BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
TEORI DASAR BIOTEKNOLOGI
The Central Dogma of Molecular biology
Replikasi DNA:
adalah proses penggandaan pita DNA dengan menggunakan DNA tetua sebagai cetakan;
Proses ini berlangsung di dalam membran inti pada sel eukaryot.
Konservatif: dua pita spiral DNA tetap utuh dan tidak memisahkan diri, dan keseluruhan pita menjadi cetakan
langsung untuk membentuk pita baru.
Dispersif: dua pita spiral DNA
terputus-putus, dan pita baru
terbentuk saling bersambungan
membentuk pita baru yang utuh.
Metode yg dianggap benar:
Semi konservatif: dua pita spiral DNA
memisahkan diri, dan masing-masing pita menjadi cetakan untuk membentuk pita baru.
Menurut eksperimen Meselson dan Stahl (1958) (baca: Genetika, Suryo, hal 74-76) dengan menggunakan bakteri E. coli yang ditumbuhkan dalam media yang
mengandung 15N dan 14N, metode inilah
yang paling mungkin terjadi.
Proses replikasi DNA semi konservativ:
Diawali dengan ikatan hidrogen dari untaian spiral ganda dipotong oleh enzim endonuklease, sehingga terdapat bagian pita spiral ganda DNA yang terpisah jadi dua pita.
Masing-masing pita ini berfungsi sebagai cetakan untuk membuat pita turunannya.
Enzim DNA polimerase diaktifkan dan berfungsi menjadi katalisator untuk menarik basa-basa di sekitar pita DNA.
Enzim ini membuat pita DNA baru dengan cara memasang basa-basa sesuai dengan “pita DNA cetakannya arah 3’ ke 5’
hingga terbentuk “pita baru dengan arah 5’ ke 3’ (leading strand)
Untuk pita DNA cetakan arah 5’ ke 3’ juga dibuat pita turunannnya dengan proses yang terputus-putus (lagging strand), kemudian bagian pendek pita turunan DNA yang terputus-putus itu digabungkan oleh enzim ligase.
Transkripsi:
adalah proses sintesis RNA dengan menggunakan DNA sebagai cetakan.
Melibatkan enzim RNA polimerase.
Perangkat transkripsi:
1. satu utas DNA ekson sebagai cetakan, sedangkan utas DNA pasangannya hanya menjadi utas pendamping.
Urutan basa pada RNA akan merupakan antipararel (pasangan) dari urutan basa DNA cetakannya.
2. enzim RNA polimerase (enzim transkriptase). Pada E. coli (prokaryot) enzim ini terdiri dari beberapa subunit protein yaitu subunit holoenzim dan sub unit pendukung yang masing-masing tdd beberapa subunit dengan fungsi berbeda-beda (Tabel 1).
Pada eukaryot dikenal empat polimerase yaitu tiga RNA polimerase inti (I, II, dan III) dan satu RNA polimerase organel yang bertanggung jawab terhadap tranksripsi DNA mitokondria dan kloroplas.
3. Nukleotida/ Basa nitrogen A, U, C, G
Sebelum membahas proses transkripsi sebaiknya dikenali:
Promotor: merupakan sekuen basa/nukleotida dimana faktor
sigma mengenalinya sebagai awal proses transkripsi. Pada E. coli
promotor tdd 40 bp (base pair = pasang basa) dengan tiga titik
penting yaitu: kotak –35, kotak –10, dan titik awal transkripsi.
Promotor: Titik awal transkripsi, Kotak –35, Kotak –10,
Terminator
Titik awal transkripsi:
Merupakan basa pertama dari utas DNA yang ditranskripsikan ke dalam basa RNA.
Mulai dari titik ini ke arah hilir (ke arah ujung 3’/ ujung NH2 /ujung amino) diberi koordinat positif
Sebaliknya kearah hulu (ke arah
ujung 5’/ ujung P /ujung fosfat) diberi
koordinat negatif.
Kotak –35:
Sekuen nukleotida dg titik tengah kotak berada pada basa yang berjarak 35 basa ke arah hulu dari titik awal transkripsi.
Memiliki fungsi sebagai isyarat
penempelan untuk RNA polimerase pada DNA.
Memiliki rangkaian konsensus (mirip untuk seluruh organisme)
5’TGTTGAACA3’.
Kotak –10 /kotak Pribnow / tata box:
Urutan nukleotida dg titik tengah kotak pada basa yang berjarak 10 basa ke arah hulu dari titik awal transkripsi.
