat kemampuan tumbuh dari masing-masing isolat sehingga dapat diketahui pada saat kapan bakteri tersebut berada pada puncak pertumbuhannya. Uji ini dilakukan dengan cara menginokulasi bakteri uji ke dalam media tumbuh NB yang kemudian dihomogenkan dengan menggunakan shaker (pengocok) secara terus-menerus pada kecepatan 150 rpm. Pengamatan pertumbuhan dilakukan dengan cara menginokulasi bakteri pada media NB ke dalam media TCBSA yang telah diberi penambahan rifampisin masing-masing pada konsentrasi 50 dan 100 mg/L. Pengambilan sampel untuk pengamatan pertumbuhan dilakukan dengan interval
setiap 2 jam selama 24 jam. Sampel bakteri yang di inokulasi pada media TCBSA penanamannya dilakukan dengan menggunakan larutan fisiologis saline solutin (0,85% NaCl) secara berseri (pengenceran) mengikuti prosedur penanaman bakteri menurut Austin (1993). Bakteri-bakteri yang telah ditanam pada media TCBSA tersebut pertumbuhannya kemudian dihitung setelah diinkubasi selama 24 jam untuk setiap waktu pengamatan. Penghitungan dilakukan dengan cara menghitung setiap koloni bakteri yang tumbuh pada setiap pengenceran yang diberikan berdasarkan rumus: di mana:
N =Jumlah bakteri
T =Total bakteri pada semua cawan dengan tingkat pengenceran yang sama (cfu)
Q =Jumlah cawan
V =Volume sampel yang diinokulasi
S =Tingkat pengenceran
Gambar 1. Penempatan kertas cakram yang telah mengalami perendaman rifampisin pada konsentrasi 50 dan 100 mg/L
(cfu/mL)
S
1
X
V
1
X
Q
T
N
Zona hambatan yang diperlihatkan oleh masing-masing isolat dengan penambahan rifampisin 50 dan 100 mg/L pada media TCBSA yang dibandingkan dengan kontrol dapat dilihat pada Gambar 3, 4, dan 5.
Uji Pertumbuhan Mutan Masing-masing Isolat Bakteri
Hasil uji pertumbuhan untuk masing-masing isolat dengan interval waktu pengamatan setiap 2 jam pada media NB (Nutrien Broth) dapat dilihat pada Gambar 6.
Dari Gambar 6 terlihat bahwa untuk isolat 1 (kepadatan populasi 108 cfu/mL) puncak
pertumbuhannya diperoleh pada jam 4, isolat 2 puncak pertumbuhannya diperoleh pada jam ke-4 (kepadatan populasi hingga 109 cfu/mL) kemudian mengalami penurunan, sedangkan isolat 3
Rif 100 mg/L Rif 50 mg/L Kontrol
Gambar 3. Hasil uji hambat bakteri asal Banyuwangi
Gambar 2. Hasil uji hambat masing-masing isolat bakteri dengan menggunakan kertas cakram
Rif 100 mg/L Rif 50 mg/L Kontrol
Gambar 4. Hasil uji hambat bakteri asal Negare, Bali
Kontrol
Rif 100 mg/L Rif 50 mg/L
Gambar 5. Hasil uji hambat bakteri asala Gondol, Bali
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Waktu pengamatan (interval waktu 2 jam)
Po p u la si b ak te ri (Lo g c fu /m L) 1 2 3
kimiawi dan ukuran serta bertambahnya substansi intraseluler sehingga siap untuk membelah diri.
2. Logaritma atau eksponensial: Sel membela diri dengan laju yang konstan, massa menjadi dua kali lipat, keadaan pertumbuhan seimbang.
3. Stationary (tetap): Terjadinya penumpukan racun akibat metabolisme sel dan kandungan nutrien mulai habis, akibatnya terjadi kompetisi nutrisi sehingga beberapa sel mati dan lainnya tetap tumbuh. Jumlah sel menjadi konstan.
4. Mati: sel menjadi mati akibat penumpukan racun dan habisnya nutrisi, menyebabkan jumlah sel yang mati lebih banyak sehingga mengalami penurunan jumlah sel secara eksponensial. KESIMPULAN
- Bakteri Vibrio sp. yang diujikan memiliki kemampuan untuk tumbuh pada media spesifik dengan penambahan rifampisin pada konsentrasi 50 dan 100 mg/L.
- Puncak pertumbuhan bakteri Vibrio sp. yang diujikan adalah 4 dan 6 jam. DAFTAR ACUAN
Anonim. 2006. http/rachdie.blogsome.com/2006/prinsip-pertumbuhan-bakteri/. Diakses tanggal 17 Juli 2011.
Austin,B. & Zhang, X.-H. 2006. Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates. Lett. Appl. Microbiol., 43: 119-124.
Ben Haim, Y., Thompson, F.L., Thompson, C.C., Cnockaert, M.C., Hoste, B., Swings, J., & Rosenberg, E. 2003. Vibrio coralliilyticus sp. nov., a temperature-dependent pathogen of the coral Pocillopora damicornis. Int J. Syst. Evol. Microbiol., 53: 309-315.
Defoirdt, T. 2007. Quorum sensing disruption and the use of short-chain fatty acids and polyhydroxyalkanoates to control luminescent Vibriosis. PhD thesis, Ghent University, Belgium, 228 pp.
Farmer, J.J. & Hickman-Brenner, F.W. 1992. The genera Vibrio and Photobacterium. In The Prokaryotes - a Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications, Balows, A (Ed.). New York, Springer, p. 2,952-3,011.
Karunasagar, I., Pai, R., Malathi, G.R., & Karunasagar, I. 1994. Mass mortality of Penaeus monodon larvae due to antibiotic-resistant Vibrio harveyi infection. Aquaculture, 128: 203-209.
Yang, Y.K., Yeh, L.P., Cao, Y.H., Baumann, L., Baumann, P., Tang, J.E., & Beaman, B. 1983. Characterization of marine luminous bacteria isolated off the coast of China and description of Vibrio orientalis sp. Nov. Curr. Microbiol., 8: 95–100. http://mic.sgmjournals.org 1777 Molecular identification of V. harveyi-related isolates.
