ISOLASI FUNGI ENDOFIT DARI DAUN KETEPENG CINA (Cassia alata L.) SEBAGAI PENGHASIL ANTIMIKROBA
LIDYAWATI SABUT N111 12 112
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
ii
ISOLASI FUNGI ENDOFIT DARI DAUN KETEPENG CINA (Cassia alata L.) SEBAGAI PENGHASIL ANTIMIKROBA
SKRIPSI
untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana
LIDYAWATI SABUT N111 12 112
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR 2018
iii
PERSETUJUAN
ISOLASI FUNGI ENDOFIT DARI DAUN KETEPENG CINA (Cassia alata L.) SEBAGAI PENGHASIL ANTIMIKROBA
LIDYAWATI SABUT N111 12 112
Disetujui oleh : Pembimbing Utama,
Dr. Hj. Sartini, M.Si., Apt.
NIP. 19611111 198703 2 001
Pembimbing Pertama, Pembimbing Kedua,
Dra.Rosany Tayeb, M.Si., Apt. Andi Dian Permana, S.Si.,M.Si., Apt.
NIP. 19561011 198603 2 002 NIP.19890205 201212 1 002
Pada tanggal : 25 Januari 2018
iv
PENGESAHAN
ISOLASI FUNGI ENDOFIT DARI DAUN KETEPENG CINA (Cassia alata L.) SEBAGAI PENGHASIL ANTIMIKROBA
Oleh :
LIDYAWATI SABUT N111 12 112
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Pada Tanggal : 25 Januari 2018 Panitia Penguji Skripsi
1. Ketua : Prof. Dr. M. Natsir, MS., Apt. (………) 2. Sekretaris : Firzan Nainu, S.Si., M. Biomed., Ph.D., Apt (………) 3. Ex. Officio : Dr. Hj. Sartini, M.Si., Apt. (………) 4. Ex. Officio : Dra. Rosany Tayeb, M.Si., Apt. (………) 5. Ex. Officio : Andi Dian Permana, S.Si., M.si., Apt. (………) 6. Anggota : Subehan, S.Si., M. Pharm. Sc., Ph.D., Apt. (………)
Mengetahui :
Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt.
NIP. 19641231 199002 1 005
v
PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama : Lidyawati Sabut
NIM : N111 12 112
Judul Skripsi : “Isolasi Fungi Endofit dari Daun Ketepeng Cina (Cassia alata L.) Sebagai Penghasil Antimikroba”
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi ini adalah karya saya sendiri, tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila di kemudian hari terbukti bahwa pernyataan saya ini tidak benar, maka skripsi dan gelar yang diperoleh, batal demi hukum.
Makassar, 25 Januari 2018 Penulis,
Lidyawati Sabut
vi
UCAPAN TERIMA KASIH
Alhamdulillahi Rabbil ‘alamin, segala puji bagi Allah SWT, Pemilik segala ilmu dan rahmat Yang Maha Sempurna atas karunia dan izin-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana di Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin. Salam dan shalawat kepada Rasulullah Muhammad SAW, keluarga, sahabat dan para pengikutnya yang senantiasa istiqomah dalam sunnahnya hingga akhir zaman.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini banyak rintangan dan hambatan yang dihadapi, namun dengan doa dan bantuan dari berbagai pihak, skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, perkenankanlah penulis mengucapkan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada ibu Dr. Hj. Sartini, M.Si., Apt selaku Pembimbing Utama, bapak ibu Dra. Rosany Tayeb, M.Si., Apt selaku Pembimbing Pertama dan bapak Andi Dian Permana, S.Si., M.Si., Apt selaku Pembimbing Kedua yang telah meluangkan waktu selama ini untuk memberi petunjuk, membagi ilmu dan menyumbangkan fikiran dalam membimbing penulis selama melakukan penelitian hingga selesainya skripsi ini.
Semua ini tidak akan berarti tanpa dukungan moril maupun materi dari kedua orang tua dan sanak saudara serta keluarga besar penulis, terima kasih atas setiap cinta yang terpancar serta doa dan restu yang selalu mengiringi tiap langkah penulis. Ayahanda tersayang Sabut Sinaung
vii
dan Ibunda tercinta Haerati yang telah membesarkan dan mendidik penulis, serta senantiasa memberikan kasih sayang sepanjang masa sehingga penulis bisa seperti sekarang ini.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tinggi juga penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Aliyah, M.S., Apt. selaku Penasihat Akademik atas arahan dan bimbingannya selama proses studi penulis.
Pada kesempataan kali ini pula, penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1. Bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin
2. Bapak Prof. Dr. H. M. Natsir Djide, MS., Apt., bapak Firzan Nainu, S.Si., M.Biomed., Ph.D., Apt., bapak Subehan, S.Si., M.Pharm.Sc., Ph.D., Apt. selaku dosen penguji penulis atas saran dan masukan yang diberikan.
3. Seluruh dosen dan staf Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas bantuannya dalam penyelesaian skripsi ini.
4. Kak Haslia S.Si. selaku Laboran Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Universitas Hasanuddin
5. Saudari tercinta Sariyanti S.Kep., Ns., Susanti, Irmayanti SH., MH., Windi Widyawati, Indah Wijayanti, dan Nursanti Ramadhan terima kasih atas segala doa, dukungan, canda, tawa dan segala bantuan kepada penulis.
viii
6. Sahabat terspesial penulis SOSSY yang tidak pernah jenuh mendengarkan keluh kesah dan tempat berbagi canda, tawa, selalu menemani penulis di setiap suka maupun duka, serta memberikan semangat dan bantuan kepada penulis dalam setiap sisi kehidupan selama mengenal dunia perkuliahan.
7. Sahabat terbaik Jeni Rustan S.Si., dan Qadriyanti Febri S.Si., yang selalu memberikan semangat dan bantuan kepada penulis selama mengenal dunia perkuliahan.
8. Sepupu tersayang Yustin Maelina, Yustin Maelani, Nur Alamsyah, dan Fadil Mohammad yang sealalu berbagi canda, tawa, dan selalu memberikan semangat serta dukungan kepada penulis.
9. Teman KKN Desa Pa’jukukang, Kabupaten Bantaeng yang selalu menyemangati penulis.
10. Semua pihak yang tidak disebutkan namanya atas bantuan dan kerjasamanya kepada penulis selama menjalani penelitian.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, untuk itu saran dan kritik sangat penulis harapkan.Semoga karya ini memberikan manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi dan kepada masyarakat.
Makassar, Januari 2018
Penulis
ix ABSTRAK
Ketepeng cina (Cassia alata L.) mengandung alkaloid, antrakuinon, flavonoid, saponin, tannin, terpen dan steroid yang berpotensi dikembangkan menjadi suatu antimikroba terutama pada jamur dermatofit.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan memperoleh metabolit sekunder fungi endofit sebagai penghasil senyawa antimikroba dari daun ketepeng cina (Cassia alata L.). Pada tahap awal dilakukan isolasi fungi endofit dari daun ketepeng cina dengan teknik isolasi langsung pada medium PDA (Potato Dextrose Agar). Kemudian isolat yang diperoleh dari daun ketepeng cina (Cassia alata L.) dimurnikan. Fungi endofit yang diperoleh dari hasil pemurnian sebanyak dua isolat yaitu isolat KC-1 dan isolat KC-2. Produksi senyawa aktif dilakukan dengan fermentasi selama 11 hari pada medium PDB (Potato Dextrose Broth) dalam keadaan tergojok dengan kecepatan 150 rpm. Supernatan yang diperoleh diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat dengan perbandingan 1 : 1 (%v/v). Hasil ekstraksi tersebut diuji aktivitas antimikroba terhadap Staphylococcus aureus, Malessezia furfur dan Candida albicans dengan metode difusi agar.