Tempat awal RNA polimerase menguraikan pilinan heliks ganda DNA. Kotak ini mempunyai rangkaian konsensus 5’TATAAT3’.
Tersusun dari rangkaian poliAT yang merupakan pasangan basa dengan ikatan hidrogen paling lemah, sehingga paling mudah dipisahkan.
Pada umumnya antara kotak –35 dengan kotak –10 dipisahkan oleh 16 sampai 18 pasang basa.
Terminator:
Rangkaian nukleotida DNA yang memberikan isyarat bagi
transkriptase untuk mengakhiri proses transkripsi.
Biasanya terdapat sekuen ulang balik yang dipisahkan oleh sejumlah
nukleotida DNA yang akan
mengakibatkan terbentuknya
struktur jepit rambut pada RNA-nya
Proses transkripsi:
(a) Inisiasi transkripsi:
Proses ini menentukan apakah suatu gen akan diekspresikan atau tidak, juga menentukan
benar/tidaknya hasil transkripsi.
Proses diawali dengan pengenalan promotor oleh faktor sigma, dilanjutkan dengan penempelan enzim inti pada promotor, dan pengudaran pilinan heliks ganda untuk memulai sintesis RNA.
Terdiri dari tiga tahapan:
(a) Inisiasi, (b) sintesis perpanjangan RNA, (c) akhir transkripsi.
(b) Sintesis Perpanjangan RNA:
Faktor sigma tidak diperlukan lagi dan akan terlepas dari holoenzim dan protein nusA
menggantikannya bergabung dengan inti transkriptase.
Protein nusA berperan dalam perpanjangan RNA dan mengenali terminator.
Dalam tahapan ini enzim RNA polimerase inti melakukan tiga jenis pekerjaan yaitu:
membuka pilinan heliks DNA,
sintesis RNA/penambahan ribonukleotida,
dan memulihkan kembali pilinan heliks DNA.
Terminator
dan proses akhir transkripsi:
Terdapat dua jenis terminator untuk mengakhiri proses
transkripsi:
terminator yang memerlukan faktor rho
terminator tanpa faktor rho.
Mengandung ruas ulang balik dari DNA saja dan tidak mengandung ruas poliAT sebagai penutupnya.
Jadi pada akhir transkripsi tidak akan ada pasangan poli AU pada situs hibrid DNA-RNA.
Setelah menemui struktur jepit rambut transkriptase akan mengakhiri transkripsi, tetapi DNA, RNA, dan enzim belum dapat terpisah.
Diperlukan jasa faktor rho yaitu protein yang merupakan subunit transkriptase yang berperan memisahkan DNA, RNA, dan enzim transkriptase.
Terminator yang memerlukan faktor rho
Disamping adanya ruas ulang balik dari DNA juga terdapat rangkaian poli AT pada DNA yang letaknya tepat sesudah sekuen ulang balik terakhir.
Jadi sesudah proses transkripsi diberi sinyal berhenti dengan adanya struktur jepit rambut RNA yang terbentuk, kemudian terbentuk
untaian poli AU dari RNA.
Seperti yang telah diutarakan bahwa pasangan poli AU merupakan pasangan yang lemah
sehingga hibrid DNA - RNA mudah lepas dan juga melepaskan enzim transkriptase.
Terminator tanpa faktor rho
Pascatranskripsi:
Proses ini banyak terjadi pada eukaryot, meliputi pemotongan, penambahan, dan modifikasi beberapa basa pada mRNA tepat sesudah transkripsi terjadi.
Pada prokaryot umumnya mekanisme pasca transkripsi tidak terjadi sebab sebelum mRNA lepas dari DNA
cetakannya, ribosom langsung menempel pada ujung- ujung mRNA untuk melakukan proses translasi
Transkrispsi berlangsung ditempat yang sama dengan
translasi.
Pada eukaryot proses transkripsi terpisah dengan proses translasi. Transkripsi terjadi dalam membran inti sedangkan translasi
berlangsung di sitoplasma.
Diantara proses transkripsi dan translasi inilah proses pascatranskripsi terjadi.
Dalam transkripsi eukaryot mula-mula disintesis pra-mRNA yang disebut dengan hnRNA
(heterogenous nuclear RNA), yang didalamnya
terdapat intron dan ekson. Intron akan dibuang
dalam proses pascatranslasi.
Proses pascatranskripsi meliputi 3 kegiatan:
1. Pemasangan tudung/topi pada ujung 5’.
Dilaksanakan tepat sesudah transkripsi, dilakukan oleh enzim guanili-transferase, dengan menambahkan gugus guanosin pada ujung 5’ trifosfat, yang dilanjutkan dengan penambahan gugus metil pada N7 dari nukleotida guanin yang ditambahkan.
