Ekspresi Lanjutan Glycation
End-Produk di Sun terkena
dan Tempat Cutaneous terpajan
selama
Proses Penuaan pada Manusia
pengantar
Canggih akhir glikasi produk (AGEs) yang dikembangkan selama reaksi Maillard dengan glycation dan oksidasi yang berbeda
protein struktural [1] dan memainkan peran penting dalam tergantung usia perubahan [2]. Glikasi melibatkan reaksi non-enzimatik
antara gula dan gugus amina bebas dari Lys dan Arg
asam amino dalam protein. Fructoselysine (FL) adalah produk utama yang dihasilkan dari protein jaringan. Perpanjangan glikasi yang Proses dan akumulasinya tergantung pada konsentrasi glukosa dan relatif konstan dengan usia [3]. Sebuah akumulasi bertahap dari produk glycation lainnya terjadi pada protein jaringan, seperti: N-(Karboksimetil) lysine (CML) dan N- (karboksimetil) hidroksilisin (CML) yang dibentuk oleh pembelahan oksidatif dari FL dan pentosidine. Sejak CML dan CMhL melibatkan glikasi dan bebas oksidasi radikal, produk ini diberi nama '' glycoxidation ''
produk. Satu-satunya produk yang menumpuk dengan usia, CML, CMhl dan pentosidine adalah hasil dari glikasi dan oksidatif
Reaksi [4,5]. Protein glycation digambarkan di kulit tingkat [6] tetapi juga di organ seperti ginjal, pembuluh darah, dan
proses, dan dapat diukur pada epidermis atau kulit tingkat dengan histologis, imunohistokimia, pencitraan atau metode fluorometric [7,8].
Pada tingkat kulit, glycation dikaitkan dengan penuaan Proses dan mempengaruhi sel-sel (sel endotel, fibroblas) dan protein struktural seperti kolagen, elastin, glikoprotein, glikosaminoglikan. The dermal matriks ekstraselular (ECM),
dimodifikasi oleh glikasi, lanjut mempengaruhi pertumbuhan, diferensiasi, motilitas dari fibroblas, respon sitokin, aktivitas enzimatik
(Metalloproteinase) dan pembuluh darah hemostasis [7]. Kedua, reaktif intermediet oksigen dan molekul AGE dapat menginduksi vaskular faktor pertumbuhan endotel (VEGF) ekspresi, tetapi hanya AGEs yang faktor angiogenik [9]. CML merupakan penanda umum
oksidatif stres dan jaringan perubahan melalui perubahan protein, dan memainkan peran penting dalam inflamasi akut dan kronis
Proses [10]. Selain itu, dalam mata pelajaran tua, accumuAGEs memodifikasi sifat mekanik kulit manusia melalui
hilangnya elastisitas dan meningkatkan kaku [7]. ECM dapat diubah oleh ultraviolet (UVA). fibroblast dermal manusia terkena UVA di hadapan AGEs acara penurunan viabilitas sel [11]. UVA menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS) di tingkat kulit yang dapat mempercepat pembentukan CML dan memperkuat lokal fenomena degeneratif yang berhubungan dengan proses penuaan. Selain itu, akumulasi AGEs setelah iradiasi UVA adalah
terlihat di vitro di tengah dermis the-epidermis (DEC) [12]. Studi kami difokuskan pada histologis dan immunohistological
perbandingan daerah terlindungi dari sinar matahari terhadap daerah yang terkena sinar matahari
dari kelompok usia yang berbeda.
Immunopositivity untuk AGE-CML dicetak secara terpisah untuk kedua sel endotel dan fibroblas. Kedua jenis sel yang
dibedakan berdasarkan morfologi mereka. Hanya endotel kapiler sel dinilai. Pengukuran dilakukan pada
lima bidang daya tinggi di bagian perwakilan. Itu persentase baik fibroblas immunostained dan endotel sel dari jumlah fibroblas dan sel endotel di
setiap bagian dinilai baik papiler dan dermis reticular.
Selain itu, intensitas pewarnaan dari CML antibodi monoklonal
dievaluasi menggunakan sistem empat langkah-bijaksana (0, tidak aktif; +, lemah positif; ++, Cukup positif; dan +++, sangat positif) di
Sesuai dengan penelitian sebelumnya [14].
Slide dievaluasi menggunakan mikroskop Olympus BX51
dengan Olympus SP kamera 350 digital (Olympus, Tokyo, Jepang). '' Sel B '' software pencitraan dasar (Olympus, Tokio, Jepang) digunakan untuk menghitung semi-otomatis sel immunoreactive.