Hasil menunjukkan bahwa isolat fungi endofit KC-1 tidak memberikan zona hambatan pada semua mikroba uji sedangkan pada isolat KC-2 memberikan zona hambatan terhadap Candida albicans dengan diameter zona hambat sebesar 10,85 mm.
Kata kunci : ketepeng cina (Cassia alata L.), antimikroba, Candida albicans
x ABSTRACT
Cassia alata L., contains alkaloids, anthraquinones, flavonoids, saponins, tannins, terpenes and steroids, potentially as antimicrobial especially in dermatophyte fungi. This study aimed to isolate and to obtain secondary metabolites of endophytic fungi as producers of antimicrobial compounds from leaves Cassia alata L., Isolationendophytic fungi from cassia alata leaves was conducted with direct isolation technique into PDA (Potato Dextrose Agar). Furthermore, isolates obtaining from leaves Cassia alata L., were purification.Fungi endophytes obtained from the purification of two isolates were KC-1 isolate and KC-2 isolate. Production of active compounds conducted with fermentation for 11 days using PDB (Potato Dextrose Broth) with the intensity of 150 rpm. Supernatant was extracted using ethyl acetate with the ratio 1 : 1 (%v/v). The result of extraction was tested for its antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, Malessezia furfurand,Candida albicans using well diffusion method. The result showed that isolate of endophytic fungi KC-1 didn’t show inhibition zone to all the microbial test while the isolate KC-2 showed the inhibition zone in Candida albicans with the diameter of inhibition was 10.85 mm.
Keywords: Cassia alata L., Antimicrobial, Candida albicans
xi DAFTAR ISI
Halaman
UCAPAN TERIMA KASIH... vi
ABSTRAK ... ix
ABSTRACT... x
DAFTAR ISI ... xi
DAFTAR GAMBAR ... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ... xv
BAB I PENDAHULUAN... 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 4
II.1 Uraian Tanaman ... 4
II.1.1 Klasifikasi Tanaman ... 4
II.1.2 Morfologi Tanaman ... 4
II.2 Fungi Endofit... 5
II.3 Antimikroba ... 7
II.4 Metode Isolasi... 9
II.5 Uji aktifitas antimikroba ... 11
II.6 Produksi Metabolit Sekunder ... 13
II.7 Mikroba Uji ... 19
II.7.1Staphylococcus aureus... 19
II.7.2Malassezia furfur... 20
II.7.2Candida albicans... 21
BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN ... 22
xii
III.1 Penyiapan Alat dan Bahan... 22
III.2 Metode Kerja ... 22
III.2.1 Pengambilan Sampel ... 22
III.2.2 Sterilisasi Alat dan Bahan ... 22
III.2.3 Pembuatan Medium ... 23
III.2.3.1 Pembuatan Medium PDA (Potato Dextrose Agar)... 23
III.2.3.2 Pembuatan Medium PDY (Potato Dextrose Broth)... 23
III.2.3.3 Pembuatan MediumNutrient Agar (NA)... 23
III.2.4 Isolasi Sampel... 23
III.2.5 Pemurnian Fungi Endofit... 24
III.2.6 Pengujian Antagonis ... 25
III.2.7 Produksi Metabolit Sekunder ... 25
III.2.8 Ekstraksi Isolat ... 26
III.2.9 Uji Aktivitas Terhadap Mikroba Uji ... 26
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 27
IV.1 Isolasi Fungi Endofit... 27
IV.2 Uji Antagonis Fungi Endofit... 28
IV.3 Fermentasi Fungi Endofit... 29
IV.4 Ekstraksi Metabolit Sekunder Fungi Endofit... 30
IV.5 Hasil Uji Aktifitas Antimikroba... 31
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.. ... 33
V.1 Kesimpulan... 33
V.2 Saran ... 33
xiii
DAFTAR PUSTAKA... 34 LAMPIRAN... 37
xiv
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Koloni murni fungi endofit Daun Ketepeng Cina pada
Inkubasi hari keempat... 28 2. Hasil Pengujian antagonis antimikroba... 29 3. Zona hambat ekstrak fungi endofit terhadapCandida ablicans... 32 4. Sampel Daun Ketepeng Cina (Cassia alata L.) ... 39 5. Pertumbuhan fungi endofit Daun Ketepeng Cina
(Cassia alata L.) ... 39 6. Pertumbuhan fungi endofit Daun Ketepeng Cina
(Cassia alata L.) tanpa sterilisasi permukaan... 40 7. Kontrol Medium ... 40
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Skema isolasi fungi endofit ... 37 2. Komposisi medium ... 38 3. Dokumentasi isolasi fungi endofit Daun Ketepeng Cina
(Cassia alata L.) ... 39
1 BAB I PENDAHULUAN
Penyakit infeksi adalah penyakit yang disebabkan oleh mikroba patogen dan bersifat sangat dinamis. Salah satu penyebab angka kematian di Indonesia maupun di dunia yaitu penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri, virus, jamur dan parasit. Pencegahan dan penanganan infeksi dapat dilakukan dengan penggunaan antibiotik (1).
Dalam beberapa kasus, penggunaan antibiotik sebagai agen antimikroba tidak lagi berguna karena resistensi terhadap mikroba.
Sehingga diperlukan adanya penemuan senyawa-senyawa baru untuk meminimalkan penyebaran mikroba resisten dalam pengendalian infeksi yang tepat. Salah satu sumber penting senyawa bioaktif alami dengan potensi besar dalam penggunaan obat yaitu fungi endofit dari tanaman yang memiliki aktivitas antimikroba (2,3,4).
Fungi endofit adalah mikroorganisme fungi yang menghabiskan seluruh atau sebagian siklus hidupnya menetap pada intraseluler jaringan tanaman inangnya. Fungi endofit dapat memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya. Apabila fungi endofit yang diisolasi dari satu tanaman obat dapat menghasilkan alkaloid atau metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman aslinya untuk diambil sebagai simplisia yang kemungkinan besar memerlukan waktu puluhan tahun untuk dipanen (5,6,7).
2
Salah satu tumbuhan yang digunakan sebagai sumber obat tradisional adalah tumbuhan ketepeng cina (Cassia alata L.). Ketepeng Cina (Cassia alata L.) umumnya dikenal sebagai ‘dadmari’ / ‘candlebrush’
memiliki nilai obat yang sangat tinggi seperti kemampuan antimikroba terutama pada jamur dermatofit. Ekstrak daun ketepeng cina (Cassia alata L.) mengandung alkaloid, antrakuinon, flavonoid, saponin, tannin, terpen dan steroid. Selama ini masyarakat memanfaatkan daun ketepeng cina (Cassia alata L.) sebagai obat untuk jamur, kurap, panu, kutu air, dan lain- lain. Secara ilmiah, hal ini disebabkan karena adanya kandungan zat kimia yang terdapat di dalam tumbuhan tersebut yang bersifat antimicrobial. (8,9).
Menurut Rahman (2010) mengemukakan bahwa komponen senyawa flavonoid yang diisolasi dari daun ketepeng cina (Cassia alata L.) menunjukan adanya aktivitas anti fungi terhadap Trichophyton schoenleinii,Trichophyton longifurus dan Candida albicans. Hal ini juga didukung oleh penelitian yang dilakukan oleh Chatterjee dkk (2012) bahwa ketepeng cina (Cassia alata L.) efektif sebagai agen antimikroba yang memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi spektrum luas. Sementara dalam penelitian Faruq dkk (2010) yang meneliti aktivitas antibakteri dari senyawa aktif daun ketepeng cina (Cassia alata L.) mengemukakan ekstrak metanol daun ketepeng cina (Cassia alata L.) menunjukkan aktivitas antibakteri terhadapStaphylococcus aureus (10,11,12).
