TUGAS MATA KULIAH IMUNOLOGI
METODE PENGAMATAN MAKROFAG
PADA TELEOSTEI
Disusun Oleh :
Disusun Oleh :
Okky Hermawan
(091715143006)
S2-BIOTEKNOLOGI PERIKANAN DAN KELAUTAN FAKULTAS PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pada tahun 1882, adalah Elie Mectchnikoff, seorang ilmuwan yang kemudian dianugrahi nobel penghargaan pada tahun 1908 karena atas kontribusinya terhadap ilmu pengetahuan, khususnya terhadap sistem kekebalan seluler. Sejak saat itu, telah muncul makrofag, sebagai salah satu jenis sel penting bagi vertebrata. Makrofag memiliki manfaat yang khusus pada vertebrata. Sebagai sel yang hampir berada pada semua jaringan, makrofag membantu menjaga keadaan ikan selalu dalam homeostatik lingkungan. Makrofag merupakan salah satu sel yang terganggu apabila ada patogen atau partikel asing masuk ke dalam sel. Makrofag mengatur respon imun yang tepat (Hodgkinson et.al., 2015).
Hingga saat ini belum ada metode yang baku untuk memvisualisasikan dengan tepat dan jelas untuk mengamati makrofag pada teleostei. Penelitian ini dikelompokkan pada spesies dari lima famili teleosti, yaitu characidae, Sil-uridae, poecciliidar, anabandidae dan cichlidae. Characidae termasuk dalam ordo characiformes, sil-uridae termasuk dalam ordo Siluriformes dan poecciliidar termasuk dalam ordo Cyprin-odontiformes. Anabandidae dan
cichlidae termasuk dalam ordo perciformes. Masing-masing ordo sudah ada berkisar 15-150 juta tahun yang lalu, sehingga spesies yang digunakan dalam penelitian ini dianggap tidak berkaitan dengan istilah revolusioner (Leknes, 2015).
1.2 Tujuan
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Makrofag
Makrofag adalah sel yang berasal dari sumsum tulang yang berperan dalam sistem pertahanan inang maupun proses fisiologis seperti pemeliharaan jaringan. Makrofag berada pada jaringan, terutama pada jaringan di organ yang berfungsi sebagai penyaringan darah atau cairan getah bening. Organ-organ tersebut antara lain seperti hati, limpa, paru-paru dan kelenjar getah bening. Karakter makrofag yaitu, dapat mengenali, menginternalisasi dan menghancurkan endogen berbahaya dari partikel asing. Makrofag telah terbukti dapat mengikat patogen baik secara langsung, atau mereka dapat mengenalinya sebagai partikel asing setelah makrofag melapisi partikel asing tersebut dengan antibodi atau komplemennya (Elomaa et al., 1998).
Senada dengan Elomaa et. al. (1998), Leknes (2015) menjeleaskan bahwa, pada vertebrata, makrofag banyak terdapat di jaringan getah bening, di bawah lapisan sel epitel dan jaringan yang rusak. Sel makrofag dapat memecah fragmen sel fagositosis, menelan partikel bakteri dan partikel asing yang masuk ke dalam tubuh. Makrofag mengandung vesikula yang dilapisi clathrin. Vesikula tersebut berfungsi sebagai reseptor endositosis dari makromolekul asing.
sel yang terlibat dalam perbaikan jaringan, makrofag memiliki peranan penting, yaitu sebagai pemeliharaan dan penyembuhan kerusakan jaringan (Wynn and Vanella, 2016).
Teleostei memiliki beberapa organ limfoid. Organ limfoid berfungsi untuk tempat hidup sel fagositik. Organ limfoid pada teleostei antara lain timus, ginjal dan limpa. Timus pada teleostei berbentuk kapsul yang mengelilingi jaringan kulit pada limfoid. Pada dasarnya timus dapat dianggap sebagai agregasi dari makrofag yang dibungkus oleh proliferasi sel T. Ginjal pada teleostei adalah organ haematopoesis. Fungsi ginjal hampir sama dengan sumsum tulang pada vertebrata. Sel utama penyusun yang ditemukan pada ginjal adalah makrofag, dan yang menggabungkan sel-sel tersebut adalah melano makrofag (MMCs) dan sel-sel limfoid. Sistem yang ada pada ginjal berfungsi untuk menyaring darah dan melakukan endositosis. Limpa adalah organ limfoid terbesar di teleostei. Pada limpa terdiri dari sistem ellipsoids limpa, MMCs dan jaringan limfoid. Sel yang terdapat di sepanjang dinding limpa secara aktif terlibat di fagositosis makrofag pada antigen (Uribe et, al., 2011).