Bahan dan metode Pasien dan Studi Desain
Sejumlah 32 subjek direkrut dari Dermatology yang
Klinik di Cluj-Napoca (Rumania). Sesuai dengan usia mereka, pasien dibagi menjadi empat kelompok eksperimen (n = 8):
(Berusia di bawah 20 tahun) kelompok I, kelompok II (20 sampai 40 tahun), kelompok III (40 sampai 60 tahun), dan kelompok IV (berusia lebih dari 60 tahun). Untuk semua subjek yang sampel kulit diambil dari UV non-dilindungi dan UV
daerah yang dilindungi. Semua mata pelajaran milik phototype kulit III. Setelah anestesi lokal menggunakan Xylocaine 1%, biopsi pukulan kulit dengan diameter 4-5 mm diambil dari matahari yang dilindungi (kiri
penyakit.
Analisis statistik
Pengumpulan data di lembar kerja Excel dan diekspor ke
SPSS perangkat lunak statistik (IBM Corporation, New York, Amerika Serikat) untuk analisis. Korelasi dinilai dengan Pearson
koefisien korelasi dan antar-kelompok rata-rata variasi diuji dengan uji ANOVA.
Pernyataan etika
Studi ini disetujui oleh Komite Etik dari
Universitas Kedokteran dan Farmasi '' Iuliu Hatieganu '', Cluj Napoca (Rumania) dan persetujuan tertulis diinformasikan diperoleh
dari masing-masing pasien sebelum mendaftarkan mereka dalam studi. hasil
Histologis dan imunohistokimia Perbandingan
Sun-dilindungi Versus Sun- terkena kulit di Berbagai Usia Grup
Pada kelompok I (, 20 tahun), pemeriksaan mikroskop mengungkapkan
edema dari keratinosit, yang mempengaruhi kedua lapisan basal dan spinosus, edema perivaskular dan sel-sel inflamasi yang tersebar diwakili
oleh sel mononuklear ke dalam dermis dari situs terkena sinar matahari
(Gambar. 1A). Tidak ada lesi di situs yang dilindungi dari kelompok pertama yang diamati. Pada kelompok II (20-40 tahun), histologis analisis dari
daerah yang terpapar sinar matahari menunjukkan edema intra dan antar dari epidermis, edema perivaskular, kehadiran mononuklear minimal
sel-sel inflamasi di daerah perivaskular (Gambar. 1B) dan
dermal fibrosis (Gambar. 1C). Pada tingkat situs terlindungi dari sinar matahari, hanya edema intrasel di tingkat epidermis diidentifikasi. Dalam kelompok III
fibrosis dengan mineralisasi serat kolagen (Gbr. 1D) dan kulit
kehilangan anggota badan terlihat di daerah terkena sinar matahari. Dalam sunprotected
sisi lesi yang moderat dan ditandai dengan
intraseluler dan edema perivaskular, dan mononuklear sel menyusup. Pada kelompok IV (0,60 tahun), ujian histologis dari
situs yang terpapar sinar matahari menunjukkan lesi canggih seperti difus epidermal edema dan beberapa sel apoptosis (Gambar. 1F). Dalam
dermis, elastosis surya, pelebaran pembuluh dan mikrovaskuler membran basement penebalan, fibroblas yang tersebar dan kecil agregat sel limfoid di daerah perivaskular (Gambar. 1G) yang
diamati. Berbeda dengan daerah terkena sinar matahari, pada kulit dilindungi daerah, epidermal atrofi (Gambar. 1H) dan hiposelularitas dari
sel pembuluh darah, limfosit dan fibroblas, terutama di atas dermis, padat seragam dermal fibrosis dan adneksa kerugian yang menyajikan. Skor lesi kulit yang semiquantified dan
diringkas dalam Tabel 1. Pengolahan Spesimen Tissue
Sampel kulit yang tetap segera setelah eksisi di 10%
formalin buffer netral selama 24 jam dan tertanam dalam parafin lilin. Serial bagian dipotong di 4 mm dari setiap blok dan bernoda dengan hematoxylin dan eosin (H & E). Penampilan histologis dari kulit diklasifikasikan sebagai: Grade 0 (G0), kulit normal atau minimal edema perivaskular dan / atau inkontinensia pigmen; Tingkat 1 (G1), penampilan normal matriks dermal tetapi dengan ditandai edema perivaskular, agregasi sel perivaskular mononuklear dan / atau mikrovaskuler basement membran penebalan; kelas 2 (G2), deposisi matriks protein abnormal (fibrosis dengan
elastosis dan / atau kehilangan definisi antara reticular dan dermis papiler); dan kelas 3 (G3), dermal seragam padat fibrosis, epidermal atrofi dan lampiran rugi [13].