Berdasarkan uraian di atas, permasalahan yang timbul adalah apakah dapat mengisolasi dan memperoleh metabolit sekunder fungi
3
endofit sebagai penghasil senyawa antimikroba dari daun ketepeng cina (Cassia alata L.). Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan isolat fungi endofit dari daun ketepeng cina (Cassia alata L.) sebagai penghasil senyawa antimikroba.
4 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Uraian Tanaman II.1.1 Klasifikasi Tanaman
Regnum : Plantae
Divisio : Spermatophyta Sub divisio : Angiospermae Classic : Dicotyledoneae
Subclassic : Choripetalae Dialypetalae
Ordo : Rosales
Family : Caesalpiniaceae
Genus :Cassia
Species :Cassia alata L.
II.1.2 Morfologi Tanaman
Tanaman semak, dengan tinggi mencapai 2-5 meter.Batang berkayu, berbentuk bulat, simpodial, berwarna cokelat kotor. Daun majemuk,menyirip genap, anak daun berjumlah antara 8 hingga 24 pasang.
Bentuk daun bulat panjang dengan ujung tumpul.Tepi daun rata, dan pangkal daun membulat.Panjang daun antara 3,5 - 15 cm, dan lebar 2,5 – 9 cm. panjang tangkai daun 2 – 3 cm. Pertulangan daun menyirip, tangkai pendek dan warna daun hijau. Bunga majemuk, biseksual, zygomorf, berbentuk tandan. Kelopak bunga berbagi lima, helaian kelopak bunga (sepala) berbentuk lonjong 10 – 20 mm x 6 – 7 mm, kelopak berbentuk bulat
5
telur-bundar, 16 – 24 mm x 10 – 15 mm berwarna kuning terang, benangsari berjumlah tiga dan berwarna kuning. Daun pelindung pendek, berwarna jingga.Mahkota bunga berbentuk kupu-kupu, berwarna kuning. Buah polong, panjang dapat mencapai 18 cm dan lebar ± 2,5 cm. Pada saat masih muda berwarna hijau, namun pada saat sudah tua warnanya menjadi hitam kecoklatan. Biji segi tiga lancip, dan pipih.Pada saat masih muda berwarna hijau, dan setelah tua menjadi hitam.Akar tunggang, bercabang, berbentuk bulat dan berwarna kehitaman.
II.2 Fungi Endofit
Fungi endofit merupakan mikroorganisme yang hidup dalam jaringan tanaman dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan tanaman inangnya. Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba, salah satunya fungi endofit yang mampu menghasilkan senyawa bioaktif atau metabolit sekunder sebagai akibat transfer genetik dari tanaman inangnya ke dalam fungi endofit (13).
Fungi endofit dapat memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya, merupakan peluang untuk memproduksi metabolit sekunder dari tanaman inangnya tersebut. Apabila jamur endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat dapat menghasilkan alkaloid atau metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman aslinya
6
untuk diambil sebagai simplisia untuk diambil sebagai simplisia yang kemungkinan besar memerlukan waktu puluhan tahun untuk dipanen (7).
Produk metabolit sekunder pada tumbuhan dapat dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu metabolit primer dan metabolit sekunder.Senyawa yang tergolong metabolit primer adalah polisakarida, protein, lemak dan asam nukleat. Metabolit primer merupakan senyawa- senyawa utama penyusun tanaman (mahluk hidup) yang diperlukan untuk proses pertumbuhan dan perkembangan (7).
Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman pada umumnya mempengaruhi efek fisiologis tanaman. Efek fisiologikal metabolit sekunder digunakan dalam pengobatan penyakit yang diderita oleh manusia, hewan maupun tanaman sendiri.Dengan adanya penemuan tersebut banyak usaha dilakukan untuk mengetahui dan mendapatkan senyawa kimia alami yang paling aktif sebagai senayawa obat dengan berbagai teknik pemisahan dan karakteristik spektral untuk mengetahui struktur kimia yang benar (14).
Menurut Mursyidi (1990) dalam Purwanti (2007), menjelaskan ciri- ciri metabolit sekunder antara lain:
1. Struktur kimianya beragam 2. Penyebabnya relatif terbatas
3. Pembentukannya dipengaruhi oleh enzim dan bahan genetik tertentu
4. Proses biosintesisnya dipengaruhi oleh sejumlah dan aktifitas enzim
7
Penyebaran masing-masing metabolit sekunder pada umunya terbatas semakin panjang rangkaian reaksi yang diperlukan, semakin terbatas penyebarannya. Sehingga menyebabkan terbatasnya ketersediaan dan jenis enzim dalam suatu organisme (14).
Fungi endofit yang diisolasi dari tumbuhan obat akan memiliki aktivitas yang lebih besar, bahkan dapat meiliki aktivitas yang lebih besar dibandingkan aktivitas tumbuhan inangnya. Dilihat dari segi efisiensi, hal ini sangat menguntungkan, karena siklus hidup mikroba endofit lebih singkat dibandingkan siklus hidup tumbuhan inangnya, sehingga dapat menghemat waktu yang dibutuhkan untuk mendapatkan senyawa tersebut, dan jumlah senyawa yang diproduksi dapat dibuat dalam skala yang besar dengan menggunakan proses fermentasi (15).
II.3. Antimikroba
Antimikroba adalah bahan-bahan atau obat-obat yang digunakan untuk memberantas infeksi mikroba pada manusia.Obat-obat yang digunakan untuk membasmi mikroorganisme yang menyebabkan infeksi pada manusia, hewan atau tumbuhan harus bersifat toksisitas selektif artinya obat atau zat tersebut harus bersifat sangat toksik terhadap mikroorganisme penyebab penyakit tetapi relatif tidak toksik terhadap jasad atau hospes. Antimikroba dapat bersifat (16).
a. Bakteriostatika, yaitu zat atau bahan yang dapat menghambat atau menghentikan pertumbuhan mikroorganisme. Dalam keadaan
8
seperti ini jumlah mikroorganisme menjadi stasioner, tidak dapat lagi multiplikasi dan berkembang biak.
b. Bakteriosida adalah bahan yang dapat membunuh mikroorganisme.
Dalam hal ini jumlah mikroorganisme akan berkurang, atau bahkan habis, tidak dapat lagi melakukan multiplikasi dan berkembang biak.
Antimikroba mempunyai lima mekanisme kerja utama, antara lain adalah (17)
a. Antimikroba yang menghambat sintesis dinding sel
Antimikroba ini adlaah antibiotik yang merusak lapisan peptidoglikan yang menyusun dinding sel bakteri Gram positif maupun Gram negatif, contohnya penisilin.
b. Antimikroba yang merusak membran plasma.
Membran plasma bersifat semipermeabl dan mengendalikan transport berbagai metabolit ke dalam dan keluar sel. Adanya gangguan atau kerusakan struktur pada membran plasma dapat menghambat atau merusak kemampuan membran plasma sebagai penghalang osmosis dan mengganggu sejumlah proses biosintesis yang diperlukan dalam membran. Antimikroba yang bersifat merusak membran plasma umum terdapat pada antimikroba golongan polipeptida yang mengubah permeabilitas membran plasma sel bakteri. Contohnya adalah polimiksin B yang melekat pada fosfolipid membran.
9
c. Antimikroba yang menghambat sintesis protein.
