LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOTERAPI PENYAKIT INFEKSI PEWARNAAN GRAM
NAMA : TRI NENCI S PURI
HARI, TANGGAL PRAKTIKUM : RABU, 23 SEPTEMBER 2015
ASISTEN :1. BETHARY K. 2. HIMMATUL ULYA LABORATORIUM FARMAKOTERAPI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN JATINANGOR 2015
I. Tujuan
1. Mengamati dua kelompok bakteri yaitu bakteri gram positif dan gram negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan gram.
2. Memahami setiap langkah dan reaksi – reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.
II. Prinsip
1. Teknik Pewarnaan Diferensial
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba (Pelczar dan Chan, 2007). 2. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar gram-positif dan gram-negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri (Karman, Oman, 2008).
3. Zat Warna
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di antaranya berwarna (Volk & Wheeler, 1993).
III. Teori Dasar
Bakteri adalah sel prokariotik yang khas, uniselular, pleomorfik, dan tidak mengandung struktur yang terbatasi membran di dalam sitoplasmanya. Sel-selnya secara khas berbentuk bola (kokus), batang (basilus), atau spiral (spirilium). Ukurannya berkisar antara 0,1 sampai 0,3 μm dengan diameter sekitar 0,5 sampai 1,0 μm (Wattimena, 1981).
Escherichia coli merupakan bakteri berbentuk batang pendek dengan ukuran 1,10-1,5 μm, Gram negatif yang bergerak menggunakan flagella, dan memiliki sejumlah fimbrae atau phili sebagai alat pelekat pada host (Budiyanto, 2002).
Dinding sel bakteri Staphylococcus aureus adalah sebuah pelindung protektif yang kuat yang mana terlihat bersifat relatif amorf, dengan tebal sekitar 20-50nm (Shockman and Barret, 1983). Di bawah dinding sel adalah
sitoplasma yang terlapisi oleh membran sitoplasma. Peptidoglikan adalah komponen utama penyusunnya yaitu hingga 50% (Waldvogel, 1990).
Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Pada pewarnaan Gram, hasil yang didapat akan ditentukan dari komposisi dinding sel pada bakteri. Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal violet sehingga ketika diamati dengan mikroskop akan menunjukkan warna ungu sedangkan bakteri Gram negatif tidak dapat mempertahankan warna ungu dari Kristal violet tetapi zat warna safranin dapat terserap pada dinding sel sehingga pada saat dilihat menggunakan mikroskop akan memperlihatkan warna merah. Hasil pewarnaan Gram dapat digunakan untuk mengetahui bentuk morfologi dari jenis isolat yaitu warna dan bentuk sel bakteri tersebut (Pratita dan Putra, 2012).
Pada pewarnaan gram, adanya perbedaan pewarnaan disebabkan adanya perbedaan dinding sel antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pada gram positif senyawa kompleks cat kristal violet-iodium tertahan oleh dinding sel setelah dicuci dengan alkohol. Alkohol diduga menyebabkan penyempitan diameter pori peptidoglikan dinding sel. Pada bakteri gram negatif lapisan peptidoglikannya tipis sehingga pori yang terbentuk cukup besar. Iodium tidak cukup untuk memperkecil pori dinding sel peptidoglikan, sehingga kompleks kristal violet-iodium keluar tercuci dari dinding sel tersebut (Adnany dan Razif, 2000).
Hal itu disebabkan karena bakteri gram positif dan gram negatif mempunyai dinding sel yang berbeda susunan kimianya. Dinding sel bakteri gram negatif lebih rumit susunanya dari pada bakteri gram positif. Dinding sel bakteri gram positif hanya tersusun dari satu lapisan saja, yaitu lapisan peptidoglikan yang relatif tebal. Sedangkan dinding sel bakteri gram negatif mempunyai dua lapisan dinding sel, yaitu :lapisan luar yang tersusun dari lipopolisakarida dan protein, dan lapisan dalam yang tersusun dari peptidoglikantetapi lebih tipis dari pada lapisan peptidoglikan pada bakteri gram positif. ( Timotius, KH, 1982 ).