MAb Terhadap AGE-CML dan Imunohistokimia
Serial bagian diinkubasi dengan monoklonal mouse utama
(NF-1G) anti karboksimetil Lysine (ab 30.917; Abcam, Cambridge, UK) diencerkan dalam 1% PBS-BSA (bovine serum albumin) di 1/125 pada 4uC semalam. Keesokan harinya, antibodi sekunder (Berlabel streptavidin biotin) diterapkan, diikuti dengan inkubasi dengan diaminobenzidin, LSAB Sistem-HRP kit (Kode K0679, Dako, Denmark). Setelah mencuci dengan air suling, slide
yang counterstained dengan Mayer hematoksilin selama 5 menit. Negatif kontrol untuk masing-masing sampel disiapkan dengan mengganti antibodi primer dengan mouse IgG1 Kontrol Negatif (Kode
X0931, Dako, Denmark).
Analisis Kuantitatif semi Pewarnaan untuk AGE-CML
produk Immunostained diidentifikasi pada semua kelompok pasien.
Di kedua daerah kulit terlindungi dari sinar matahari dan terkena sinar matahari, CML Diskusi
integumen merupakan model penting untuk studi
proses penuaan, seperti yang disampaikan kepada kedua intrinsik dan ekstrinsik faktor. Berbagai mekanisme, seperti akumulasi
mutasi genom, kekurangan hormon, akumulasi beracun
metabolit, kerusakan oksidatif dan glikasi, beroperasi secara bersamaan di tingkat kulit, merangsang struktural, fungsional dan klinis
perubahan.
Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa reseptor glikasi hadir
stres (paparan UV, aterosklerosis, penyakit neurodegenerative, diabetes mellitus) [10].
dermis yang struktur utama dipengaruhi oleh glikasi, yang
menginduksi aktivasi fibroblast, peningkatan molekul matriks yang berbeda (Kolagen, elastin), peningkatan produksi metalloproteinase (MMP
1, 2 dan 9), penebalan membran basement, perubahan alpha 6 dan beta 1 integrin pola di epidermis [16]. Dalam studi ini, kami telah menentukan pola distribusi AGE-CML di biopsi kulit dari situs terbuka dan non-terpapar yang dikumpulkan dari pasien milik usia yang berbeda
kelompok, dalam rangka membangun hubungan dengan histologi yang skor. Kami juga conductd deskripsi histopatologi lengkap
untuk menilai perubahan inflamasi kronis sesuai dengan umur dan protected / daerah yang tidak dilindungi di phototype kulit III individu.
histologi rutin mengungkapkan aspek yang berbeda yang berhubungan dengan interval usia dan paparan sinar UV. Urutan histologis
Perubahan adalah hasil dari kedua perubahan struktural dan fungsional sel dan dampaknya terhadap ECM. aspek histologis yang serupa
digambarkan oleh penulis lain juga [17,18]. fibrosis dan
proses elastosis yang menjadi terlihat lebih awal di daerah photoexposed
dan memperkuat dengan usia dan paparan sinar UV, dapat diidentifikasi bahkan oleh menggunakan ultrasound frekuensi tinggi [8].
Data histologis kami sesuai dengan literatur, menunjukkan yang penting struktural, biokimia, molekul, arsitektur
sintesis protein dan menghambat proses glycation [8,12]. Kami
Temuan mengkonfirmasi bahwa CML-seperti bahan immunoreactive adalah hadir di kedua fibroblas dan sel-sel endotel dari dermis,
dan meningkat pada pasien yang lebih tua dan di sisi terkena sinar matahari. Laporan serupa menunjukkan bahwa AGEs mengikat fibroblas sel
membran reseptor dan berinteraksi dengan vimentin intraseluler
filamen, dengan DNA, berkontribusi terhadap perkembangan penuaan kulit [19]. CML merupakan biomarker stres oksidatif, dan tidak ada
dalam jaringan individu muda. CML adalah terlibat dalam penuaan proses, yang terakumulasi dalam kolagen kulit, serat elastis,
glycosaminoglycans dari orang normal [20], tetapi interaksi AGEs dengan fibroblas dermal, terutama dalam konteks kulit penuaan, tetap tidak jelas. reseptor AGE (RAGE) juga menyatakan
di sel endotel mikrovaskuler [21]. Sebuah laporan baru-baru ini mengungkapkan ekspresi RAGE meningkat pada kulit yang terpapar sinar matahari dan
sel RAGE-positif terutama diwakili oleh keratinosit Korelasi antara histologi Skor Kulit dan
AGE-CML Ekspresi
Immunopositivity untuk AGE-CML dicetak secara terpisah untuk kedua sel endotel dan fibroblas. Pengukuran dilakukan
pada lima bidang daya tinggi di bagian perwakilan. Itu persentase fibroblas immunostained dan endotel sel
disajikan pada Tabel 3. Tidak ada yang signifikan secara statistik korelasi positif antara skor kulit histologis dan
AGE - CML ekspresi baik dalam fibroblas atau sel endotel (Tabel 3).