Antimikroba ini bekerja dengan berikatan pada subunit tertentu ribosom (Subunit 30S atau 50S) dan menghambat translokasi peptidil- tRNA, sehingga menyebabkan kesalahan pembacaan mRNA dan mengakibatkan bakteri tidak mampu mensintesis protein vital untuk pertumbuhannya. Contohnya adalah antibiotik golongan aminoglikosida.
d. Antimikroba yang dapat menghambat sintesis asam nukleat (DNA/RNA)
Penghambatan pada asam nukleat berupa penghambatan terhadap transkripsi dan replikasi mikroorganisme. Yang termasuk dalam antibiotik golongan ini adalah golongan kuinolon dan rifampisin.
e. Antimikroba yang menghambat sintesis metabolit esensial.
Penghambatan terhadap sintesis metabolit esensial antara lain dengan competitor berupa antimetabolit, yaitu substansi yang secara kompetitif menghambat metabolit mikroorganisme, karena memiliki struktur yang mirip dengan substrat normal bagi enzim metabolism.
Contohnya adalah sulfanilamide danpara amino benzoic acid (PABA).
II.4 Metode Isolasi
Ada beberapa metode isolasi yang dapat diterapkan dalam mengisolasi fungi tetapi yang umum digunakan adalah dengan sterilisasi permukaan. Isolasi fungi dapat dilakukan dari jaringan tanaman, daun atau dari buah. Umumnya dilakukan dengan cara meletakkan sedikit jaringan
10
sampel secara langsung di atas permukaan medium agar pada cawan petri maupun pada agar miring. Terlebih dahulu dilakukan sterilisasi permukaan dengan tujuan menghindari adanya kontaminan pada permukaan sampel.Sterilisasi permukaan dapat dilakukan menggunakan etanol 95%
selama beberapa detik dan kemudian dihilangkan dengan membilas menggunakan air steril (19).
Teknik yang dapat dilakukan untuk memperoleh mikroorganisme sebagai biakan murni ada dua cara, yaitu metode goresan (steak plate method) dan metode tuang (pour plate method) (16).
a. Metode goresan (Steak plate method)
Metode ini dikerjakan dengan cara menyiapkan medium agar steril, kemudian dituang ke dalam cawan petri steril (kurang lebih 15-20 ml) dan dibiarkan sampai memadat. Setelah memadat digoreskan biakan bakteri dengan menggunakan ose pada permukaan medium agar. Cara penggoresan ada beberapa cara dan bertujuan untuk memperoleh pertumbuhan mikroorganisme secara terpisah-pisah.
b. Metode tuang (Pour plate method)
Metode ini dilakukan dengan cara menginokulasikan mikroorganisme uji yang dilakukan pengenceran sesuai dengan derajat kontaminasi bahan ke dalam tabung uji yang mengandung medium. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam cawan petri steril dan dihomogenkan serta dibiarkan memadat.
11
II.5 Uji aktfitas antimikroba
Uji aktifitas antimikroba bertujuan untuk menentukan potensi dan control kualitas selama proses produksi senyawa antimikroba. Terdapat bermacam-macam metode uji antimikroba, antara lain adalah sebagai berikut (17):
1. Metode difusi
a. Metode disc diffusion (Tes Kirby & Bauer) yang digunakan untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut.
Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar.
b. E-test yang digunakan untuk mengestimasi MIC (Minimum inhibitory concentration), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme.
c. Ditch Plate technique dilakukan dengan menempatkan sampel uji agen antimikroba pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji (Maksimal 6 macam) digoreskan kea rah parit yang berisi antimikroba.
12
d. Cup plate technique merupakan metode yang serupa dengan disc diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji.
e. Gradient plate technique merupakan metode dimana konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoritis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua kemudian dituang di atasnya. Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba uji (Maksimal 6 macam) digoreskan pada arah mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah.
2. Metode dilusi
a. Metode dilusi cair (Broth dilution test).
Metode ini mengukur MIC (Minimum Inhibitory Concentration) dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengnceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai MIC. Larutan yang ditetapkan sebagai MIC kemudian dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan
13
diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai MBC.
b. Metode dilusi padat
Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat.Keuntungan metode ini satu konsentrasi antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.
3. Uji aktivitas antifungi
Pada uji aktivitas antifung, kebutuhan media yang digunakan berbeda dengan uji menggunakan bakteri.Media yang umum digunakan adalah Sabouraud Dextrose Luquid/Solid, dan media khusus fungi lainnya.Uji ini serupa untuk uji untuk bakteri, dimana spora fungi atau miselium fungi dilarutkan pada larutan agen antimikroba uji, dan selanjutnya pada interval waktu tertentu disubkultur pada media yang sesuai.
II.6 Produksi Metabolit Sekunder
Sistem fermentasi dapat dilakukan dengan 3 macam, yaitu : 1. Sistem Batch
Sistem ini adalah system yang paling sederhana dan sering digunakan di laboratorium untuk mendapatkan produk sel atau metabolitnya. Fermentasi sistem batch adalah system tertutup, artinya semua nutrisi yang dibutuhkan mikroba selama pertumbuhan dan pembentukan produk berada di dalam 1 fermentator. Jadi tidak ada penambahan bahan atau pengambilan hasil selama fermentasi berlangsung. Keuntungan sistem ini adalah mudah, sederhana, dan
14
kecil kemungkinan adanya kontaminan, sedangkan kerugiannya adalah kultur mikroba yang menua, yaitu tidak ada perbaruan pertumbuhan mikroba, pembentukan metabolit toksik yang bercampur dengan produk, konsetrasi substrat terbatas, dan sukar untuk diaplikasikan dalam skala besar.
2. SystemFed-Batch
System ini tidak tertutup seperti halnya sistem batch. Selama fermentasi, substrat, nutrisi, atau induser dapat ditambahkan ke dalam fermentor. Sistem fed-batch dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu sistem volume tetap dan sistem volume berubah. Sistem volume tetap berarti setiap ada penambahan medium baru ke dalam media fermentor, ada medium lama, produk, atau sel yang dikeluarkan sebanyak medium baru yang dimasukka fermentor; sedangkan sistem volume berubah, berarti ke dalam fermentor ditambahkan medium baru tetapi tidak ada medium lama atau produk yang dikeluarkan dari dalam fermentor. Keuntungan sistem ini adalah mudah dalam pengontrolan konsentrasi medium/substrat, pertumbuhan mikroba dapat dioptimalkan dan tingkat kebutuhan oksigen dapat dikontrol, sedangkan kerugiannya adalah membutuhkan pengetahuan tentang profil pertumbuhan mikroba, kontrol lebih ketat, dan membutuhkan peralatan dan operator yang lebih terlatih.
15
3. SistemContinous
Sistem fermentasi ini biasanya digunakan dalam skala industri.
Sistem continous adalah sistem batch yang fase eksponensialnya diperpanjang, dengan tetap menjaga fluktuasi nutrisi dan jumlah sel/biomassa. Mikroba diberi nutrisi/medium segar, sementara itu sejumlah sel atau medium dikeluarkan dari system dengan kecepatan yang sama. Hal ini menjamin tingkat kestabilan dari faktor-faktor seperti volume kultur, biomassa, konsetrasi produk dan substrat, pH, suhu dan oksigen terlarut. Keuntungan sistem ini adalah mempunyai produktivitas dan kecepatan pertumbuhan dapat dioptimalkan, proses dalam waktu lama dapat dijalankan, dapat digunakan model sel amobil, serta factor fisis dan lingkungan mudah dianalisis; sedangkan kerugiannya adalah tidak sesuai dengan kaidah Good Manufacturing Practice sehingga dilarang digunakan untuk memproduksi produk farmasi, resiko kontaminasi yang besar, produk yang belum optimal terbentuk, dan mudah timbul perubahan/evolusi pada mikroba (20).