IV. Alat dan Bahan 4.1. Alat a. Bak pewarna b. Kaca obyek c. Kapas d. Kertas saring e. Mikroskop majemuk f. Ose g. Pembakar spirtus 4.2. Bahan a. Air fuksin b. Air suling c. Alkohol 70%
d. Karbol gentian violet e. Lugol
f. Minyak emersi g. Suspensi bakteri
4.3. Gambar Alat
kaca obyek
kapas
mikroskop
ose
V. Prosedur
Alat dan bahan disiapkan. Kaca obyek direndam dengan alkohol, lalu dikeringkan dengan kapas. Ose difiksasi kemudian didinginkan. Setelah itu, olesan dibuat dari suspensi bakteri menggunakan ose di atas kaca obyek. Kaca obyek yang telah diolesi suspensi bakteri dilewatkan di atas pembakar spirtus agar suspensi bakteri melekat pada kaca obyek. Olesan digenangi dengan karbol gentian violet, didiamkan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan air suling. Setelah itu, olesan digenangi dengan lugol selama 2 menit dan dibilas lagi dengan air suling. Olesan dicuci dengan pemucat alkohol 70% tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai zat warna larut, lalu dibilas dengan air suling. Kemudian olesan digenangi dengan pewarna tandingan air fuksin selama 30 detik, warna berlebih dibilas dengan air suling lalu dikeringkan dengan kertas saring. Minyak emersi diteteskan sedikit pada preparat, lalu diperiksa di bawah mikroskop, dimulai dari perbesaran lensa obyektif 10X, 40X, dan 100X. Hasil yang terlihat pada mikroskop diamati dan digambarkan.
VI. Data Pengamatan
Identitas Bentuk: bacil Warna: merah Gram: negatif
Bakteri: Eschericia coli
coccus, warna biru Identitas
Bentuk: coccus Warna: biru Gram: positif
Bakteri: Staphylococcus aureus
VII. Pembahasan
Pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui sifat fisik bakteri yaitu bentuk dan warna, yang kemudian data tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi jenis bakteri tersebut termasuk dalam bakteri gram positif atau gram negatif. Terdapat beberapa macam zat pewarna yang dapat
digunakan dalam uji pewarnaan gram, seperti Carbol Gentian Violet (CGV), metilen biru, dan karbol fuksin. Zat pewarna tersebut umumnya bersifat alkali karena sitoplasma sel bakteri bersifat basofilik (suka akan basa). Dalam praktikum ini, digunakan karbol gentian violet sebagai zat warna primer dan karbol fuksin sebagai zat warna pembanding. Sebagai zat warna sekunder atau zat pemantek, digunakan lugol atau iodium. Zat warna sekunder atau zat pemantek berguna untuk mengintensifkan warna primer atau memperkuat reaksi. Alkohol digunakan sebagai zat pemucat karena alkohol diduga menyebabkan penyempitan diameter pori peptidoglikan dinding sel. Pada bakteri gram negatif lapisan peptidoglikannya tipis sehingga pori yang terbentuk cukup besar. Iodium tidak cukup untuk memperkecil pori dinding sel peptidoglikan, sehingga kompleks kristal violet-iodium keluar tercuci dari dinding sel tersebut.
Sebelum digunakan, kaca obyek direndam dengan alkohol terlebih dahulu agar bersih dan steril. Setelah itu, kaca obyek dikeringkan dengan kapas dan diberi lingkaran untuk memudahkan ketika dilihat dengan mikroskop. Ose yang digunakan untuk mengambil suspensi bakteri difiksasi terlebih dahulu dan didinginkan. Apabila ose digunakan dalam keadaan panas, maka dapat membunuh bakteri. Sebelum diambil dengan ose, suspensi bakteri dikocok terlebih dahulu untuk mengurangi kemungkinan tidak terambilnya bakteri pada ose karena bakteri mengendap di bawah. Bakteri dioleskan sebaiknya tidak terlalu rapat karena olesan yang terlalu tebal akan memucat lebih lama dari olesan dengan kerapatan normal. Setelah itu, olesan difiksasi secukupnya. Olesan yang dipanaskan secara berlebihan akan menyebabkan pecahnya dinding sel. Akibatnya, sel gram positif akan melepaskan pewarna primer dan menerima pewarna tandingan.