2. Penambahan ekor poliadenil (poli A).
Pada ujung 3’-OH. Sekitar 200 nukleotida adenin yang
ditambahkan. Fungsi sebenarnya belum diketahui dengan pasti.
3. Pemenggalan intron.
Dilakukan hampir pada semua hnRNA. Dengan proses ini mRNA matang akan selalu lebih pendek dari pra-mRNA atau hnRNA.
TRANSLASI
Translasi adalah: penterjemahan urutan tiga nukleotida/basa-basa (kodon) mRNA menjadi runtutan asam amino polipeptida.
Penterjemahan masing-masing kodon dilakukan terhadap tiga nukleotida/tiga basa mRNA menjadi asam amino.
Pasca Translasi merupakan tahap akhir dari proses ekspresi gen
1. mRNA sebagai cetakan sintesis protein:
Setiap jenis kombinasi tiga basa yang
berdampingan pada mRNA mengandung sandi genetik (kodon) tertentu yang dapat
diterjemahkan menjadi asam amino.
Hanya ruas mRNA yang diapit oleh kodon awal dan kodon akhir yang disintesis proteinnya.
Perangkat translasi:
1. mRNA sebagai pola cetakan dalam sintesis protein.
2. tRNA sebagai pangangkut asam amino.
3. Ribosom: merupakan tempat berlangsungnya translasi.
Kodon awal umumnya adalah rangkaian tiga basa
AUG; sedangkan kodon akhir adalah UAA, UAG, dan UGA. Dibagian hulu dari kodon awal terdapat satu rangkaian nukleotida yang berfungsi sebagai tempat penempelan ribosom yang disebut dengan situs Shine Dalgarno.
Dalam satu mRNA prokaryot ditemukan lebih dari satu ruas penyandi protein (mRNA poligenik) diantara
sekuen promotor dan terminatornya sedangkan pada eukaryot hanya terdapat satu ruas penyandi protein diantara sekuen promotor dan terminatornya (mRNA monogenik).
2. tRNA sbg pangangkut aa:
tRNA berfungsi sebagai pengangkut asam amino ke dalam kompleks translasi serta membaca sandi (kodon-kodon) mRNA. Proses ini terjadi dengan bantuan enzim sintetase aminoasil-tRNA.
Untuk 20 jenis asam amino digunakan 31 jenis
tRNA untuk mengangkut ke dalam kompleks
translasi.
3. Ribosom:
Tempat berlangsungnya translasi.
Komponen penyusun ribosom adalah rRNA dan protein ribosom yang mampu mengenali mRNA, rRNA, dan
sejumlah enzim dan protein yang berperanan dalam proses translasi.
Ribosom tdd 2 subunit, yaitu subunit kecil dan subunit besar. Subunit kecil mengandung sekitar 1/3 massa
ribosom dan 2/3 lainnya massa subunit besar.
Dalam ribosom terdapat satu situs untuk mRNA, dua situs untuk tRNA dan satu situs untuk enzim transferase
peptidil (berperan dalam merangkaikan satu jenis asam amino dengan asam amino yang lain).
Sedangkan situs untuk tRNA yaitu situs A (pintu masuk) dan P (lokasi penerima), terdapat sebagian pada subunit kecil dan sebagian pada subunit besar.
Tahapan Translasi:
Pada awalnya ribosom akan membaca kodon-kodon yang berdampingan mulai dari kodon awal (AUG pertama setelah Shine Dalgarno) sampai ditemukan satu jenis kodon akhir (UAA, UAG, atau UGA).
Tahapan translasi tdd:
(i) Pembentukan aminoasil-tRNA;
(ii) Inisiasi atau pengenalan kodon awal;
(iii) Perpanjangan rantai polipeptida; dan
(iv) Penutupan sintesis polipeptida pada kodon akhir.
Proses ini terjadi dengan bantuan enzim sintetase aminoasil-tRNA, yang berfungsi mengaitkan satu
jenis asam amino pada satu jenis tRNA diujung 3’ (jadi enzim sintetase aminoasil-tRNA berfungsi
membuat kompleks aminoasil-tRNA) dan membawanya ke kompleks translasi.
Kegiatan pembentukan aminoasil-tRNA tdd dua tahapan.
(1) pengaktifan asam amino dengan hidrolisis satu ATP sebagai sumber energi membentuk aminoasil-AMP, (2) Mereaksikan asam amino berenergi tinggi terhadap
tRNA membentuk aminoasil-tRNA.