Ada beberapa metode yang dapat digunakan dalam proses fermentasi mikroorganisme antara lain :
1. Kultur Permukaan (surface culture)
Pada metode ini, medium diinokulasikan spora atau miselium fungi. Miselium akan tumbuh diseluruh permukaan medium cair membentuk suatu koloni bervariasi. Ini merupakan metode yang paling mudah dan murah, akan tetapi memiliki beberapa kerugian yaitu
16
pertumbuhan yang tidak homogen dimana koloni terdiri dari beberapa miselium yang berbeda pertumbuhannya dan lingkungan tumbuhnya dimana miselium yang berada diatas permukaan koloni berada dalam kondisi yang lebih aerobic dibandingkan yang dibawah permukaan koloni, hal ini berkebalikan pada keadaan kontak dengan medium.
2. Kultur dengan pengocokan (shake culture)
Pada metode ini medium dikocok setelah diinokulasikan spora atau miselium sehingga pertumbuhan akan tampak pada seluruh medium. Kelebihan metode ini dibandingkan dengan metode kultur permukaan yaitu pemanfaatan medium oleh mikroorganisem lebih efisien, mempercepat pertumbuhan dan pertumbuhannya lebih homogen.
3. Kultur dengan pengocokan, mengalirkan udara (Stirred Aerate Culture) Metode ini merupakan pengembangan dari metode kultur dengan pengocokan, menggunakan pengaduk medium dan jalur udara atau oksigen. Dikarenakan efisiensi pengocokan dan aerasi produksi dapat meningkat pesat dan ini merupakan metode yang paling efisien untuk memproduksi metabolit fungi dalam skala besar.
4. Kultur Berkelanjutan (continuous culture)
Metode ini dilakukan dengan cara berkala mengganti medium pada fermentor dengan medium fermentasi yang baru, hal ini akan meyebabkan proses fermentasi akan terus belangsung. Metode ini akan sangat bermanfaat untuk penelitian laboratorium fermentasi,
17
Karena dengan menjaga ketersediaan medium baru kita dapat menjaga fermentasi pada tahapan yang diinginkan sementara efek yang lain dipelajari (22)
Pada proses fermentasi terdapat beberapa factor yang berpengaruh pada metabolit sekunder yang diperoleh yaitu :
1. pH
Selama fermentasi berlangsung, pada umumnya pH ini dapat mengganggu pertumbuhan sel dan produksi metabolit. Oleh Karena itu selama fermentasi berlangsung pH harus tetap dipertahankan pada pH optimum. Untuk itu, dapat dilakukan dengan penambahan buffer yang tidak dapat dirombak oleh mikroorganisme atau dengan larutan asam atau basa dari luar, jika pH berubah, hal ini dapat dilakukan secara manual atau dengan cara otomatis.
2. Medium
Medium harus dapat menyediakan seluruh kebutuhan nutrisi mikroorganisme. Kebutuhan tersebut meliputi senyawa sumber karbon, nitrogen, mineral, vitamin dan air. Mineral dapat dibuat dari senyawa sintesis yang menyediakan nutrient-nutrien. Senyawa sintesis ini relatif murni dan strukturnya sehingga konsentrasi di dalam medium diketahui pasti. Kelebihan lainnya adalah konsentrasi di dalam medium mudah ditambah dan dikurangi, serta tidak berbuih.Kekurangannya adalah cukup mahal.
18
3. Suhu
Suhu dibutuhkan dalam proses fermentasi dimana pertumbuhan sel atau produksi metabolit yang tertinggi. Berdasarkan suhu tersebut, pada umumnya mikroorganisme yang digunakan adalah mikroorganisme yang bersifat mesofil dengan suhu 20-45ºC dan kadang-kadang yang bersifat termofil dengan suhu optimum 45ºC.
4. Nutrien
Mikroorganisme membutuhkan senyawa senyawa sumber energi yang diperoleh dari perombakan senyawa organik maupun anorganik.
Senyawa yang mengandung nitrogen dibutuhkan terutama untuk pembentukan sel dan metabolit-metabolit yang mengandung nitrogen.
Jenis senyawa nitrogen ini dapat mempengaruhi proses fermentasi misalnya produksi antibiotika dapat dihambat oleh sumber nitrogen yang cepat dicerna.
5. Agitasi
Agitasi bertujuan untuk menghomogenkan penyebaran mikroorgnisme, nutrient dan oksigen di dalam medium. Kecepatan putaran agitasi di antaranya ditentukan oleh volume fermentor.
6. Aerasi
Fermentasi yang bersifat aerobik memerlukan system aerasi untuk mensuplai kebutuhan oksigen. Laju aerasi fermentasi berkisar 0,25 – 1,0 volume udara (volume medium/menit)
19
7. Potensi Reduksi Oksigen
Potensi reduksi oksidasi (redoks) diukur dengan elektroda khusus.
Interpretasi hasil pengukuran harus mempertimbangkan kemungkinan potensial redoks mikroba yang tidak sama dengan kultur/medium (22).
II.7 Mikroba uji
II.7.1 Staphylococcus aureus a. Klasifikasi
Kerajaan : Protophyta Kelas : Bacilli Bangsa : Bacillales
Suku : Stahylococcaceae Marga : Staphylococcus
Jenis :Staphylococcus aureus b. Sifat dan morfologi
Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram positif, sel-sel berbentuk bola, berdiameter 0,5 – 1,5 µm, terdapat tunggal dan berpasangan, dan secara khas membelah diri lebih dari satu bidang sehingga membentuk gerombol yang tidak teratur. Dinding sel mengandung dua komponen utama peptidoglikan dan asam trikholat. Metabolisme secara respiratif dan fermentative.Tumbuh lebih cepat dan lebih banyak dalam keadaan aerob.Suhu optimum 35-40oC terutama berasosiasi dengan kulit. Kisaran inangnya luas (23,24)
20
II.7.2 Malassezia furfur a. Klasifikasi
Kerajaan : Fungi
Divisio : Basidiomycota Kelas : Hymenomycetes Bangsa : Tremellales Suku : Filobasidiaceae Marga : Malassezia Jenis :Malassezia furfur b. Sifat dan morofologi
Malassezia furfur merupakan flora normal dan terdapat pada mukosa dan kulit. Jamur ini berupa kelompok sel-sel bulat, bertunas, berdinding tebal, dan hifanya berbatang pendek dan bengkok.
Malassezia furfur menghasilkan konidia sangat kecil pada hifanya (mikrokonidia), tetapi di samping itu juga menghasilkan makrokonidia besar, multiseptat, berbentuk gelendong yang jauh besar daripada mikrokonidianya (25).
21
II.7.3 Candida albicans a. Klasifikasi
Kerajaan : Fungi Divisio : Tallophyta Kelas : Deuteromycetes Bangsa : Mornillales
Suku : Cryptococcaceae Marga : Candida
Jenis :Candida albicans b. Sifat dan morfologi
Bentuk Candida albicans yaitu bulat, lonjong atau bulat lonjong, ukuran 2-5 µm x 3-6 µ, dengan permukaan halus, licin atau berlipat- lipat, berwarna putih kekuningan atau berbau ragi. Memiliki dua jenis morofologi yaitu khamir dan hifa (23).