2.2 Ferritin
Seorang ilmuwan dari Perancis yang bernama Laufberger menemukan ferritin pada tahun 1937. Ferritin yang ia temukan berasal dari isolasi protein dari horse spleen yang mengandung 23 % zat besi. Ferritin terdapat pada sebagian jaringan sebagai protein sitosilik (berhadapan dengan sitoplasma) dan nuclear (berhadapan dengan nukleus). Ferritin berperan penting dalam penyimpanan zat besi intraselular. Ferritin terdiri dari 24- sub unit protein yang tersusun oleh dua tipe sub unit, disebut H dan L. Sub unit H mengacu pada isolasi isoform ferritin dari organ jantung, sedangkan sub unit L mengacu pada isolasi ferritin dari organ hati (Wang et. al., 2010).
III. KERANGKA KONSEPTUAL
Berdasarkan latar belakang masalah, tinjauan pustaka dan metodologi penelitiannya, maka kerangka konspetual penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 1 berikut.
Gambar 1. Kerangka Konseptual Penelitian Vertebrata
Makrofag
Belum ada metode baku untuk pengamatan makrofag
Sel akan dipenuhi endosom yang dikemas ferritin
Pengamatan makrofag akan lebih jelas
Penyuntikan dengan ferritin
Proses endositosis dalam sel endotelial
IV. KERANGKA OPERASIONAL
Hewan yang akan digunakan dalam penelitian ini antara lain ikan buenos aires tetra (hyphessobrycon anistsi), ikan bronze corydoras (corydoras aeneus), ikan platyfish (xiphoporus maculatus), ikan pearl gurami (trichogasterleerii) dan ikan firemouth cichlid (thorichthys meeki). Hewan uji rata-rata berumur 1-3 tahun, dengan berat 2-3 gram dan disimpan dalam akuarium dengan suhu air 21- 25 oC.
Mula-mula, tiga ekor ikan dari tiap spesies disuntikkan secara intraperitoneal (area di sekitar perut) dengan larutan feritin 10 % sebanyak 0,02 – 0,03 ml menggunakan alat suntik tuberkulin 0,5 ml. Setelah 8-24 jam pemberian larutan feritin tersebut, maka selanjutnya hewan uji dimatikan dengan pemberian klorobutanol dengan dosis 0,5 %. Organ-organ seperti insang, usus, pankreas, ginjal dan limpa diambil dan disimpan dalam larutan formaldehide 4 % pada suhu 4 oC selama seminggu.
Setelah dibersihkan dengan larutan buffer, jaringan diobati dengan etanol, kemudian diberi xylene dan kemudian dtanam pada lilin parafin. Ambil bagian yang terkena parafin sebanyak 4 µm kemudian diinkubasi dalam larutan ferrosianida. Cara pembuatan larutan ferrosianida, 2 gram kalias ferroheksasianida dilarutkan dalam larutan asam hidroklorida 0,75 mol/ liter sebanyak 100 ml. Bagian dari sampel tersebut kemudian diberi larutan neutral red sebanyak 1 % kemudian diikuti larutan eosin 1 %. Cairan dari dalam bagian sampel tersebut dihilangkan menggunakan etanol kemudian letakkan sampel di bawah penutup slip di mounting medium (Leknes, 2002 ; Leknes, 2010; Leknes 2015).
Gambar 2. Kerangka Operasional
Disuntik larutan Ferritin
Pengambilan, pembersihan dan pemprosesan organ
Hewan Uji
Kontrol
Penyematan pada parafin
Pengamatan di mikroskop Larutan histologi Mayer’s
Haemalum, Mallory atau
Heidenhain’s Azan Inkubasi dengan ferrosianida
V. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada spesies yang disuntikkan dengan ferritin secara intraperiotoneal dan dibiarkan selama 8-24 jam, beberapa sel berukuran besar yang ada di dalam limpa, usus, pankreas, ginjal dan insang banyak mengandung vesikula. Di dalam vesikula tersebut terdapat presipitasi Prussian Blue (Gambar 3a – 1e), pada jaringan yang diberi ferroheksaksiida untuk pemecahan asam. Vesikula ini berbetuk bulat, lebarnya bervariasi, berwarna biru dan merupakan sel yang paling sering ditemukan di limpa dan ginjal (Gambar 3a dan 1d). Jenis sel ini tidak terlihat pada bagian yang terkena cairan histologis, seperti Mallory, Haenalum Heidenhain’s Azer atau Mayer’s Haemalum.