(i) Pembentukan aminoasil-tRNA
Terjadi dalam tiga tahapan yaitu:
1. Penempelan mRNA pada subunit kecil ribosom dengan cara pengenalan situs Shine Dalgarno oleh rRNA 16S;
2. Penempelan tRNA inisiator pada situs P subunit kecil ribosom; dan
3. Subunit besar ribosom dengan kompleks subunit ribosom-tRNA-mRNA, membentuk
ribosom sempurna yang siap membaca kodon- kodon mRNA
(ii) Inisiasi/pengenalan start kodon
(iii) Perpanjangan rantai polipeptida;
Pada proses ini terlibat sejumlah protein yang disebut dengan faktor perpanjangan (elongation factor), enzim transferase peptidil, serta Guanosin Triphosphat (GTP).
(iv) Penutupan sintesis polipeptida pada kodon akhir (akhir proses translasi):
Pada saat ribosom menemui salah satu dari
kodon akhir UAA, UAG atau UGA, proses
perpanjangan rantai polipeptida/asam amino
akan berakhir, dan kompleks ribosom tRNA-
mRNA-polipeptida dipisahkan.
Rangkaian asam-amino/polipeptida sebelum mencapai bentuk akhir protein mengalami proses pascatranslasi dengan dua tujuan yaitu:
(1) berhubungan dengan proses pelipatan dan kestabilan struktur akhir protein dan
(2) berhubungan dengan proses transport dan pengaktifan enzim dan protein lainnya.
Dalam proses pascatranslasi terjadi dua jenis modifikasi yaitu
(1) modifikasi rantai utama polipeptida (2) modifikasi percabangannya
Pascatranslasi:
MODIFIKASI ASAM AMINO
Terdapat 20 asam amino yang dikenal dalam sandi genetik, yang berasal dari penerjemahan kodon.
Tetapi dari analisis nyata protein terdapat sekitar 100 jenis asam amino selain yang 20 asam amino, yang tidak dikenal oleh ribosom dalam translasi.
Dipercayai ini merupakan modifikasi kovalen dari keduapuluh asam amino setelah proses translasi.
Perubahan sederhana banyak ditemukan pada
berbagai asam amino terutama pada ujung C dan N
seperti asetilasi dan amidasi asam amino.
MODIFIKASI ASAM AMINO
Modifikasi asam amino juga banyak berhubungan dengan regulasi fungsi protein seperti: metilasi,
fosforilasi, nukleotidasi, dan ADP-ribosilasi.
Modifikasi juga terjadi pada pembentukan ikatan silang disulfida antar protein untuk membentuk
protein yang lebih stabil.
Modifikasi dengan pemotongan rantai utama:
beberapa protein hasil translasi terkadang perlu
dipotong dan disambung kembali dengan protein lain
untuk tujuan transportasi protein ke tempat lain.
Merupakan hubungan antara asam
amino/peptida-peptida yang terdapat dalam rangkaian polipeptida dengan runtutan kodon yang terdapat pada mRNA.
Karena rangkaian dibentuk berdasarkan model DNA pada ruas gen, maka sandi genetik juga dapat diartikan sebagai aturan hubungan
antara gen dan protein.
Perhatikan tabel berikut:
Sandi Genetik
Basa Kedua Basa
Pertama U C A G
Basa Ketiga
UUU UCU UAU UGU U
UUC
Phe fenilala
nin
UCC UAC
Tyr
tirosin UGC
Cys
sistien C
UUA UCA UAA UGA Kodon
akhir
A U
UUG
Leu leusin
UCG
Ser serin
UAG
Kodon akhir
UGG Trp triptofan
G
CUU CCU CAU CGU U
CUC CCC CAC
His
histidin CGC C
CUA CCA CAA CGA A
C
CUG
Leu
CCG
Pro prolin
CAG
Gln
glutamin CGG
Arg arginin
G
AUU CCU AAU AGU U
AUC ACC AAC
Asn
aspartat AGC
Ser
serin C AUA
Ile isoleusi
n ACA AAA AGA A
A
AUG Met Kodon
awal
ACG
Thr threonin
AAG
Lys
lisin AGG
Arg
arginin G
GUU GCU GAU GGU U
GUC GCC GAC
Asp
aspartat GGC C
GUA GCA GAA GGA A
G
GUG
Val valin
GCG
Ala alanin
GAG
Glu
glutamat GGG
Gly glisin
G