22 BAB III
PELAKSANAAN PENELITIAN
III.1 Penyiapan Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah autoklaf, bunsen, cawan petri, corong, deg glas, enkas, Erlenmeyer, gelas ukur, gunting, inkubator, jarum ose, Laminar Air Flow (LAF), lampu UV, mikroskop, objek glass, oven, pinset, tabung reaksi, dll.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 75%, aquades steril, etil asetat, larutan natrium hipoklorit, medium PDA (Potato Dextrose Agar), medium PDB (Potato Dextrose Broth), metanol, sampel daun Ketepeng cina (Cassia alata L.) dll.
III.2 Metode Kerja
III.2.1 Pengambilan Sampel
Sampel penelitian yang digunakan berupa daun Ketepeng cina (Cassia alata L.) yang diperoleh dari daerah Tamalanrea kota Makassar.
Sampel tersebut kemudian disortasi dan dicuci dengan air mengalir kemudian dimasukkan ke dalam plastik dan dibawa ke laboratorium.
III.2.2 Sterilisasi Alat dan Bahan
Dilakukan sterilisasi alat dan bahan dimana alat gelas yang memiliki skala disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 1210C dengan tekanan 15 psi (per square inchi) selama 15 menit, sementara alat-alat besi dan alat gelas yang tidak berskala disterilkan di dalam oven selama 2 jam pada suhu 1700C.
23
III.2.3 Pembuatan Medium
III.2.3.1 Pembuatan Medium PDA (Potato Dextrose Agar)
Medium PDA anhidrat ditimbang sebanyak 7,8 gram lalu dilarutkan dalam 200 ml aquades dan dipanaskan. Selanjutnya, medium yang sudah jadi disterilkan di autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit (13).
III.2.3.2 Pembuatan Medium PDY (Potato Dextrose Broth)
Medium PDB ditimbang sebanyak 26,5 gram dan medium ekstrak yeast ditimbang sebanyak 4 gram kemudian dilarutkan dalam 1000 ml air suling dan dipanaskan. Selanjutnya, medium yang sudah jadi disterilkan di autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit (13).
III.2.3.3 Pembuatan Medium Nutrien Agar (NA)
Medium NA ditimbang sebanyak 23 gram kemudian dilarutkan hingga 1000 ml dengan air suling. Selanjutnya medium yang sudah jadi disterilkan dalam autoklaf pada 1210c selama 15 menit (13).
III.2.4 Isolasi Sampel
Sampel penelitian yang digunakan berupa sampel daun Ketepeng cina (Cassia alata L.) terlebih dahulu sampel di cuci bersih dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang masih melekat pada sampel, kemudian disterilisasi permukaan dengan cara didesinfeksi dengan alkohol 70% (1 menit), larutan natrium hipoklorit 1% (2 menit), kemudian dicelupkan kembali dalam alkohol 70% (30 detik) dan dibilas dengan air steril masing- masing selama 1 menit. Lakukan secara aseptis di dalamLaminar Air Flow (LAF) kabinet. Tiriskan sampel tersebut dalam cawan petri steril.
24
Sampel daun Ketepeng cina (Cassia alata L.), yang diberi perlakuan sterilisasi permukaan dan tanpa sterilisasi permukaan diisolasi menggunakan medium PDA.
1. Pertama-tama sampel tersebut dipotong-potong dengan pisau scalpel steril menjadi ukuran ±1 cm.
2. Ditanam bagian-bagian tersebut dalam medium PDA + kloramfenikol 0,2 g/L di dalam cawan petri steril pada suhu ruangan selama 5-7 hari atau sampai ada pertumbuhan fungi endofit.
3. Setelah terjadi pertumbuhan fungi, segera isolasi untuk mendapatkan biakan murni.
4. Biakan murni fungi endofit ditumbuhkan pada medium PDA dalam cawan petri.
Sebagai kontrol, diinokulasikan air bilasan terakhir eksplan pada medium PDA + kloramfenikol 0,2 g/L. Kemudian untuk kontrol ruangan cawan petri yang berisi medium PDA dibiarkan terbuka selama proses pengerjaan (14).
III.2.5 Pemurnian Fungi Endofit
Medium yang digunakan untuk pemurnian fungi endofit yaitu medium PDA. Fungi endofit yang tumbuh pada medium PDA, dimurnikan masing- masing pada medium PDA baru. Kemudian diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruangan. Setiap koloni yang berbeda bentuk maupun warnanya disubkultur lagi pada medium PDA baru sampai diperoleh koloni murni.
25
Dilakukan pengamatan terhadap isolat dengan cara mikroskopis untuk mengetahui koloni murni (14).
III.2.6 Pengujian Antagonis
Identifikasi awal dari daun ketepeng cina (Cassia alata L.) yang menghasilkan senyawa antimikroba dilakukan dengan cara uji hayati sebagai berikut: semua isolat daun ketepeng cina (Cassia alata L.) ditumbuhkan ke dalam media PDA, kemudian isolat fungi endofit dimasukkan ke dalam cawan petri dengan menempelkan potongan medium yang ditumbuhi isolat fungi endofit pada permukaan medium yang berisi fungi uji kemudian diinkubasi selama 1 hari pada suhu 370C untuk NA dan 3 hari pada suhu 250C untuk PDA. Masing-masing isolat diamati kemampuan menghambatnya yang ditandai dengan terbentuknya zona bening disekitar cakram uji dan dievaluasi : >20 mm (strong inhibition), 5- 10 mm (moderate inhibition) and <5 mm (weak inhibition). Isolat yang stabil membentuk zona bening pada 3 kali pengujian dipilih sebagai isolat untuk pengujian selanjutnya (14).
III.2.7 Produksi Metabolit Sekunder
Diambil koloni murni yang tumbuh pada medium PDA, kemudian dimasukkan ke dalam medium PDY 200 ml dan digojok menggunakan shaker selama 1 jam pada suhu ruangan dan dilakukan berturut-turut selama 15 hari. Setelah itu, dipisahkan dengan cara disaring (15).
26
III.2.8 Ekstraksi Isolat
Setelah diperoleh hasil fermentasi yang terbaik, media pertumbuhan mikroba disaring untuk memisahkan biomassa dan cairan fermentasi.
Cairan fermentasi diekstraksi 3 kali dengan pelarut etil asetat (1:1 v/v) dalam corong pisah selama 20 menit. Ekstrak yang diperoleh diuapkan pelarutnya lalu disimpan pada deksikator untuk digunakan pada uji selanjutnya.
Biomassa diekstraksi untuk mendapatkan metabolit intraseluler menggunakan pelarut metanol secara sonikasi dengan frekuensi gelombang 20 kHz dan daya 60 watt selama 30 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit, bagian residu dibuang dan supernatannya diuapkan pelarutnya (14).
III.2.9 Uji Aktivitas terhadap Mikroba Uji
Dimasukkan dispersi mikroba uji ke dalam botol steril, lalu ditambahkan medium NA untuk bakteri uji dan PDA untuk fungi uji, dihomgenkan dan dituang di cawan petri, dibiarkan hingga memadat.
Ekstrak dimasukkan ke dalam kertas cakram. Setelah semua pelarut menguap selanjutnya kertas cakram diletakkan pada permukaan medium.
Diinkubasikan selama 1 hari pada suhu 370c untuk NA dan 3 hari pada suhu 250c untuk PDA, lalu diamati dan diukur zona hambatan yang terbentuk.
27 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Isolasi Fungi Endofit
Pada penelitian ini dilakukan isolasi fungi endofit dari daun ketepeng cina sebagai penghasil senyawa antimikroba. Hasil determinasi tanaman menyatakan bahwa ketepeng yang digunakan merupakan spesies Cassia alata L.