Sel granul eosinofilik dan neutrofil di berbagai jaringan tidak mengandung presipitasi Prussian Blue (Gambar 3b). Granul dalam eosinofil dan neutrofil masing-masing berwarna merah-kekuningan dan magenta dan berukuran lebih besar. Dalam segi jumlah, jumlahnya lebih banyak eosinofil daripada neutrofil (Gambar 3b).
Pada saat ini, metode yang paling mudah dilaksanakan untuk mengambarkan tentang makrofag pada mamalia adalah dengan menggunakan antibodi yang diberikan pada protein makrofag khusus yaitu membran marker seperti protein CD. Namun, antiodi semacam itu tidak banyak, masih belum banyak dikembangkan dan belum disesuaikan untuk teleostei. Jadi, saat ini histokimia hanya ada untuk beberapa teleostei, seperti ikan rainbow trout (oncorhynchus mykiss).
Gambar 4. Perubahan jaringan ikan Xiphophorus maculatus 15 menit (a), 30 menit (b), 90 menit (c) dan 6 jam (d) setelah disuntik dengan ferritin (Leknes, 2002)
Pada penelitian Leknes (2002) sebelumnya, dijelaskan bahwa pada sel endokardia jantung terlihat presipitasi Prussian Blue dengan diameter 1- 2 µm, 15 menit setelah injeksi ferritin dan diobati dengan larutan ferrosianida (Gambar 2a). Perubahan jaringan pada ikan
xiphophorus maculatus dalam kurun waktu 15 menit (a), 30 menit (b), 90 menit (c) dan 6 jam (d) setelah disuntik dengan ferritin menunjukkan perubahan yang sangat cepat. Jumlah dan ukuran granula meningkat dengan cepat dalam kurun waktu injeksi ferritin hingga hewan uji tersebut dimatikan. Dengan demikian, 28 jam setelah injeksi sel-sel tersebut hampir terisi penuh oleh ferritin yang ditandai dengan presipitasi Prussian Blue.
makrofag tersebut sebelumnya telah disuntik ferritin, maka kemungkinan akan lebih jelas terlihat jika diamati menggunakan mikroskop saat Prussian Blue telah diendapkan dalam granul setelah diberi perlakuan asam ferrohexacyanide. Hal ini dikarenakan makrofag akan terisi oleh ferritin yang berupa granul yang berwarna kuning-coklat.
VI. KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Elomaa, O., M. Sankala, T. Pikkaraient, U. Bergmann, A. Tuuttila, A. R. Ahokas, H. Sariola and K. Tryggvason. 1998. Structure of The Human Macrophage MARCO Receptor and Characterization of Its Bacteria-Binding Region. The Journal of Biological Chemistry, (VIII), 273, Page : 4530- 4538.
Hodgkinson, J. W., L. Grayfer and M. Belosevic. 2015. Biology of Bony Fish Macrophages. Biology, 4, Page : 881- 906.
Leknes, I. L. 2002. Uptake of Foreign Ferritin in Platy Xilophoporus maculatus (Poeciliidae : Teleostei). Disease of Aquatic Organism, 51, Page: 233- 237.
Leknes, I. L. 2010. Histochemical Study On the Intestine Goblet Cells in Cichlid and Poecilid Species (Teleostei). Tissue and Cell, 42, Page : 61- 64.
Leknes I. L. 2015. An Improved Method to Demonstrate Macrophages in Teleostei. Tissue and Cell, 47, Page : 254- 256.
Uribe, C., H. Folch, R. Enriquez and G. Moran. 2011. Innate and Adaptive Immunity In Teleostei Fish : A Review. Veterinarni Medicina, 56, Page : 486- 503.
Wang, W., M. A. Knovich, L. G. Coffman, F. M. Torti and S. V. Torti. 2010. Biochimica et Biophysica Acta, 1800, Page : 760- 769.