perbedaan statistik antara ekspresi AGE-CML di kedua fibroblas dan sel endotel (p, 0,05) antara dilindungi dan
sampel non-dilindungi. Daerah yang terpapar sinar matahari memiliki lebih dari skor AGE-CML 10% lebih tinggi dari kawasan lindung. Itu
persentase ekspresi AGE-CML dalam sel endotel dari
situs yang terpapar sinar matahari itu 45,92 dibandingkan dengan 40,91 dari endotel Sel-sel dari kawasan lindung. Selain itu, rata-rata persentase
nilai-nilai dari ekspresi AGE-CML dalam fibroblas dari sunexposed daerah itu 44,35 dibandingkan dengan 39,16 dari fibroblas dari sisi dilindungi.
Probabilitas dari uji ANOVA untuk penilaian yang
variasi antara kelompok itu untuk semua variabel kurang dari 0,0001 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik antara kelompok. Berdasarkan hasil ini, analisis korelasi antara usia
pasien dan skor AGE-CML dilakukan. grafis
representasi dari hasil kami ditunjukkan pada Gambar 4 (A-D). dari lapisan basal, fibroblas kulit, dendrocytes dermal, endotel sel dan limfosit [15].
Studi kami menunjukkan distribusi CML di tingkat epidermis, terutama di lapisan germinative, menunjukkan dampak
sitokin pada mekanisme glycation, dan secara implisit peran UV dalam modulasi dan akumulasi produk glyco-oksidasi
di tingkat dermal. Keratinosit adalah sel kulit yang sangat aktif yang rilis VEGF (faktor pertumbuhan endotel vaskular) dan FGF
(Faktor pertumbuhan fibroblast) yang mengarah ke endotel aktivasi sel dan ditingkatkan angiogenesis, akhirnya mengarah ke penyembuhan luka Tanggapan [22]. sel endotel juga mengungkapkan MMP yang mendegradasi komponen ECM sehingga merekrut beredar makrofag dan
menurunkan ECM [23].
distribusi CML dan ekspresi dimodifikasi di mikrovaskuler
sel endotel, tergantung pada usia dan paparan sinar UV [21]. Dalam Penelitian ini matahari terkena biopsi kulit dari pasien yang lebih tua mengungkapkan respon inflamasi meningkat dengan mononuklear
sel dibandingkan dengan daerah terlindungi dari sinar matahari dan pasien yang lebih muda, tapi
bukti ini tidak berkorelasi dengan ekspresi CML. Menurut data kami, pada tingkat kulit glikasi adalah
terlibat dalam proses penuaan dan mempengaruhi secara bersamaan, secara langsung dan secara tidak langsung, sel kunci, sel-sel sebagian besar endotel yang lebih
sensitif terhadap sinar UV dibandingkan dengan fibroblas (lihat Gambar. 4 A-B). Tidak statistik korelasi yang signifikan diamati antara
skor histologi dan ekspresi imunohistokimia
CML, yang membuktikan bahwa penuaan kulit, selain dari oksidasi glikol produk, adalah hasil dari banyak mekanisme yang halus,
beberapa di antaranya masih tetap tidak jelas. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengidentifikasi mekanisme yang terlibat dalam penuaan kulit dan pengaruhnya terhadap
struktur kulit, mekanik, dan fungsi. Studi kami membuka baru perspektif pendekatan terapi anti-penuaan.
Kami menyimpulkan bahwa dalam integumen sehat, akumulasi produk glikasi akhir meningkat dengan usia dan diperkuat oleh paparan ultraviolet. Proses glikasi mengganggu
fibroblas dan endotelium pembuluh darah, perubahan sebagian besar merangsang di tingkat ECM. Tidak ada korelasi yang signifikan statistik diamati
antara skor histologi dan ekspresi imunohistokimia CML. Disetujui (FDA) anti penuaan pilihan terapi
pada perbedaan AGE-CML antara kelompok usia dan dilindungi