Fungi endofit yang tumbuh pada sekitar tanaman merupakan fungi endofit karena telah dilakukan sterilisasi sampel. Permukaan tanaman membawa banyak kontaminasi mikroba untuk menghindari kontaminasi ini tanaman harus disterilisasi permukaan secara keseluruhan sebelum diinokulasikan dalam media (26). Sterilisasi permukaan dilakukan dengan etanol 70% v/v selama 1 menit lalu dilakukan perendaman lagi dengan Na hipoklorit 5,3% selama 2 menit. Proses sterilisasi tidak digunakan etanol murni, tetapi digunakan etanol 70% karena proses denaturasi protein mikroba memerlukan keberadaan air, dan etanol dengan kadar 70% adalah kadar yang optimal untuk tujuan ini. Dalam larutan, natrium hipoklorit (NaOCl) akan melepaskan radikal klor (Cl) yang mampu merusak membran dan protein mikroba (27).
Fungi endofit yang diperoleh dari daun ketepeng cina tumbuh pada hari ke-3, dari hasil purifikasi diperoleh sebanyak dua isolat yaitu isolat KC- 1 dan isolat KC-2 pada gambar 1 berdasarkan ciri makroskopik meliputi warna, permukaan, dan bentuk koloni setelah inkubasi.
28
Gambar 1. Koloni murni Fungi Endofit daun ketepeng cina pada inkubasi hari keempat. KC1 = Isolat Ketepeng Cina 1, KC2= Isolat Ketepeng Cina 2 IV.2 Uji Antagonis Fungi Endofit
Hasil isolasi fungi endofit dari daun ketepeng cina diperoleh dua isolat fungi endofit. Selanjutnya dilakukan uji antagonis fungi endofit terhadap mikroba uji. Uji antagonis fungi endofit bertujuan untuk melihat dan mengetahui aktifitas atau kemampuan isolat fungi endofit dalam menghambat atau membunuh mikroorganisme lain (mikroorganisme pathogen). Hasil positif ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitaran isoalat fungi endofit. Dari hasil purifikasi fungi endofit yang telah diperoleh selanjutnya dilakukan uji antagonis fungi endofit terhadap mikroba uji. Isolat fungi endofit KC-1 tidak memberikan zona hambatan pada Staphylococcus aureus, Malessezia furfur dan Candida albicans sedangkan pada isolat KC-2 memberikan zona hambatan terhadap Candida albicans. Hal ini terlihat pada gambar 2bahwa disekitar isolat yang ditumbuhkan dalam media PDA yang mengandung Candiada albicans terlihat ada zona bening disekitar isolatnya.
KC1 KC2
29
A B
C
Gambar 2. Hasil pengujian antagonis antimikroba Keterangan : a=Candida Albicans, b =Staphylococcus aureus,
c=Malessezia furfur
IV.3 Fermentasi Fungi Endofit
Isolat fungi endofit yang aktif terhadap mikroba uji (isolate KC-2) kemudian diproduksi senyawa antimikroba menggunakan metode fermentasi yang dimulai dengan medium pembenihan PDY (Potato Dextrosa Broth dan Ekstrak Yeast) yang dikocok menggunakan shaker dengan kecepatan 15 rpm selama 3x24 jam (prekultur/starter), Tujuan pembuatan starter yaitu mempercepat fase lag yang selanjutnya starter difermentasikan ke dalam medium produksi yang diinkubasi selama 5 hari pada suhu 250C. Proses fermentasi dilakukan selama 11 hari. Fermentasi KC1
KC2
30
dengan penggojokan merupakan metode pemanfaatan medium oleh mikroorganisme yang hasilnya lebih efisien,mempercepat pertumbuhan, dan pertumbuhannya lebih homogen. Hasil fermentasi fungi endofit isolate KC-2 berwarna kuning yang tadinya berwarna putih. Perubahan yang terjadi karena adanya proses fermentasi yang dilakukan oleh isolat fungi dimana perubahan ini menunjukkan metabolit sekunder telah diproduksi. Sistem ini adalah sistem yang paling sederhana dan sering digunakan di laboratorium untuk mendapatkan produk sel atau metabolitnya. Fermentasi sistem batch adalah system tertutup, artinya semua nutrisi yang dibutuhkan mikroba selama pertumbuhan dan pembentukan produk berada di dalam satu fermentor. Jadi tidak ada penambahan bahan atau pengambilan hasil selama fermentasi berlangsung. Keuntungan system ini adalah mudah, sederhana, dan kecil kemungkinan adanya kontaminasi (20). Hasil fermentasi disentrifus terlebih dahulu untuk memisahkan filtrat dan residu, hal ini dilakukan karena mikroorganisme dapat mensekresikan metabolit sekunder selama proses fermentasi ke luar sel yang terdapat pada filtrat (28).
IV.4 Ekstraksi Metabolit Sekunder Fungi Endofit
Sebelum dilakukan uji aktivitas antimikroba terlebih dahulu dilakukan proses ekstraksi senyawa metabolit dengan tujuan untuk memecah sel sehingga senyawa metabolit berdifusi ke pelarut. Ekstraksi metabolit sekunder fungi endofit isolat KC-2 dilakukan pada media pertumbuahan mikroba disaring untuk memisahkan biomassa dan cairan fermentasi,
31
ekstraksi dilakukan setelah hari ke-11 fermentasi. Cairan fermentasi diekstraksi 2 kali dengan pelarut etil asetat (1:1 v/v) dalam corong pisah selama 20 menit. Ekstrak yang diperoleh yaitu sebanyak 0,36 g. Ekstrak yang diperoleh diuji aktifitas antimikroba terhadap mikroba uji dengan metode difusi agar sebanyak 20µL dengan menggunakan paper disk.
IV.5 Hasil Uji Aktifitas Antimikroba
Uji aktifitas antimikroba dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar. Metode difusi agar memiliki beberapa kelebihan yaitu sederhana untuk melihat sensitifitas berbagai jenis mikroba terhadap mikroba pada konsentrasi tertentu (28).
Mikroba uji yang digunakan yaitu Staphylococcus aureus, Malessezia furfur dan Candida albicans. Hasil uji aktifitas antimikroba yang dilakukan terhadap ekstrak etil asetat dari fungi KC-2 memperlihatkan aktifitas daya hambat terhadap Candida albicans. Hal ini diduga dipengaruhi oleh beberapa hal, seperti tingkat sensitifitas dari organisme uji, kecepatan difusi dari senyawa dan konsentrasi senyawa antimikroba (29).
Hasil pengukuran diameter dapat dilihat pada gambar 3 rata-rata zona hambat dari ekstrak etil asetat isolat fungi endofit KC-2 terhadap Candida albicans yaitu 10,85 mm. Pada uji aktifitas antimikroba ini digunakan konsentrasi 10% dari berat ekstrak yang diperoleh.
32
Gambar 3. Zona hambat ekstrak fungi endofit terhadapCandida albicans Keterangan: a = kontrol positif nistatin; b = ekstrak isolat; c = pelarut etil asetat
A B C
33 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
V.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
1. Isolasi fungi endofit dari daun ketepeng cina (Cassia alata L.) diperoleh 2 isolat fungi yang diberi kode KC-1 dan KC-2
2. Ekstrak fungi endofit isolate KC-2 menunjukkan aktivitas antifungi terhadapCandida albicans.
V.2 Saran
Perlu dilakukan isolasi fungi endofit dari beberapa bagian tumbuhan ketepeng cina sebagai penghasil antioksidan.
34
DAFTAR PUSTAKA
1. Olesen, AB. Chronic Skin Disease and Risk of Infection. The open Infectious Diseases Journal. 2012.6 hal. 60-64
2. Ryu S, dkk. Colonization and Infection of the Skin by S. aureus: Immune System Evasion and the Response to Cationic Antimicrobial Peptides.