Bakteri gram positif dan gram negatif dapat dibedakan melalui warna yang terbentuk. Perbedaan bakteri gram positif dan negatif terletak pada susunan dinding selnya. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal yang akan menyusut oleh pembilasan alkohol (terdehidrasi), sehingga pori-pori dinding sel menutup dan mencegah larutnya kompleks pewarna primer pada saat pemucatan. Sedangkan dinding sel bakteri gram negatif
banyak mengandung lipid, yang umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Larutnya lipid diduga memperbesar pori-pori dinding sel dan menyebabkan proses pemucatan berlangsung lebih cepat.
Hasil yang didapat adalah bakteri berbentuk bacil, berwarna merah, dan bakteri berbentuk coccus, berwarna biru. Bakteri berbentuk bacil dan berwarna merah tersebut diduga adalah Eschericia coli. Sehingga dapat diketahui bahwa Eschericia coli merupakan bakteri gram negatif yang mana berwarna merah pada uji pewarnaan gram. Warna merah berasal dari pewarna karbol fuksin yang berinteraksi dengan dinding sel bakteri gram negatif. Tidak terbentuknya warna biru pada dinding sel bakteri gram negatif karena zat warna biru terpucatkan atau luntur ketika dibilas dengan alkohol. Hal tersebut terjadi karen seperti yang dijelaskan di atas. Dengan melekatnya CGV pada dinding sel bakteri gram positif, zat warna pembanding karbol fuksin tidak melekat pada dinding sel bakteri gram positif. Sedangkan bakteri berbentuk coccus dan berwarna biru diduga adalah Staphylococcus aureus. Dengan begitu, bakteri Staphylococcus aureus diketahui sebagai bakteri gram positif karena menunjukkan warna biru dalam uji pewarnaan gram, yang mana berarti dinding selnya banyak mengandung peptidoglikan sehingga CGV tidak luntur ketika dibilas dengan alkohol.
VIII. Simpulan
1. Bakteri gram positif menunjukkan warna biru atau ungu dalam uji pewarnaan gram, sedangkan bakteri gram negatif menunjukkan warna merah dalam uji pewarnaan gram.
2. Warna biru dari CGV melekat pada dinding sel karena CGV bersifat alkali dan sitoplasma sel bakteri bersifat basofilik. Warna merah berasal dari karbol fuksin yang berinteraksi dengan dinding sel bakteri gram negatif. Warna biru dari CGV pada bakteri gram negatif luntur karena pembilasan dengan alkohol.
Daftar Pustaka
Adnany dan M. Razif. 2000. Identifikasi Morfologi Bakteri Methanogen dari Efluen Clarifier IPLT Keputih Surabaya. Jurnal Purifikasi, Vol.1, No. 6, Nopember 2000 : 355-360.
Budiyanto, M.A.K. 2002. Dasar-dasar Ilmu Gizi. Malang: UMM Press.
Karman, O. 2008. Biologi untuk Kelas X Sekolah Menengah Atas. Bandung: Grafindo Media Pratama
Pelczar, M. J., dan Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. New York: Mc Graw Hill Book.
Pratita, M. Y. E., dan S. R. Putra. 2012. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Termofilik dari Sumber Mata Air Panas di Songgoroti Setelah Dua Hari Inkubasi.
Jurnal Teknik POMITS, Vol. 1, No. 1, (2012) 1-5.
Shockman G. D. Barret J. F. 1983. Structure, function, and assembly of cell walls of gram-positive bacteria. Annu Rev Microbiol 37: 501-527.
Timotius, K.H. 1982. Mikrobiologi Dasar Cetakan I. Salatiga: UKSW. Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga.
Waldvogel, F. A. 1990. Staphylococcus aureus (including toxic shock syndrome), In: Mandell GL, Douglas RG, Bennet JE (eds.). Principles and Practice of Infectious Disease, 3rd ed. Churchill Livingston, London. pp 1489-1510.
Wattimena, J. R., dkk. 1981. Farmakodinamik dan Terapi Antibiotik. Yogyakarta: UGM.