International Journal of Molecular Sciences. 2014.
3. Saga T, dan Yamaguchi K, History of Antimikrobial Agents and Resistant Bacteria.Research and Revies. 2009. 52 (2) hal. 103-108.
4. Zhao, Jianglin., dkk. Antimicrobial Metabolites from the Endophytic Fungus Pichia guilliermondii Isolated from Paris polyphylla var.yunnanensis. Molecules Journal. 2010.
5. Selvi BK, dan Balagengatharathilagam P. Isolation and Screening of Endhophytic Fungi From Medicinal Plants of Virudhunagar District for Antimicrobial Activity. International Journal of Science and Nature.
2004. 5 (1) hal. 147-155
6. Siriwach R. Screening of Novel Secondary Metabolites from Enophytic Fungi by Chemical Library Analysis. Disertasi. Departemen of Biotechnology Osaka University. Jepang. 2013. Hal. 19
7. Radji, M. 2005. Peranan Bioteknoligi Dan Mikroba Endofit Dalam Pengembangan Obat Herbal. Laboratorium Mikrobilogi dan Bioteknologi. Vol. II. Departemen Farmasi, FMIPA-UI, kampus UI depok. 113-126. Departemen Farmasi, FMIPA-UI, Kampus UI Depok 16424 Majalah Ilmu Kefarmasian, No.3, Desember 2005, 113-126 8. Bahli M, Mutia R, Mustanir, Lukitaningsih E. Bioassay on n-Hexane
Extract of Leaves Cassia alata against Candida albicans. Jurnal natural. 2014. Vol. 14,No. 1 hal. 5-10
9. Bayuaji TS, Astuti IY, dan Dhiani BA. Aktivitas Antifungi Krim Daun Ketepeng Cina (Cassia alata L.) Terhadap Triptophyton mentagrophytes. 2012. 9 hal.57-64
10. Rahman MS, Ali MY, Ali MU.In Vitro Screening Of Two Flavonoid Compounds Isolated From Cassia alata L. Leaves For Fungicidal Activities.J.Bio-scl. 2008. 16 hal. 139-142
35
11. Chatterje S, Chatterjee S, dan Dutta S. Original An Interview on the Enthnophythological Studies ofCassia alata L- an Important Medicinal Plant and the Effect of VAM on its Growth and Productivity.
International Journalf Research in Botany. 2012. 2 (4) hal. 13-19 12. Faruq ZU, Rahman UA, Bello M, Obianke M, dan Atiku FA.
Antibacterial activity of the active component of Cassia alata (Linn) leaves. Nigerian Journal of Basic and Applied Science. 2010. 18 (1) hal. 97-100
13. Tan, R. X dan Zou, W. X. 2001. Endophytes: A Rich Source of Functional Metabolites. Institute of functional biomolecule, school of life sciences. Nanjing University, Nanjung.
14. Purwanti, E. 2007. Senyawa Bioaktif Tananam Sereh Ekstrak Kloroform dan Etanol serta Pengaruhnya terhadap Mikroorganisme Penyebab Diare. Laporan penelitian. http://publikasi.umm.ac.id . akses 19 Nobvember 2016
15. Prihatiningtias, W. 2008. Mikroba Endofit, Sumber Penghasil Antibiotic yang Potensial. Fakultas farmasi UGM
.
16. Djide N. 2013. Dasar-Dasar Mikrobiologi Farmasi. FAkultas Farmasi Universitas Hasanuddin.
17. Pratiwi S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Penerbit Erlangga: Jakarta.
18. Waluyo, 2004. Mikrobiologi umum. Universitas Muhammadiyah.
Malang Press. Malang.
19. Wolf, F. A., Wof, F.T. The Fungi. Hafner Publishing Company. New York. 1969. Pg 14-15
20. McNeil, B. and Harvey, L.M., Practical Fermentation Technology, 42, 70-90, 100-101, John Wiley & Son Ltd., England. 2008
21. Stainer R. Y. Dunia Mikrobiologi I. Bharata Karya Aksara, Jakarta.
1982
22. Djide, N., Sartini, dan Kadir S. 1997, Metode Instrumentasi Bioteknologi Farmasi, Laboratorium Mikrobiologi Farmasi, Jurusan Farmasi Fakultas MIPA, Universitas Hasanuddin, Makassar.
23. Pelczar. Jr. M. J. Dasar-dasar Mikrobiologi. R. S. Hadioetomo. UI- Press. Jakarta. 1988.
36
24. Holt, J. G.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriologi. [9thEd.]. The Williams & Wilkins Company. Baltimore. Maryland 21202 United States of America.1994
25. Inamandar AC, Paliit A. The Genus Malessezia and Human Diseases.India. Dermatol Venereol Leprol. 2003
26. Daud, NH. Jayaraman S. Mohamed R. An improved surface sterilization technique for introducing leaf, nodal and seed explants of Aquilaria malaccensis from field sources into tissue culture. Asia- Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology. Vol. 20 (2) : 55-58. 2012
27. Waluyo, L. Mikrobiologi Lingkungan. Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang. 2005
28. Mawaddah Rosliana. Kajian Hasil Riset Potensi Antimikroba Alami dan Aplikasinya dalam Bahan Pangan di Pusatinformasi Teknologi Pertanian Fateta IPB. Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor. 2008
37 Lampiran 1. Skema Isolasi Fungi Endofit
DaunKetepeng cina (Cassia alata L.)
Alkohol 70% (1 menit), natrium hipoklorit 1% (3 manit), alkohol 70% (1 menit), air steril (bilas 3 kali) dan dipotong-potong kecil
Daun hasil potongan
Medium PDA + kloramfenikol, 25° C (5-7 hari)
Isolat Fungi Endofit
Medium PDA baru 25° C (5-7 hari) Isolat Murni
- Medium PDB 200 ml, 25° C (15 hari)
- Uji antagonis Hasil fermentasi
Biomassa Supernatan
Ekstrak metanol
Etilasetat (1:1),
corongpisah metanol, sonikasi
20 kHz, 60 watt (30 menit)
dandisentrifugasi (15 menit)
Ekstrak etil asetat
Uji aktivitas antimikroba
38 Lampiran 2. Komposisi Medium
1. Medium Nutrient Agar (NA) Ekstrak beef 5 gram
Pepton 3 gram
NaCl 2,5 gram
Agar 15 gram
Aquadest ad 1000 ml
pH 7,4
2. Medium Potato Dextrosa Agar (PDA) Ekstrak Kentang 4 gram
D-Glukosa 20 gram
Agar 15 gram
Aquadest ad 1000 ml
pH 5,6 ± 0,2
3. Medium Potato Dextrosa Yeast (PDY)
Pepton 10 gram
Glukosa 40 gram
Agar 15 gram
Ekstrak Yeast 4 gram
Aquadest ad 1000 ml
pH 5,6 ± 0,2
39
Lampiran 3. Dokumentasi isolasi fungi endofit daun ketepeng cina (Cassia alata L.)
Gambar 4. Sampel daun Ketepeng Cina (Cassia alata L. )
Gambar 5. Pertumbuhan fungi endofit pada daun Ketepeng Cina (Cassia alata L.) Ket: TD= Tampak depan TB= TampakBelakang
TD
TB TD
40
Gambar 6. Pertumbuhan fungi endofit pada daun ketepeng cina tanpa sterilisasi permukaan
Gambar 7. Kontrol medium. Ket. A = medium ; B = Ruangan; C = Air Bilasan Terakhir
TD
TB
TD A
B
A B
C
